水稻黃綠葉性狀基因ygl8及其在水稻育種中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻黃綠葉性狀基因<i>ygl8</i>及其在水稻育種中的用途，屬于遺傳育種領(lǐng)域。該水稻黃綠葉性狀基因<i>ygl8</i>的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，其所對(duì)應(yīng)的野生型基因<i>YGL8</i>的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示；野生型基因<i>YGL8</i>所編碼蛋白質(zhì)為葉綠素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶——鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。本發(fā)明中提供的<i>ygl8</i>基因，在水稻育種的雜交F1代雜種純度鑒定和不育系自交繁殖保種純度鑒定工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
水稻黃綠葉性狀基因 ygl8及其在水稻育種中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及水稻黃綠葉性狀基因 ygl8(yellow green leaf 8)及其在水稻育種中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物之一。雜交水稻的出現(xiàn)，大幅度 地提高了水稻的產(chǎn)量，為緩解中國(guó)乃至世界的糧食危機(jī)做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，在兩系雜交 水稻的制種過程中，不育系的育性會(huì)受到光溫的影響(廖伏明，袁隆平，2003)。當(dāng)氣候異常 時(shí)，不育系會(huì)因自交結(jié)實(shí)而影響雜種F1的純度，可能給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。缺乏理想 的鑒定雜種種子純度的技術(shù)方法一直是制約我國(guó)種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原因之一。在解決雜交水 稻育種的這一突出問題時(shí)，葉色突變體的應(yīng)用價(jià)值得到了體現(xiàn)。將苗期葉色標(biāo)記與不育系 相結(jié)合，根據(jù)雜交F1代植株的葉色表型，可以很方便地肉眼識(shí)別出不育系自交種子，從而鑒 定雜種純度(Su et al.，2012)。同理，帶葉色標(biāo)記的不育系自我繁殖過程中，也可方便地剔 除雜種。早些年，科學(xué)家們已選育出了一些具有黃化(或白化)葉色標(biāo)記的不育系，像M2S(董 鳳高等，1995)、中紫S(曹立勇等，1999)、全龍A(舒慶堯等，2001)、白豐A(沈圣泉等，2005) 等，并用它們培育出了很多雜交品種。
[0003] 廣占63S是N422S和矮廣占63雜交后再自交選育而來的光溫敏感型核不育系，在雜 交育種應(yīng)用研究中具有重要的作用。很多水稻雜交品種來源于廣占63S，像豐兩優(yōu)1號(hào)(廣占 63SX9311)，廣占63S*R2469(廣占63SXR2469)，廣兩優(yōu) 1128(廣占63SXHR1128)，廣兩優(yōu) 7203(廣占63SX中恢7203)，兩優(yōu)18(廣占63SX豐恢18)等等。作為源于廣占63S的自發(fā)黃綠 葉突變體，本發(fā)明的y g18基因在雜交育種的不育系純度和?:雜種純度鑒定工作中具有廣闊 的應(yīng)用前景。
[0004] 參考文獻(xiàn)：
[0005] 曹立勇，錢前，朱旭東，曾大力，閡紹楷，熊振民.紫葉標(biāo)記秈型光-溫敏核不育系中 紫S的選育及其配組的雜種優(yōu)勢(shì).作物學(xué)報(bào)，1999，25( 1): 44-49.
