一種固定化蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于固定蛋白的化合物以及一種用于固定蛋白的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 將蛋白固定到如微陣列、芯片和珠等固體載體上是一種用于闡明蛋白-蛋白或蛋 白-配體相互作用以及用于以高處理量的方式探測(cè)新蛋白功能的強(qiáng)大方法。不同于DNA微 陣列的情況，由于在實(shí)現(xiàn)將蛋白選擇性地且均勻取向地分布到固體表面中的固有困難，實(shí) 施用于蛋白固定的通用方法存在著挑戰(zhàn)。
[0003] 常規(guī)固定方法主要依賴三種機(jī)理：物理連接、共價(jià)鍵合和生物親和性固定。然而非 選擇性的物理連接或共價(jià)鍵合可能阻塞活性部位或甚至使蛋白變性。通過(guò)重組融合標(biāo)簽和 所偶聯(lián)蛋白的共表達(dá)進(jìn)行固定可以相應(yīng)保證蛋白的確切取向并且提供了微調(diào)生物結(jié)合物 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的靈活性。例如，將sjGST標(biāo)簽固定到GSH-結(jié)合的聚合物珠或?qū)is-標(biāo)簽固定 到Ni-NTA芯片或?qū)⑸锼?標(biāo)簽結(jié)合到鏈霉親和素涂布的固體載體上已經(jīng)被廣泛地選作 非共價(jià)蛋白固定方法用于保持所標(biāo)簽蛋白的活性。
[0004] 因此開(kāi)發(fā)一種有效且穩(wěn)定的固定蛋白的策略，能夠最大限度地保持活性，是有著 顯著意義和應(yīng)用價(jià)值。位置選擇性共價(jià)固定蛋白最近引起很多關(guān)注，因?yàn)樗軌蚍€(wěn)定地、均 勻地且高密度地固定各種蛋白。其方法是將所關(guān)注的蛋白與標(biāo)簽蛋白共表達(dá)，再利用后者 與其被固定的底物分子共價(jià)地且選擇性地反應(yīng)。比如，Kindermann等報(bào)道了一種通過(guò)不可 逆地將06-芐基鳥(niǎo)嘌呤衍生物的烷基連接到hAGT半胱氨酸殘基之一來(lái)固定hAGT-標(biāo)簽的 共價(jià)方法。
[0005] GST-標(biāo)簽蛋白具有高底物親合性，然而，已知的GST標(biāo)簽固定方法仍然基于可逆 的GSH-GST結(jié)合，限制了它們的應(yīng)用。
[0006] Viswanathan等報(bào)道了通過(guò)銅（I)-催化的Huisgen[3+2]環(huán)加成反應(yīng)（"click" 反應(yīng)）將在C-末端半胱氨酸殘基上，用炔改性的GST蛋白共價(jià)固定到玻璃表面上的策略。 盡管實(shí)現(xiàn)了共價(jià)和定向結(jié)合，但是銅催化劑可引起某些不穩(wěn)定的蛋白的變性或沉淀，因此 有可能在固定后降低了蛋白活性。另外，相比于傳統(tǒng)的GSH-GST方法，將炔基團(tuán)引入GST蛋 白是耗時(shí)的且高成本的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一類小分子物質(zhì)，其能夠通過(guò)位置選擇性共價(jià)鍵合的方式 共價(jià)固定蛋白，特別是sjGST-標(biāo)簽化的蛋白。
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供一類能夠以相對(duì)簡(jiǎn)單的方法合成的具有氟磺?；男?分子，當(dāng)用它們處理sjGST-標(biāo)簽化的蛋白時(shí)能夠共價(jià)地、選擇性地、不可逆地標(biāo)記sjGST。
[0009] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供了下述技術(shù)方案：
[0010] 技術(shù)方案1.式I的化合物：
[0011]
[0012] 其中，
[0013] 1^是苯基的任選取代基；
[0014] 是Ar的任選取代基；
[0015] m 是 0、1、2、3、4;
[0016] η 是 0、1、2、3、4;
[0017] 連接基團(tuán)是任選被取代的，并且是由下述Α組中的0-15個(gè)和下述Β組中的一個(gè)組 成的三價(jià)基團(tuán)，
[0018] A 組：一0 -、一 NH -、一 S -、一 S0 -、一 S02-、一 CO -、一 C ( = NH)-、 -c ( = S) -、一 C ( = SO) -、一 C ( = S02) -、一 Ci 10 亞烷基一、一c 3 10 亞環(huán)烷基一、與 一（3-10)兀亞雜環(huán)烷基一，
[0019] B組：一N_、一 Q i。次烷基_、一 C3 i。次環(huán)烷基_、與一（3_10)兀次雜環(huán)烷基_ ;
