大豆耐低磷相關基因GmACP2、編碼蛋白及其應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體公開了一種大豆耐低磷相關基因GmACP2、編碼蛋白及其應用。該基因的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。GmACP2基因的表達量在耐低磷材料中顯著高于低磷敏感材料；利用可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明GmACP2基因導入大豆毛狀根中，能顯著提高大豆磷含量，干物質積累及磷吸收與利用效率。本發(fā)明公開的基因可作為目的基因導入植物，提高轉基因植物磷體內代謝平衡的能力，對培育磷高效利用大豆品種有重要意義。
【專利說明】
大S耐低鱗相關基因 GmAGP2、編碼蛋白及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種耐低磷相關基因GmACP2、編碼蛋白 及其應用。
【背景技術】
[0002] 大豆是人類食用油和植物蛋白的主要來源，然而大豆也是一種需磷量較大的作 物，其籽粒含磷量遠遠高于水稻、小麥和玉米。大豆缺磷以后，不僅影響植株的生長發(fā)育，增 加花莢脫落，還會影響根瘤的形成從而降低固氮效率，并最終影響其產(chǎn)量和品質。因此，土 壤磷素缺乏成為了限制大豆生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。植物為了適應低磷環(huán)境，已在進化過程 中形成了一系列應對低磷脅迫的適應性機制，以提高磷的吸收和利用效率，包括改變根構 型，增加了有機酸分泌，形成菌根共生體系以及提高酸性磷酸酶的活性等。在低磷脅迫條件 下，酸性磷酸酶的分泌可以水解土壤中含量豐富的有機磷，釋放更多的無機磷供植物吸收 利用，使植物適應缺磷環(huán)境。已有多項研究表明，缺磷能夠顯著增加水稻、小麥、大豆、擬南 芥、番茄和玉米等植物的酸性磷酸酶的活性。酸性磷酸酶(簡稱ACP)是一種在動、植物和微 生物細胞中廣泛存在，調控磷代謝的重要酶類。因而對于酸性磷酸酶的研究對大豆抵抗磷 脅迫能力以及廣量和品質的提尚具有重要意義。
[0003] 近年來隨著分子生物學的發(fā)展，酸性磷酸酶酶學性質、相關基因的克隆及其在植 物磷效率中的生物學功能等都取得了許多研究成果。在擬南芥中，就已有29個紫色酸性磷 酸酶基因被克隆，其中有多個基因的功能與磷營養(yǎng)相關，并且涉及了磷代謝調控網(wǎng)絡的各 個層面。在大豆中，Zhang等(2014)首次通過正向遺傳學方法在大豆中圖位克隆了一個耐低 磷關鍵基因，GmACPl，該基因也編碼一個酸性磷酸酶，在大豆毛狀根中超量表達該基因不僅 能夠顯著提高大豆磷利用效率，還可以增加大豆植株干物重。然而到目前為止，在大豆中， ACP基因家族的其它成員拷貝還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 1、發(fā)明要解決的技術問題
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆耐低磷相關基因GmACP2。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供該基因所編碼的蛋白。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述基因的重組質粒。
[0008] 本發(fā)明的又一個目的是提供上述基因或重組質粒在大豆抵抗磷脅迫作用中及培 育磷高效大豆品種中的應用。
[0009] 2、技術方案
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：
[0011] 一種大豆耐低磷相關基因GmACP2,其核苷酸序列如序列表Seq ID N0.1所示。
[0012]本發(fā)明還提供了一種大豆耐低磷相關基因GmACP2所編碼的蛋白，其氨基酸序列如 序列表Seq ID N0.2所示。
[0013] 進一步地，本發(fā)明提供了一種含有該大豆耐低磷相關基因GmACP2的重組質粒，是 將大豆耐低磷相關基因GmACP2插入pFGC5941植物過量表達載體中而成的。