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種水稻黃綠葉性狀基因ygl8。本發(fā)明的目的還在于提供 ygl8基因在水稻育種中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0013] 一種水稻黃綠葉性狀基因ygl8,其核苷酸序列如Seq ID NO. 1所示。
[0014] 所述的水稻黃綠葉性狀基因ygl8對(duì)應(yīng)的野生型YGL8基因的核苷酸如Seq ID NO.2 所示。YGL8基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如Seq ID NO.3所示。YGL8基因所在的基因組核 苷酸序列如Seq ID N0.4所示，Seq ID N0.4所示序列包含啟動(dòng)子序列、基因區(qū)序列和終止 子序列，共5146bp。
[0015]本發(fā)明的水稻黃綠葉性狀基因ygl8是從一個(gè)來源于光溫敏感型核不育系廣占63S 的黃綠葉突變體yg18中發(fā)現(xiàn)的。從苗期開始，突變體ygl8的葉片呈現(xiàn)黃綠葉表型。在海南陵 水種植時(shí)，突變體ygl8生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)與野生型相近，但在湖北武漢種植時(shí)，突變體ygl8發(fā)育 嚴(yán)重遲緩。本發(fā)明采用圖位克隆的方法克隆了黃綠葉突變體ygl8的性狀控制基因ygl8。 ygl8基因是由L0C_0s06g04150基因的點(diǎn)突變而來的，即Seq ID勵(lì).2的第673位核苷酸(：，突 變成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T。生物信息學(xué)分析顯示YGL8編碼葉綠素合成途徑中 的一個(gè)關(guān)鍵酶--鎂原卟啉K甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0016] 本發(fā)明的水稻黃綠葉性狀基因ygl8可用于水稻育種中。ygl8基因在基因組中處于 雜合狀態(tài)時(shí)植株呈正常綠葉表型，而在基因組中處于純合狀態(tài)時(shí)植株呈黃綠葉表型。因此， 在雜交育種過程中，以含純合ygl8基因的材料為母本，其它材料為父本，雜交Fi代種子的植 株為綠葉表型，其中混雜的少量的自交種的植株為黃綠葉表型，使得雜交Fi代雜種純度鑒 定工作直觀而方便；用含有純合ygl8基因的不育系自交繁殖保種時(shí)，其后代種子的植株為 黃綠葉表型，而花粉污染產(chǎn)生的種子，其植株為綠葉表型，使不育系的保種純度鑒定工作也 變得簡(jiǎn)單方便。因此，ygl8基因可用于雜交育種過程中雜交Fi代雜種純度鑒定和不育系自 交繁殖保種純度鑒定。
[0017] 本發(fā)明的水稻黃綠葉性狀基因ygl8,為雜交育種提供了新的材料，其在雜交育種 中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為野生型WT和突變體ygl8植株的苗期表型圖。
[0019] 圖2為WT和突變體ygl8在湖北武漢和海南陵水種植時(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育表型圖。(A)孕穗 期，（B)成熟期。
[0020]圖3為ygl8基因的定位結(jié)果圖。（A)初步定位，利用ygl8/日本晴的F2群體的92株突 變株，將YGL8定位在第6號(hào)染色體的分子標(biāo)記chr6mm0129和chr6mm0287之間；（B)精細(xì)定位， 利用ygl8/93lU^F 2群體的910株突變株，將YGL8定位在分子標(biāo)記Y37和Y11之間；綜合初步 定位和精細(xì)定位，將YGL8基因限定在chr6mm0129和Y11之間343kb的區(qū)域。（C)定位區(qū)間內(nèi)經(jīng) 測(cè)序唯一的有突變的基因，命名為YGL8，C到T的點(diǎn)突變導(dǎo)致所編碼的氨基酸由亮氨酸變?yōu)?苯丙氨酸。
[0021] 圖4為功能互補(bǔ)載體的構(gòu)建示意圖?；パa(bǔ)載體PYGL8C為在轉(zhuǎn)基因雙元載體pBWA(V) HII上構(gòu)建入一個(gè)5146bp的包含YGL8基因的啟動(dòng)子(Pro,2732bp)、基因（YGL8,981bp)和終 止子(Ter，143 3bp)的基因組片段;pEmvC為pBWA (V) HII空載體，作為對(duì)照。
[0022] 圖5為對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié)果及測(cè)序結(jié)果圖。（A)轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定結(jié) 果，轉(zhuǎn)入空載體pEmvC和互補(bǔ)載體pYGL8C的植株均能擴(kuò)增出潮霉素篩選基因HYG，表明轉(zhuǎn)基 因植株構(gòu)建成功。(B)空載體pEmvC和互補(bǔ)載體pYGL8C的轉(zhuǎn)基因植株在ygl8基因突變位點(diǎn)的 喊基測(cè)序。