[0020] Ar是苯、萘、單環(huán)雜芳基、雙環(huán)雜芳基；
[0021] R 選自：
[0022] 可與固體表面反應(yīng)的基團(tuán)，包括但不限于氨基（NH2)，羥基（0H)，巰基（SH)，羧基 (C00H)；
[0023] 焚光團(tuán)（fluorophore);
[0024] 生物素部分；
[0025] _C。丨。亞烷基-C Ξ CH ;和
[0026] 氫。
[0027] 技術(shù)方案2 :根據(jù)上述技術(shù)方案中任一個(gè)的化合物，其中所述式I是下述式II :
[0028]
[0029] 技術(shù)方案3 :根據(jù)上述技術(shù)方案中任一個(gè)的化合物，其中所述連接基團(tuán)選自：
[0030]
[0031] 技術(shù)方案4:根據(jù)上述技術(shù)方案中任一個(gè)的化合物，其中所述4^〇?丄是
[0032] 技術(shù)方案5 :選自下列的化合物：
[0034] 技術(shù)方案6. -種固定蛋白的方法，包括下述步驟：
[0035] 步驟1 :通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相互作用，將權(quán)利要求1-N中任一項(xiàng)的化合物接枝到固 體表面；和
[0036] 步驟2 :通過(guò)在酪氨酸殘基的共價(jià)鍵，將蛋白固定到步驟1中制備的固體表面上；
[0037] 或者
[0038] 步驟1 :通過(guò)在酪氨酸殘基的共價(jià)鍵，使權(quán)利要求1-N中任一項(xiàng)的化合物與蛋白反 應(yīng)；和
[0039] 步驟2 :通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相互作用，將步驟1中制備的蛋白接枝到固體表面。
[0040] 技術(shù)方案7 :根據(jù)技術(shù)方案6的方法，其中所述固體表面包括金屬、聚合物或納米 材料的表面。
[0041] 技術(shù)方案8 :根據(jù)技術(shù)方案6或7的方法，其中所述共價(jià)或非共價(jià)相互作用包括生 物素-鏈霉親和素相互作用或抗原-抗體相互作用。
[0042] 技術(shù)方案9 :根據(jù)技術(shù)方案6、7或8的方法，其中所述酪氨酸殘基是日本血吸蟲(chóng)谷 胱甘膚S-轉(zhuǎn)移酶的酪氨酸-ill殘基。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1 :通過(guò)融合的GST標(biāo)簽蛋白的位置選擇性共價(jià)固定，其中sjGSTJDB ID :1M9A。
[0044] 圖2 : (A) G「H和G「炔的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(B)重組s jGST蛋白的G「炔標(biāo)記（每個(gè)條帶 〇. 5yg):熒光掃描（FL，上部）；考馬斯藍(lán)著色（CBB，下部）；(〇在⑶中的熒光帶的密度 測(cè)定。
[0045] 圖3 :添加不同濃度的G「H的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)：(A)在G「炔處理前和⑶在G「炔處理 后（sjGST，每個(gè)條帶0.5yg)。
[0046] 圖4 :MALDI-T0F-MS顯示酪氨酸-111作為Gi化合物的結(jié)合位點(diǎn)。（A)在胰蛋白 酶消化后在G^H和Gi-炔處理的sjGST肽之間檢測(cè)出52道爾頓的質(zhì)量偏移。（B)MS/MS分 析，在1093和1145處的峰。（C)Y111F sjGST突變體消滅了 Gf炔所造成的標(biāo)記。
[0047] 圖5 : (Α)Α-生物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B)在匕-生物素預(yù)處理的、鏈霉親和素-涂布 的96-孔微板上的GST-eGFP固定。（C)用漸增量的Gi-生物素捕獲GST-eGFP的結(jié)果（更 多GST-eGFP被捕獲）。（D)用漸增量的Gi-Η預(yù)培養(yǎng)GST-eGFP逐漸使固定減弱。
[0048] 圖6 : (A)G「H固定的瓊脂糖凝膠珠的結(jié)構(gòu)。⑶和（C)可溶性（青色，位置靠上） 和固定的（綠色，位置靠下）激酶ITK和EGFR的基于HTRF的酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 具體實(shí)施方案
[0049] 縮略語(yǔ)：
[0050] ACN 乙腈
[0051] ATP 三磷酸腺苷
[0052] Beads 珠/高分子球
[0053] Biotin 生物素
[0054] Boc 叔丁基氧羰基
[0055] DCM 二氯甲烷
[0056] DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
