一種含酸性蛋白酶的醬油復合酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醬油復合酶，具體涉及一種含酸性蛋白酶的醬油復合酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國醬油釀造從古代勞動人民的自然網(wǎng)落制曲到19世紀50年代末期開始的深層 通風制曲，都離不開制曲工藝，曲子中的微生物是否優(yōu)良，酶活是否高，酶系是否豐富，直接 影響到醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量。眾所周知，制曲工藝不僅占地面積大，而且勞動強度高，若采用 直接加酶不制曲工藝，不僅省去了制曲工序，大大降低了勞動強度，而且由于曲子中酶系復 配合理，還能提高醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003] 釀造醬油是利用制曲過程中微生物的多種酶對原料中的蛋白質(zhì)和淀粉進行水解， 形成醬油的色、香、味、體等成分的過程。目前國內(nèi)普遍采用的醬油菌種是滬釀3. 042米曲 霉，該菌分泌的蛋白酶多以中性和堿性蛋白酶為主，而酸性蛋白酶含量較低。發(fā)酵過程中隨 著醬醅pH值得下降，中性和堿性蛋白酶活力逐漸下降，而酸性蛋白酶活力又過低，最終導 致原料全氮利用率不高，醬油鮮味不足等缺陷。因此，提高醬油曲中酸性蛋白酶的比例是解 決醬油生產(chǎn)上原料利用率不高和產(chǎn)品質(zhì)量較差的有效途徑之一。
[0004] 中國專利CN 102488181 A公開了一種復合酶制劑及其在醬油發(fā)酵頭渣中的應用。 本發(fā)明的復合酶制劑，由以下重量百分比組成：淀粉酶3~8%，復合蛋白酶50~70%，纖 維素酶15~35%，果膠酶10~20%，β -葡聚糖酶2~5%，所述復合蛋白酶由木瓜蛋白 酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶組成。本發(fā)明還公開了上述復合酶制劑在醬油發(fā)酵頭渣中提高 蛋白質(zhì)收得率的應用，將所述復合酶制劑溶于水，添加到天然曬制或保溫發(fā)酵的醬油釀造 提取第一道醬油后的醬渣（頭渣）中，可以有效分解頭渣中與蛋白質(zhì)結(jié)合的淀粉、纖維質(zhì)、 果膠和β -葡聚糖，進而將頭渣中的蛋白質(zhì)分解成為氨基酸，提高醬油中的氨基態(tài)氮和固 形物的含量。本發(fā)明的復合酶制劑可以有效補充醬渣中的酶系的不足，提高醬油生產(chǎn)中原 料蛋白質(zhì)的收得率，降低醬油生產(chǎn)成本。上述公開的專利中復合蛋白酶不含酸性蛋白酶，其 中的木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分別為植物酶和動物酶，成本高，酶制劑獲取原料缺乏，工業(yè)化 和規(guī)模化受到制約，并且復合酶酶系不全，活力低，主要適用于醬油發(fā)酵頭渣的添加，應用 范圍受限?！吨袊{(diào)味品》公開了"釀造醬油專用酶制劑在釀造醬油生產(chǎn)中的應用"（蔡坤華、 戎文文、蔣永杰、陳永林，2002年3月，第3期，文章編號：1000-9973 (2002) 03-0010-03)。其 中專用酶制劑含有真菌α-淀粉酶、復合蛋白酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶等多種酶系，跟 稀糖漿鹽水和成曲混合，拌料入池進行保溫發(fā)酵，促進了醬油生產(chǎn)原料中蛋白質(zhì)和淀粉原 料的的分解，提高了原料利用率，同時促進了風味物質(zhì)的形成，改善了醬油風味，全氮利用 率達到79. 30%，比對照組提高了 7. 15%;氨基酸生成率大53. 45%，比對照組提高8. 20%。 釀造醬油專用酶制劑應用在醬油釀造中取得了成功。上述公開的技術(shù)文獻酶系仍然不全， 比如，雖然采用了脫脂豆柏，但仍然存在殘留脂肪，脂肪酶的添加可有酶解解殘留脂肪細 胞，加速其他酶制劑的滲透，提高酶解效率，進而提高蛋白質(zhì)及淀粉原料利用率，縮短發(fā)酵 時間等，同時，專用酶制劑作為一種商品，其存儲穩(wěn)定性及效力是需要考慮的很重要的問 題，并且，還應考慮防止黃曲霉菌（毒素）、細菌雜菌污染等食品安全性問題，以同時提高釀 造醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量（理化指標和衛(wèi)生指標）。