[0023] 圖6為野生型WT、突變體ygl8和轉(zhuǎn)基因植株的表型、葉綠素含量測(cè)定結(jié)果圖。(A)植 株表型，轉(zhuǎn)入互補(bǔ)載體PYGL8C的植株表型得到恢復(fù)。（B)葉綠素含量測(cè)定，數(shù)據(jù)為平均值土 標(biāo)準(zhǔn)差，n = 3。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，下面提供了水稻黃綠葉基因 ygl8的實(shí)施實(shí)例。 這些實(shí)施實(shí)例僅僅是說明性的、而不是限制本發(fā)明的范圍。其中所用的原料均有市售。 [0025]實(shí)施例1水稻黃綠葉基因 ygl8的定位克隆和YGL8基因的功能互補(bǔ)
[0026] 1、水稻材料：
[0027] 水稻黃綠葉突變體yg 18,保存于湖北省農(nóng)作物種質(zhì)資源中期庫(kù)（保存號(hào) HB2016001，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所）；其野生型品種為秈稻品種"廣占63S"。 [0028]水稻黃綠葉突變體ygl8是廣占63S的自發(fā)突變產(chǎn)生的，突變表型為黃綠葉（圖1)。 另外，ygl8在湖北武漢生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重遲緩甚至停滯，但在海南陵水的生長(zhǎng)發(fā)育與野生型相 近(圖2)。經(jīng)多代繁殖，ygl8突變表型穩(wěn)定遺傳。
[0029] 2、群體構(gòu)建和遺傳分析
[0030] 利用突變體ygl8,分別與日本晴、02428、9311，進(jìn)行雜交，4個(gè)組合?1表型均為正常 綠葉表型，F(xiàn)i自交，得到F2群體。在4個(gè)^群體中，正常綠葉與黃綠葉植株數(shù)目均符合3:1的分 離比，表明突變性狀受細(xì)胞核隱性單基因控制。結(jié)果如下表所示：
[0031]表l.ygl8的遺傳分析
[0033] 表注:雜交組合:母本/父本；肉眼觀察野生型和突變體綠葉、黃綠葉表型;x2〈x20. 05 =3.84表示符合3:1的性狀分離比;P>0.05表示可信。
[0034] 3、用圖位克隆的方法定位ygl8基因
[0035]雜交內(nèi)植株種于溫室約30d，單株取樣用來提取基因組DNA。基因組DNA的提取采用 CTAB法，獲得的DNA沉淀溶解于100yL超純水中。圖位克隆的每個(gè)PCR反應(yīng)用0.5yL DNA樣品。 PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠(EB)染色來進(jìn)行檢測(cè)。
[0036] CTAB法提取基因組DNA的步驟如下：
[0037] (1)用液氮將約0.5g的所取葉片粉碎成細(xì)粉，置于2mL的EP管中。
[0038] (2)加600此的(7^8溶液（2%(111/^)(7^8，100111111〇1/11>18-(：1，20111111〇1/1￡0丁八， 1.4mol/L NaCl;pH 8.0)，置于65°C的水浴鍋內(nèi)lh。
[0039] (3)用等體積的24:1氯仿/異戊醇抽提，顛倒使充分混勾，于10000r/min離心5min， 回收上(水)相。
[0040] (4)取上清，加入十分之一體積的3M乙酸鈉，0.6倍體積的異丙醇（或2倍體積無水 乙醇)沉淀DNA，充分混勾，于_20°C放置30min以上。4°C，10000r/min離心10min。
[00411 (5)用75 %乙醇洗滌沉淀物2次，干燥，用100yL超純水重懸溶解。
[0042] 圖位克隆的PCR反應(yīng)體系（25yL)為：ddH20 16yL，10 X Tag緩沖液(含(順4) 2S〇4) 2 ? 5 yL，MgCl2 2.5yL，dNTPs(各2.5mM)lyL，引物P1/引物P2 l/lyL，DNA模板0.5yL，Tag DNA聚合 酶（Thermo 5(^6帥1行(：）0.5此。？0?反應(yīng)程序?yàn)椋?51€5111111;95 1€3〇8,521€3〇8,721€3〇8,35 個(gè)循環(huán);72°C10min。
[0043] ygl8基因的初步定位:根據(jù)已公布的粳稻和秈稻之間可能存在差異的SSR和InDel 分子標(biāo)記，用ygl8和日本晴的基因組DNA，篩選出了近似均勻分布于12條染色體的多態(tài)性分 子標(biāo)記。在ygl8/日本晴的^定位群體中選取92個(gè)隱性個(gè)體，提取DNA，利用篩選出的多態(tài)性 分子標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)分子標(biāo)記在每個(gè)隱性個(gè)體中的帶型分布，將ygl8基因初步定位 在第6號(hào)染色體上chr6mm0129和chr6mm0287兩個(gè)SSR標(biāo)記之間（如圖3A所示）。引物序列見表 2〇