[0057] DMF 二甲基甲酰胺
[0058] DMS0 二甲基亞砜
[0059] EDTA 乙二胺四乙酸
[0060] eGFP 增強(qiáng)綠色熒光蛋白
[0061] EGFR 表皮生長(zhǎng)因子受體
[0062] GfAlkyne G!-塊
[0063] Gfbiotin Gf 生物素
[0064] GFP 綠色熒光蛋白
[0065] GSH 谷胱甘肽
[0066] GST 谷胱甘膚S-轉(zhuǎn)移酶
[0067] 1-[雙（二甲基氨基）亞甲基]-1H-1，2, 3-三唑并[4, 5-b]吡啶鑰
[0068] HATU 3-氧化物六氟磷酸鹽，
[0069] 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1, 2, 3-triazolo[4, 5~b]
[0070] pyridinium3-〇xid hexafluorophosphate
[0071] HEPES 4-羥乙基哌嗪乙磺酸
[0072] His (多聚）組氨酸
[0073] HTRF 均勻時(shí)間分辨熒光
[0074] IAYSK
[0075] ITK 可誘導(dǎo)的T細(xì)胞激酶
[0076] MALDI-T0F-基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜
[0077] MS
[0078] MeCN 乙腈
[0079] NsCl 鄰硝基苯磺酰氯
[0080] 2-Nitrobenzenesulfonyl chloride
[0081] NTA 次氮基三乙酸
[0082] PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0083] PBS 磷酸鹽緩沖液
[0084] Ph 苯基
[0085] PhSH 硫代苯酚
[0086] SDS 十二烷基硫酸鈉
[0087] SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0088] sjGST 日本血吸蟲(chóng)谷胱甘膚S-轉(zhuǎn)移酶
[0089] TAMRA 四甲基羅丹明
[0090] TAMRA-N3 四甲基羅丹明-疊氮
[0091] Tetramethylrhodamine 5_Carboxamid〇-(6-Azidohexanyl)
[0092] TBTA 叔丁基2, 2, 2-三氯亞氨逐乙酸酯
[0093] TEA 三乙胺
[0094] TFA 三氟乙酸
[0095] THF 四氫呋喃
[0096] TK T細(xì)胞激酶
[0097] TLC 薄層色譜法
[0098] TMS 四甲基硅烷
[0099] 定義
[0100] 根據(jù)本發(fā)明，札和1?2是任選的取代基，其彼此獨(dú)立地選自鹵素如F-、Cl-、Br-和 1-，NH 2-、CN-，0H-，HS-，-N02, -CF3, -C00H，CH3C0-，（C! 1Q烷基）-C00-，-0-C 丨 1Q烷基，C 丨 10烷 基-、C2 i。烯基-、C 2 i。炔基-、單環(huán)或雙環(huán)的C 3 i。環(huán)烷基-、芳基-、單環(huán)或雙環(huán)雜芳基-、芳 基-二價(jià)連接基團(tuán)-芳基_、單環(huán)或雙環(huán)雜芳基-二價(jià)連接基團(tuán)-單環(huán)或雙環(huán)雜芳基_、單環(huán) 或雙環(huán)雜芳基-二價(jià)連接基團(tuán)-芳基_、芳基-二價(jià)連接基團(tuán)-單環(huán)或雙環(huán)雜芳基_，其中二 價(jià)連接基團(tuán)的例子有一 〇 -、一 NH -、一 S -、一 S0 -、一 S02-、一 C0 -、一 C (一 NH) -、 -c ( = S) -、一 C ( = SO) -、一 C ( = S02) -、一 Ci 10亞烷基一、一C 3 10亞環(huán)烷基一、 一（3-10)元亞雜環(huán)烷基一等，芳基如苯基、萘基，單環(huán)雜芳基如5或6元含1-4個(gè)選自0、 N和S的雜芳基，雙環(huán)雜芳基是由兩個(gè)彼此獨(dú)立的單環(huán)雜芳基，或一個(gè)苯基與一個(gè)單環(huán)雜芳 基稠合而成。
[0101] 根據(jù)本發(fā)明，連接基團(tuán)是任選被取代的，取代基選自鹵素如F-、Cl-、Br-和1-， NH2-、CN-，0H-，HS-，-N02, -CF3, -C00H，CH3C0-，（Ci 1Q烷基）-C00-，-o-c ! 1Q烷基，C ! 1Q烷基-、 C2 i。烯基-、C2 i。炔基-、單環(huán)或雙環(huán)的C 3 i。環(huán)烷基-、芳基-、單環(huán)或雙環(huán)雜芳基-;其中芳 基-如苯基、萘基；單環(huán)雜芳基如5或6元含1-4個(gè)選自0、N和S的雜芳基；雙環(huán)雜芳基是