[0014] 進一步地，本發(fā)明提供了擴增所述大豆耐低磷相關基因GmACP2全長或其任意片段 的引物對，該引物對的上游引物如序列表Seq ID No. 3所示，下游引物如序列表Seq ID No. 4所示。
[0015] 進一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆耐低磷相關基因GmACP2或所述重組質粒在大 豆抵抗磷脅迫作用中的應用。
[0016] 進一步地，本發(fā)明提供了所述的大豆耐低磷相關基因GmACP2或所述重組質粒在培 育磷高效大豆品種中的應用。
[0017] 3、有益效果
[0018] ⑴本發(fā)明所提供的大豆耐低磷相關基因GmACP2在大豆根中表達量最高，且在低磷 脅迫條件下磷高效大豆材料中表達量顯著上調，而在低磷敏感材料中表達量下調。利用發(fā) 根農(nóng)桿菌介導的轉化系統(tǒng)將攜帶有本發(fā)明GmACP2的植物表達載體轉化大豆毛狀根，與對照 相比過表達GmACP2的大豆毛狀根的根毛的數(shù)量增加，根系磷酸酶的活性及磷吸收量也顯著 增加，說明GmACP2基因可能參與調控大豆根系對低磷脅迫的適應性。
[0019] ⑵本發(fā)明所提供的大豆耐低磷相關基因GmACP2,位于第8號染色體上，讀碼框長度 為789bp;其編碼的蛋白262;利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā) 明GmACP2基因導入植物細胞，可獲得耐低磷脅迫能力顯著提高的轉基因植株；
[0020] ⑶使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一 種增強啟動子或誘導型啟動子;為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對 所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性 的抗生素標記物(慶大霉素、卡那霉素等）；
[0021] ⑷攜帶有本發(fā)明GmSPXl的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直 接DNA轉化、微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的 植物組織培育成植株;被轉化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物；
[0022] (5)本發(fā)明的基因對大豆體內磷元素代謝有積極的調控作用，特別的在培育高磷吸 收大豆品種育種中具有重要意義。
【附圖說明】
[0023] 圖1:不同磷效率基因型間GmACP2基因表達量差異圖；
[0024] 注:縱坐標為GmACP2基因在低磷(-P)和高磷(+P，contro 1)處理7天后表達量的比 值。紅框為耐低磷材料(Nannong94-156，B20和Kefengl)，藍框為磷敏感材料(Bogao，B18和 Suxiel)〇
[0025] 圖2:pFGC5941的質粒圖譜；
[0026] 圖3:含有GmACP2的植物表達載體的部分結構示意圖；
[0027]圖4:轉化大豆毛狀根PCR鑒定電泳圖；
[0028] 注:M，Marker; CK，以轉入空載pFGC5941的大豆毛狀根DNA為模板；1-7，以各個轉基 因植株DNA為模板。
[0029]圖5:轉基因根系酸性磷酸酶活性檢測圖；
[0030] 注:轉基因植株與對照在加入PNPP的營養(yǎng)液中處理48小時后根系的原位染色，溶 液呈黃色表示根系分泌的酸性磷酸酶含量高。
[0031] 圖6:缺磷條件下過表達GmACP2的大豆毛狀根的APA活性(A)，干重(B)，磷含量(C)， 磷的利用效率(D)和根毛密度(E)圖。
[0032]注：*，P < 0 ? 05;林，P < 0 ? 01; CK，轉入空載pFGC5941 的大豆毛狀根；J-3和J-4，轉 GmACP2的大豆毛狀根。
【具體實施方式】
[0033] 在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常 理解的含義。
[0034] 下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā) 明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同引物，均以首次標明的內容相同。