[0044] ygl8基因的精細(xì)定位:在chr6mm0129和chr6mm0287之間以及附件的區(qū)域，開發(fā)出 ygl8和9311之間的多態(tài)性分子標(biāo)記。在ygl8/9311的F2定位群體中選取910個(gè)隱性個(gè)體，提 取DNA，將ygl8基因定位在分子標(biāo)記Y37和Yl 1之間的區(qū)域內(nèi)（如圖3B所示）；綜合初步定位和 精細(xì)定位結(jié)果，最終將ygl8基因鎖定在chr6mm0129和Y11這兩個(gè)分子標(biāo)記之間（如圖3B所 示）。引物序列見表2。
[0045]表2.定位引物及序列
[0047] 4、候選基因的確定
[0048] 根據(jù)得到的343kb的精細(xì)定位區(qū)間，在水稻基因組注釋項(xiàng)目（Rice Genome Annotation Pro ject，http: //rice ? plantbiology .msu ? edu/)上進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有41 個(gè) 基因。利用PCR的方法，將突變體ygl8中這41個(gè)基因所在的基因組序列擴(kuò)增出來，測(cè)序分析， 發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)基因（L0C_0s06g04150)出現(xiàn)突變，該基因C到T的單堿基突變（即Seq ID N0.2 的第673位核苷酸C，突變成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物上該位點(diǎn) 的氨基酸編碼從亮氨酸變?yōu)楸奖彼幔ㄈ鐖D3C所示）。因此將候選基因L0C_0s06g04150進(jìn)行 功能互補(bǔ)驗(yàn)證。
[0049] 上述PCR反應(yīng)體系（50yL)為：ddH20 17.5yL，2XPrimeSTAR GC緩沖液25yL，dNTPs (各2.5mM)4yL，引物P1/引物P2 1/lyL，基因組DNA lyL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶（TaKaRa) 0.5此。卩〇?反應(yīng)程序?yàn)椋?51€5111111;95°(：1111111，60 1€308,721€4111111，30個(gè)循環(huán)；72°(：10111111。
[0050] 5、功能互補(bǔ)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)
[0051 ] 以野生型廣占63S的基因組DNA為模板，用2對(duì)引物通過PCR擴(kuò)增出L0C_0s06g04150 (YGL8)基因的上游啟動(dòng)子（2732bp)、基因（981bp)和下游終止子（1433bp)所在的基因組序 列。2對(duì)引物分別為：
[0056] 上述2對(duì)引物中的有下劃線的加粗斜體部分為用于酶切和連接的Aarl內(nèi)切酶接頭 序列，其中大寫部分為Aar I內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；非下劃線部分為對(duì)應(yīng)的基因組DNA特異引物序 列。
[0057] 用凝膠回收試劑盒(BioSpin Gel Extraction Kit，BioFlux)分別回收2種目的 PCR片段，再用AaH酶切后用凝膠回收試劑盒回收待用;轉(zhuǎn)基因雙元載體pBWA(V)HII(購(gòu)于 武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司;http: //www. biorun. net/)用Bsal酶切后，用凝膠回收試劑盒 回收待用;將酶切回收后的目的片段和載體進(jìn)行連接反應(yīng)，成為重組載體。
[0058] 上述PCR體系和反應(yīng)程序與本實(shí)施例第4步(候選基因的確定）中的相同。
[0059] 上述目的片段酶切體系（100此總體積）為：ddH20 39yL，10X酶切Buffer 10此， YGL8C1 片段/YGL8C2片段50yL，AarI(Thermo Scientific)lyL〇
[0060]上述載體酶切體系（50yL總體積）為：ddH20 34yL，10X酶切Buffer 5yL，pBWA(V) HII 質(zhì)粒lOyL，Bsal (Thermo Scientific) lyL〇 [0061 ] 酶切反應(yīng)在37°C下進(jìn)行2-4h。
[0062] 上述連接反應(yīng)體系（10yL總體積）為:ddH20 1.5yL，10 X T4DNA連接酶緩沖液1此， pBWA(V)HII質(zhì)粒酶切回收片段lyL，YGL8Cl酶切回收片段3yL，YGL8C2酶切回收片段3此， T4DNA連接酶(Thermo Scientific)0.5yL。連接反應(yīng)步驟為：22°C過夜。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸 桿菌DH10B。