[0005] 因此，開發(fā)和研究適合與人民生活息息相關(guān)的調(diào)味品--釀造醬油的復合酶制劑 仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員的責任和追求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有釀造醬油復合酶的缺陷，以含高活力酸性蛋 白酶的蛋白酶和其他食品級酶制劑為主要原料，科學復配具有高活力酸性蛋白酶和抑制黃 曲霉、致病性大腸桿菌的生長繁殖、分解黃曲霉毒素的霉菌培養(yǎng)物，含有多種植物酶系的的 植物提取物，能有效抑制黃曲霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，對黑曲霉、米 曲霉抑制效果不明顯且增香調(diào)味的香辛料提取物，具有選擇性吸附黃曲霉毒素的脫霉素， 可明顯提高醬油復合酶存儲穩(wěn)定性（酶活力和效力）的保護劑、激活劑和抗氧化劑等，制備 一種酶系全、酶活力高、穩(wěn)定性強、效力高，有效提高釀造醬油產(chǎn)量和質(zhì)量及食品安全性的 醬油復合酶。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] -種含酸性蛋白酶的醬油復合酶，由以下重量份數(shù)的原料組成：
[0009] 蛋白酶25-35份，淀粉酶10-20份，植物提取物10-15份，霉菌培養(yǎng)物5-15份，半 纖維素酶10-12份，果膠酶6-10份，植酸酶6-9份，酯酶5-8份，香辛料提取物5-8份，保護 劑4-6份，激活劑4-6份，脫霉素1-3份，抗氧化劑0. 2-0. 5份；
[0010] 所述植物提取物中含有豐富的植物蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、酯酶、氧化還原 酶等多種植物酶；
[0011] 所述植物提取物中還含有植物多糖和單糖、植物淀粉、植物蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，不僅 可為醬油復合酶提供全面、豐富的植物酶，還可作為制備酸性蛋白酶和霉菌培養(yǎng)物的發(fā)酵 培養(yǎng)基成分，提高蛋白酶活力和微生物產(chǎn)酶能力；同時可為醬油曲提供全面、豐富的營養(yǎng)物 質(zhì)；
[0012] 所述植物提取物采用超聲清洗、微波輔助超聲提取和高壓脈沖電場提取、超濾濃 縮等低溫提取技術(shù)，有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率；有效保證了植物提取物的 食品安全性；
[0013] 所述植物提取物的制備方法為：將大麥芽和小麥芽按質(zhì)量比4-6:1-3均勻混合， 粉碎至粒度0. 5-lmm，得粉碎麥芽；然后將木瓜、菠蘿、無花果分別于超聲波清洗機中在功 率200W、頻率30KHz條件下超聲清洗5-10min，浙干，室溫下破碎至粒度0. 5-lmm，并按質(zhì)量 比5-7:2-4:1-3均勻混合，加入混合物質(zhì)量2-4倍的粉碎麥芽得原料混合物，加入原料混合 物質(zhì)量1-3倍的水，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3-4,在功率150-300W、頻率2000Hz條件下進行 微波提取，其中，每次微波輻照總時間60-SOs，進行間隔式輻照：輻照10s，間隔10s，控制溫 度20-35°C，如此輻照10次，同時在功率200-300W，頻率30-40KHZ條件下進行超聲波輔助 提?。槐豯_3h，然后，在功率200-400W、頻率2000Hz條件下進行微波提取，其中，每次微 波輻照總時間90-105S，進行間隔式輻照：輻照15s，間隔10s，控制溫度40-60°C，如此輻照 10次，同時在功率300-500W，頻率40-50KHZ條件下進行超聲波輔助提取，最后自然降溫至 室溫，于電場強度25-35kV/cm，脈沖時間400-600 μ s，脈沖頻率200-300HZ條件下進行高壓 脈沖電場（PEF)提取15-20min ;提取液過濾得第一濾液，加濾渣2倍的水漂洗、過濾得第二 濾液，將第一濾液和第二濾液按質(zhì)量比1:1-2均勻混合，混合液超濾濃縮、冷凍干燥、低溫 粉碎即得植物提取物；
[0014] 優(yōu)選地，所述超聲波清洗機中清洗液為0. 3-0. 5%的碳酸氫鈉溶液。
[0015] 所述蛋白酶是由以下質(zhì)量百分比組成的酶制劑均勻混合而成：酸性蛋白酶70%， 中性蛋白酶10%，堿性蛋白酶10%，耐鹽谷氨酰胺酶10% ;
[0016] 所述酸性蛋白酶和霉菌培養(yǎng)物是以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉 (AspergillususamiDCCTCC NO :M 2013601為出發(fā)菌株，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層發(fā) 酵而制得，并且發(fā)酵培養(yǎng)基中科學復配了上述制備的植物提取物；