[0036] 下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 實施例1:大豆耐低磷相關基因 GmACP2的克隆
[0038] (1)設計引物，提取RNA，反轉cDNA:
[0039]用植物總RNA提取試劑盒(DP432,天根)提取大豆材料南農(nóng)94-156(耐低磷大豆種 質）葉片總RNA，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成參照TaKaRa Primer Script?RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明操作。設計引物如下：
[0040] Seq ID N0.3:GmACP2-F 5'-ATGTCTGGAATTGTGGTT-3'；
[0041 ] Seq ID NO?4:GmACP2-R 5 '-TTAAGCAGAGACAGACAG-3 '。
[0042] (2)PCR擴增，具體步驟如下：
[0043] 步驟一：按照以下組份順序配制PCR反應液(50yl體系）：10XPCR Buffer(25yl)， ddH20(9yl)，dNTP(10yl)，GmACP2-F(1?5yl)，GmACP2-R(1?5yl)，cDNA(2yl)，K0D FX酶（ly 1);
[0044] 步驟二：反應在BIO-RAD PTC-200型PCR儀上進行，設定反應程序為：94°C變性 2min;再98°C 10sec，53°C 30sec，68°C 2min，共33個循環(huán)；然后68°C延伸7min;4°C保存； [0045] 步驟三:PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)連接PMD19-T載體(TaKaRa)、轉化大腸桿菌DH5a、藍白斑 篩選、搖菌、測序，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0046]實施例2:大豆耐低磷相關基因 GmACP2的熒光定量分析
[0047] (1)大豆耐低磷品種南農(nóng)94-156和B20及大豆低磷脅迫敏感材料波高和B18在水培 生長條件下，進行正常生長與低磷脅迫兩種處理，正常條件為二分之一Hogland營養(yǎng)液，脅 迫處理為二分之一的Hogland營養(yǎng)液(其中用KC1代替KH2P〇4)，7天后采集根與葉樣品液氮速 凍并于_8〇°C保存;總RNA的提取及cDNA的反轉同實施例1;
[0048] (2)設計引物
[0049 ]針對GmACP2基因序列設計熒光定量特異性引物為：
[0050] Seq ID N0 ? 5:上游引物5 ' -GGTGGACATCTATCAAAAACAAATACAT-3 ' ；
[0051 ] Seq ID 從).6:下游引物5，-111^丁0：1'1'11^^^^^^厶11'0：11^1'-3，。
[0052] 內參基因選用Tubulin，引物序列如下：
[0053] Seq ID N0? 7:上游引物5' -GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3' ；
[0054] Seq ID N0.8:下游引物5 ' -CACTTACGCATCACATAGCA-3 '。
[0055] (3)熒光定量PCR擴增，具體步驟如下：
[0056] 步驟一：按照以下組份順序配制PCR反應體系（20iU體系）：引物（各0.5iU)、H20 (RNase free)(8yl)、PCR SYBR MIXWPKJOlJOYOBOKlOyl)和cDNA(lyl);
[0057] 步驟二：按以下程序使用ABI 7500 system型熒光定量PCR儀進行PCR反應:95°C 5min;然后再95°C 15sec，60°C 30sec共40個循環(huán)；
[0058]步驟三:運用SDS軟件(V2.3)分析數(shù)據(jù)，結果采用2-AAGt(Livak，2001)方法進行基 因表達相對定量。如圖1所示，在低磷脅迫條件下，GmACP2在磷高效材料(如NN94-156，B20) 中表達量顯著升高8-18倍，而在低磷敏感材料(如Bogao，B18)中，表達量顯著下調3-23倍。 [0059 ]實施例3:轉GmACP2基因的大豆毛狀根的獲得