[0063] 重組載體中5146bp的基因組片段經(jīng)測(cè)序與野生型廣占63S的基因組對(duì)應(yīng)序列完全 一致(如Seq ID N0.4所示），則該互補(bǔ)用載體在實(shí)驗(yàn)中命名為pYGL8C;空載體在實(shí)驗(yàn)中重新 命名為pEmvC(載體示意圖如圖4所示）。將pYGL8C和pEmvC分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌，浸染突變體 ygl8的愈傷組織，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因過程由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司 (ht tp: //www ? b i orun .net/)代理進(jìn)行。
[0064]對(duì)轉(zhuǎn)基因再生植株進(jìn)行陽性鑒定，提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，用引物HYG-F: TCTACACAGCCATCGGTCCAG 和 HYG-R: GAAAAGITCGACAGCGTCTCC 來 PCR 擴(kuò)增潮霉素篩選基因 HYG， 結(jié)果如圖5A所示，轉(zhuǎn)化了pYGL8C和pEmvC的植株都為轉(zhuǎn)基因陽性;同時(shí)用yg 18突變位點(diǎn)兩端 轉(zhuǎn)基因植株中的突變位點(diǎn)附近序列進(jìn)行PCR測(cè)序分析，結(jié)果如圖5B所示，轉(zhuǎn)pYGL8C的表型恢 復(fù)植株中該位點(diǎn)同時(shí)存在C和T，而轉(zhuǎn)空載體pEmvC的植株中該位點(diǎn)僅是與突變體ygl8-樣 的T。轉(zhuǎn)候選基因互補(bǔ)載體pYGLSC的植株恢復(fù)了正常表型、且葉綠素含量恢復(fù)正常，而轉(zhuǎn)空 載體pEmvC的植株還是黃化表型、且葉綠素含量與ygl8突變體相近(如圖6A和6B)。基因L0C_ 0s06g04150所在的基因組序列成功挽救了ygl8突變體的表型，說明ygl8基因就是L0C_ 0s06g04150突變而來的。
[0065] 上述檢測(cè)和測(cè)序用的PCR體系和反應(yīng)程序與本實(shí)施例第3步（用圖位克隆的方法定 位ygl8基因）中的圖位克隆用的PCR體系和反應(yīng)程序相同。
[0066] 上述葉綠素含量測(cè)定的步驟如下：
[0067] 將葉片剪碎用液氮研磨，取0. lg樣品，加入5mL 80 %丙酮，4°C遮光抽提2.5h;再于 4°C下，14000rpm離心10min，取上清用80 %丙酮稀釋5倍后，吸取200此測(cè)定663nm和647nm處 的吸光度，并計(jì)算葉綠素含量。計(jì)算公式如下：
[0068] Ca(葉綠素 a) = 12 ? 25A663-2 ? 79A647，
[0069] Cb (葉綠素b) = 21 ? 50A647-5 ? 10A663，
[0070] Ca+b = 7.15A663+18.71A647,
[0071 ]單位:lig/mL。
[0072] 故葉片中的葉綠素含量為：（5*5扣&+13)/0.1，單位邱/^?1^1 :鮮重。
[0073] 6、YGL8的生物信息學(xué)分析
[0074]野生型中功能的YGL8沒有內(nèi)含子，編碼326個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（序列見Seq ID No. 3)。突變體中由于G到T的點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼的第225個(gè)氨基酸由亮氨酸(Leu)變?yōu)楸奖?酸(Phe)。根據(jù)NCBI(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)的基因注釋信息，YGL8編碼葉綠素合 成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶一一鎂原卟啉K甲基轉(zhuǎn)移酶。
[0075]實(shí)施例2在水稻材料中鑒定ygl8基因
[0076]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1中的結(jié)果，ygl8基因是L0C_0s06g04150基因的點(diǎn)突變而來的， 即Seq ID N0.2的第673位核苷酸C，突變成了Seq ID NO. 1的第673位核苷酸T。因此，本實(shí)施 例采用PCR-測(cè)序的方法，鑒定水稻材料中是否含有ygl8基因，水稻材料基因組中如果含有 Seq ID NO. 1所示的序列，則其含有yg 18基因。采用CTAB法提取水稻材料DNA(同實(shí)施例1中 的方法），用ygl8突變位點(diǎn)兩端的引物（YGL8MutationF:CGCGCCTACTTCAACTCCA和 YGL8MutationR:GATCATCTGCTTCGCCTCCT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與 ygl8的編碼區(qū)序列（Seq ID NO. 1)進(jìn)行比對(duì)，分析測(cè)得序列對(duì)應(yīng)于序列（Seq ID NO. 1)的第 673位核苷酸是C還是T，是T則含有ygl8基因。