[0017] 優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶的制備方法包括以下步驟：保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的菌種經(jīng)斜面菌種活化、一級、二級、三級液體種子擴大培養(yǎng)至種子罐，將 種子罐液體種子以5%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度31-321：，攪拌速度200-40(^/ m，通風量1:1-2,培養(yǎng)時間10-12h ;然后以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至26-30°C，攪拌 速度400-600r/m，通風量1:1-3,恒溫培養(yǎng)8-10h ;繼續(xù)以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 23-25°C，攪拌速度500-700r/m，通風量1:2-4,培養(yǎng)時間22-31h，然后，將種子罐液體種 子以3%接種量追加接入發(fā)酵罐，最后以1-2°C /h升溫速率緩慢升溫至31-32°C，攪拌速 度200-400r/m，通風量1:1-2,恒溫培養(yǎng)10-12h ;接著以1-2°C /h降溫速率緩慢降溫至 23-25 °C，攪拌速度500-700r/m，通風量1:2-4,恒溫培養(yǎng)22-31h ;發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào) 配、精濾、干燥得固體酸性蛋白酶；
[0018] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物5-10g，干酪素4g， 磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0. 6g，氯化鉀0. 8g，蒸餾水1000mL，pH值5. 8,121°C滅菌20min。
[0019] 所述一級、二級、三級種子培養(yǎng)基組成為：麩皮60-80g，玉米粉50-60g，豆餅粉 35-40g，海藻糖10-15g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣5-10g，干酪素 5-10g，中草藥提 取物5-10g，硫酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，純凈水1000mL，pH值5-7,121°C滅菌20min ;
[0020] 所述種子罐培養(yǎng)基組成為：麩皮60-80g，玉米粉50-60g，豆餅粉35-40g，海藻糖 10-15g，中草藥提取物10-15g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣5-10g，干酪素 5-10g，硫 酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，純凈水1000mL，pH值5-7,121°C滅菌20min ;
[0021] 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為7. Ox 10s-8. Ox 10s個/ml ;
[0022] 所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：麩皮60_80g，玉米粉50_60g，植物提取物40_60g，豆 餅粉35-40g，中草藥提取物20-30g，海藻糖10-30g，魚粉6-10g，氯化銨10-12g，氯化鈣 5-10g，干酪素 3-5g，硫酸鎂2-4g，磷酸氫二鉀l-3g，硝酸鉀l-2g，硫酸鋅0. 1-0. 2g，純凈水 1000mL，pH 值 5-7,121°C 滅菌 20min ;
[0023] 所述中草藥提取物的制備方法如下：
[0024] 按重量份數(shù)計，稱取黃芪60-70份，當歸50-60份，黨參40-45份，甘草40-45份，魚 腥草35-45份，神曲35-45份，柴胡10-15份，黃芩10-15份；將上述中草藥粉碎至粒徑為2 毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加3-6倍重量的水，控制溫度70°C -90°C保持2-4h， 然后降溫至45-60°C，加入混合物料總重量5-