[0060] (1)選擇Xhol和Xbal酶切位點，將實施例1中克隆的GmACP2全長序列正向插入 PFGC5941 (如圖2所示）的CaMV35S啟動子后，構建成重組植物表達載體pFGC5941-GmACP2 (如 圖3所示）。
[0061 ] (2)用凍融法分別將pFGC5941-GmACP2和空載質粒pFGC5941轉入發(fā)根農(nóng)桿菌菌株 K599(BioVector NTCC Inc.)中，pFGC5941-GmACP2和pFGC5941 分別通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599介 導的遺傳轉化系統(tǒng)轉化大豆，具體方法如下：
[0062] 步驟一：育苗:選擇均勻一致的大豆種子，用氯氣滅菌15小時，置于25°C光照培養(yǎng) 箱12h/d光照條件下蛭石育苗；
[0063]步驟二:毛狀根的誘導:將-80 °C保藏的菌種在YEP固體培養(yǎng)基+卡那霉素(50mg/L) 上劃線，28 °C下過夜培養(yǎng)后挑取單菌落于YEP+卡那霉素液體培養(yǎng)基中，220r/min、28 °C下過 夜振蕩培養(yǎng)，選取菌落生長旺盛的菌液用于侵染試驗;為了避免種子質量和播種深度的影 響，選擇長勢一致、5d苗齡的大豆幼苗，每個大豆基因型60株，用注射器針頭將發(fā)根農(nóng)桿菌 菌液注射大豆下胚軸3次;接種完畢后，置于含有通風孔和透明罩的育苗盆內保濕，28°C恒 溫、14h/d光照條件下進行毛狀根的誘導；12天后，接種部位長出毛狀根;去掉初生根，將形 成的大豆"復合體"植株移入1/4中Hogland營養(yǎng)液中生長5天；
[0064]步驟三:低磷脅迫處理:在1/4中Hogland營養(yǎng)液中生長5天后，將轉基因苗與轉空 載的苗移入低磷處理（1/4中Hogland營養(yǎng)液，其中用0.25mM肌醇六硫酸代替KH2P〇4,25°C， 12h/d光照）；每三天換一次營養(yǎng)液;低磷脅迫7天后，測定酶活性，磷含量等相關表型；
[0065] 步驟四：陽性鑒定：以35S啟動子+GmACP2基因為目的序列設計特異引物通過PCR鑒 定陽性轉化株系，鑒定結果如圖4所示，引物序列如下：
[0066] Seq ID N0 ? 9:上游引物5，-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3 ' ；
[0067] Seq ID 從).10:下游引物5，-〇八(：11^〇6〇八11^〇八1八6〇八-3'。
[0068] 實施例4:GmACP2基因的功能驗證
[0069] (1)在上述低磷脅迫處理5天時，將6株轉基因株系及6株對照(轉空載植株)移入加 有對硝基苯磷酸二鈉(PNPP，終濃度為0.25mmol/L)的1/4的Hogland營養(yǎng)液(0.25mM肌醇六 硫酸代替KH 2P〇4);根避光處理48h，25°C，12h/d光照；隨后加入500yLlmol/L的NaOH溶液終止 反應，比較處理和對照營養(yǎng)液顏色的深淺變化及測定根系酶活性；如圖5所示，與對照相比 培養(yǎng)轉基因根系的溶液的指示黃色更深，結果表明過表達GmACP2的大豆毛狀根能夠分泌更 多的酸性磷酸酶。
[0070] (2)取新鮮幼葉或根尖約0.2g放入冰凍研缽內，加入液氮研磨至粉末，加入1.5ml 的0. lmol/L緩沖液（lmol/L冰醋酸溶液28.82ml和0.3mol/L醋酸鈉溶液273.3ml，PH值4.0) 繼續(xù)研磨混勻，倒2.0ml離心管，在冰凍離心機4°C、12000r/min離心30min;取20yl上清液， 加入480yl酶反應液(0. lmol/L緩沖液和0.25mmol/L硝基苯磷酸二鈉溶液p-NPP)，30°C黑暗 反應30min，加入0.2ml的2mol/LNa0H溶液終止酶促反應;吸取100yl加入酶標板檢測孔內， 設空白對照，P-NP標準濃度(0.005，0.01，0.015，0.02，0.025wnol/L)，在405nm波長下由酶 標儀測定吸光值，從而檢測APA活;如圖6A所示，結果表明過表達GmACP2的大豆毛狀根的APA 活性顯著增加。
[0071] (3)把植株分為地上部分和地下部分，放在烘箱內在105°C下殺青一小時，之后在 60 °C下烘干到恒重，再用電子天平稱量干重;如圖6B所示，結果表明過表達GmACP2的大豆毛 狀根干重顯著增加。