[0077] 在本實(shí)施例中，鑒定了不同水稻品種（結(jié)果見表3)，如廣占63S、9311、02428、日本 晴、ZH11、空育131、粵泰B、川香29B和松粳13,它們的基因組上對(duì)應(yīng)于ygl8突變堿基處的核 苷酸均為C，表明它們的基因組中均為野生型的YGL8基因，不含有突變型ygl8基因。檢測(cè)的 雜交組合ygl8/日本晴、ygl8/9311，它們的FHf植株基因組上對(duì)應(yīng)于ygl8突變堿基處的核 苷酸均為C和T同時(shí)存在，即含有雜合的ygl8基因。進(jìn)一步檢測(cè)了雜交組合ygl8/9311的F 2R 植株基因組上對(duì)應(yīng)于ygl8突變堿基處的核苷酸，F(xiàn)2代黃綠葉植株的基因組在該處堿基均為 T，含有純合的ygl8基因；而？ 2代綠葉植株的基因組在該處堿基為C(純合的野生型YGL8基 因）、或者C和T同時(shí)存在(含有雜合狀態(tài)的ygl8基因）。
[0078]表3. ys?18基因的突變堿基在不同的水稻材料中的對(duì)應(yīng)堿基
[0080] 表注:雜交組合:母本/父本。F2植株隨機(jī)取自ygl8/9311的F2群體。？!植株各取10株 進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)2植株取10株綠葉植株(Gl-G10)、10株黃綠葉植株(Y1-Y10)進(jìn)行檢測(cè)。
[0081 ]實(shí)施例3含有ygl8基因的黃綠葉突變體ygl8應(yīng)用于水稻育種過程中
[0082]黃綠葉突變體ygl8為光溫敏不育系廣占63S自發(fā)突變而來，本身即為不育系，可直 接用于水稻育種工作中。
[0083] 首先，ygl8基因可用于雜交水稻育種F#雜種純度鑒定。以突變體ygl8為母本，以 其它水稻材料為父本，進(jìn)行雜交，F(xiàn)i代雜種植株為正常綠葉表型，而混雜在Fi代雜種中的母 本自交產(chǎn)生的種子、其長(zhǎng)成的植株為黃綠葉表型，肉眼即可辨別。本實(shí)施例中，雜交組合 yg18(母本)/9311(父本)的？:代種子，發(fā)苗126顆，其中123顆苗呈正常綠葉表型、3顆苗呈黃 綠葉表型，因此該組合此次的Fi代雜種純度為97.6%。
[0084] 其次，ygl8基因可用于不育系自身保種的種子純度鑒定。突變體ygl8自交繁殖的 種子，其植株為黃綠葉表型;而自交繁殖過程中因其它水稻材料花粉污染所產(chǎn)生的雜種，其 植株為正常綠葉表型。本實(shí)施例中，對(duì)一批次突變體ygl8自交繁殖的種子發(fā)苗621顆，其中 495顆呈黃綠葉表型（為純種），126顆為正常綠葉表型（為混雜種），因此該批次自交保種材 料的種子純度為79.7%，花粉污染較為嚴(yán)重;而對(duì)另一批次突變體ygl8自交繁殖的種子發(fā) 苗503顆，這503顆植株均為黃綠葉表型，因此該批次自交保種材料的種子純度為100%。
[0085] 推而廣之，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，利用ygl8突變體通過雜交的手段將ygl8基 因?qū)肫渌静牧纤a(chǎn)生的新材料，也將具有ygl8突變體的黃綠葉性狀，具有與本實(shí)施 例3相同的應(yīng)用前景。此類新材料的鑒定方法與實(shí)施例2中的相同。
[0086] 雖然以上通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說明，但本發(fā)明并不限于這些具體的 實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在此基礎(chǔ)上所做出的未超出權(quán)利要求保護(hù)范圍的任何 形式和細(xì)節(jié)的修改和變化，均屬于本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。另外，本發(fā)明說明書和權(quán)利要求 書中所使用的一些術(shù)語并不是限制性的，僅僅是為了便于描述。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻黃綠葉性狀基因 ygis，其特征在于:該水稻黃綠葉性狀基因 ygl8的核苷酸 序列如Seq ID NO. 1所示，其所對(duì)應(yīng)的野生型基因 YGL8的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。2. 權(quán)利要求1所述的水稻黃綠葉性狀基因 ygl8在水稻育種中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:包括雜交^代雜種純度鑒定、不育系自交繁 殖保種純度鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821058SQ201610392493
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】王兆海, 李陽生, 洪瀟, 胡柯柯
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)