[0072] 利用AA3型連續(xù)流動分析儀測定磷含量，具體方法如下：
[0073] 1、消煮(利用_4-驗）
[0074]稱取烘干、磨細，過0.50mm篩的植物樣品0.2g，送入50mL消煮管中，先滴入lml蒸餾 水濕潤樣品，再加5mL濃硫酸，搖勻(放置過夜），瓶口蓋一彎頸小漏斗;次日，在電爐上初始 溫度250度左右先緩緩加熱，待濃硫酸分解冒大量白煙時升高溫度至330度再到380度;消煮 至溶液呈均勻的棕黑色時，取下消煮管，稍冷后提起彎頸漏斗，滴加30%雙氧水10數(shù)滴，并 不斷搖動消煮管，至溶液呈無色或清亮后，再加熱5_10min(以趕盡剩余的H 2〇2);取下消煮管 冷卻，用少量水沖洗漏斗，洗液流入消煮管中；將消煮液無損地洗入l〇〇ml容量瓶中，用水定 容，搖勻;轉移到小塑料管中，供氮、磷、鉀測定;每批消煮時，均進行空白試驗，以校正試劑 和方法的誤差。
[0075] 2、AA3型連續(xù)流動分析儀測定磷含量
[0076] 試劑配制:①鉬酸銨溶液:溶解6.2g鉬酸銨、0.17g酒石酸鉀銻，溶解稀釋至1L，儲 存于棕色瓶中；②鹽溶液:溶解5g氯化鈉于800mL去離子水中.定容至1000mL(去掉儀器所附 方法中的硫酸）；③系統(tǒng)潤洗液(〇.2%SDS):溶解2g SDS于1 OOOrnL去離子水中（去掉儀器所 附方法中的硫酸）；④抗壞血酸溶液:溶解lg抗壞血酸(儀器所附方法中用量為1.5g)于去離 子水中并稀釋至l〇〇mL(當天配制），置于棕色瓶中；⑤清洗液:5%硫酸。
[0077] 測定參數(shù)設置:根據(jù)儀器軟件說明書進行操作，選擇防酸進樣針和高濃度進樣管， 設置進樣速率50個樣/h;進樣與清洗比為2.6:1;測氮和測磷濾光片波長均為660nm，進樣時 間45s，平滑度均設零，磷主峰高度設為85%，通道均設置基線和漂移校正，自動基線參比為 5%、樣品初始峰延遲時間5min;燈強度均設置為大于1000mV。標準曲線制作：用磷酸二氫鉀 配制濃度1 〇〇〇mg. L-1的P標準貯液，測定時配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1. Omg. L-1濃度標準P溶 液，按照上述條件進行測定，儀器測定峰高與標準溶液P濃度之間進行線性回歸，制作校準 曲線，相關系數(shù)r = 0.9999。
[0078]如圖6C所示，測定結果表明過表達GmACP2的大豆毛狀根的磷含量顯著增加。
[0079]磷利用效率等于1/組織磷濃度，表示每毫克磷產(chǎn)生干物質的量;如圖6D所示，結果 表明過表達GmACP2的大豆毛狀根的磷利用效率顯著提高;除此之外，如圖6E所示，低磷脅迫 處理7天之后，過表達GmACP2的大豆毛狀根的根毛密度顯著增加，結合顯著增加的地上部分 干物質的量與吸磷量，說明根毛密度受到磷有效性的影響，過表達GmACP2能顯著誘導根毛 的增加和伸長。
【主權項】
1. 一種大豆耐低磷相關基因 GmACP2,其特征在于，所述耐低磷相關基因 GmACP2的核苷 酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。2. -種權利要求1所述的耐低磷相關基因 GmACP2所編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白 的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.2所示。3. -種含有權利要求1所述的耐低磷相關基因 GmACP2的重組質粒，其特征在于，所述重 組質粒是將權利要求1所述的耐低磷相關基因 GmACP2插入pFGC5941植物過量表達載體中而 成的。4. 擴增權利要求1所述耐低磷相關基因 GmACP2全長或其任意片段的引物對，其特征在 于，所述引物對的上游引物如序列表Seq ID No.3所示，下游引物如序列表Seq ID No.4所 不。5. 權利要求1所述耐低磷相關基因 GmACP2或權利要求3所述重組質粒在大豆抵抗磷脅 迫作用中的應用。6. 權利要求1所述耐低磷相關基因 GmACP2或權利要求3所述重組質粒在培育磷高效大 ?品種中的應用。
【文檔編號】C12N15/55GK105821060SQ201610294032
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】張丹, 褚姍姍
【申請人】河南農(nóng)業(yè)大學