64] 1.本發(fā)明的植物提取物中含有豐富的植物蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、酯酶、氧 化還原酶等多種植物酶；還含有植物多糖和單糖、植物淀粉、植物蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅可 為醬油復(fù)合酶提供全面、豐富的植物酶，還可作為制備酸性蛋白酶和霉菌培養(yǎng)物的發(fā)酵培 養(yǎng)基成分，提高蛋白酶活力和微生物產(chǎn)酶能力；同時(shí)可為醬油曲提供全面、豐富的營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)；所述植物提取物采用超聲清洗、微波輔助超聲提取和高壓脈沖電場(chǎng)提取、超濾濃縮等低 溫提取技術(shù)，有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率；有效保證了植物提取物的食品安 全性。
[0065] 2.本發(fā)明的酸性蛋白酶以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉CCTCC Ν0:Μ 2013601為出發(fā)菌株，根據(jù)其最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)酶溫度，細(xì)化了孢子增殖和發(fā)酵產(chǎn)酶階 段的工藝參數(shù)，采用梯度降溫和梯度升溫的發(fā)酵工藝，同時(shí)予以追加接種，尤其是梯度降溫 和梯度升溫的發(fā)酵工藝顯著提高了出發(fā)菌株的抗應(yīng)激能力，致使菌種的產(chǎn)酶能力最大限度 地顯現(xiàn)。并且本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)基組成實(shí)施全程優(yōu)化，添加了具有抗熱應(yīng)激原作用的黃芩、柴 胡，添加了具有調(diào)整和修復(fù)機(jī)體功能、增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、具有微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的黃芪、 黨參等，進(jìn)一步增強(qiáng)了微生物在同一發(fā)酵環(huán)境下的機(jī)體功能性、傳代適應(yīng)性和共同協(xié)作性， 進(jìn)而增強(qiáng)了微生物的代謝功能，使得本發(fā)明所產(chǎn)酸性蛋白酶活力高、耐受溫度較高、穩(wěn)定性 強(qiáng)、適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0066] 3.本發(fā)明酸性蛋白酶制備過程中發(fā)酵培養(yǎng)基植物提取物的添加，使得發(fā)酵液酸性 蛋白酶酶活力大幅度提高，由13000-14000U/mL提高至19000-22000U/mL，增幅57. 14%;發(fā) 酵液粗酶液可耐受較高溫度，40°C、45°C、50°C下，60分鐘酶活沒有下降。55°C與60°C下，30 分鐘降到原有酶活的95%，60分鐘降到90%。65 °C下，30分鐘降到原有酶活的85%，60分 鐘降到80%。70°C下，30分鐘降到原有酶活的80%，60分鐘降到原有酶活的75%。酸性蛋白 酶適應(yīng)反應(yīng)溫度30-55°C，最適反應(yīng)溫度40-50°C，適應(yīng)pH值范圍2-6，最適pH值2. 5-3. 5。 寬泛的pH作用范圍和溫度作用范圍、高活力和強(qiáng)熱穩(wěn)定性更加適合醬油釀造，可充分酶解 大豆等蛋白質(zhì)原料，提高全氮利用率和氨基酸生成率，進(jìn)而提高醬油的產(chǎn)量和質(zhì)量，降低生 產(chǎn)成本。
[0067] 4.本發(fā)明的霉菌培養(yǎng)物含有較強(qiáng)的微生物活性，活菌含量為TxK^-gxK^CFU/g。 在醬油發(fā)酵過程中不僅可持續(xù)提供高活力酸性蛋白酶，而且可有效抑制黃曲霉、致病性大 腸桿菌的生長(zhǎng)繁殖、分解黃曲霉毒素。對(duì)黃曲霉菌的抑制率為73-95%，對(duì)黃曲霉毒素 B1的 降解率為58. 78%。
[0068] 5.本發(fā)明的香辛料提取物可有效抑制黃曲霉、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和 大腸桿菌，對(duì)黑曲霉、米曲霉抑制效果不明顯；可有效防止醬油發(fā)酵過程雜菌污染，保證發(fā) 酵正常進(jìn)行，還可代替食品防腐劑延長(zhǎng)醬油的保質(zhì)期，并且可為釀造醬油調(diào)味增香。
[0069] 6.本發(fā)明的脫霉素是由美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)的一種不同于普通硅鋁酸鹽的硅鋁酸 鹽衍生物，具有網(wǎng)格狀多層或鏈狀結(jié)構(gòu)，二價(jià)或三價(jià)陽(yáng)離子與氧或羥基形成八面體的共價(jià) 結(jié)構(gòu)；二氧化硅則與氧或羥基形成四面體的共價(jià)結(jié)構(gòu)。具有強(qiáng)選擇性吸附作用，能有效吸 附原料（大豆、小麥、豆餅、豆柏等）中黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等多 種毒素，而且不會(huì)吸附氨基酸、維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成份，不影響微生物的正常生長(zhǎng)和 繁殖，可有效防止原料毒素對(duì)醬油發(fā)酵過程中糖化、發(fā)酵菌種的危害，促進(jìn)其健康增殖和發(fā) 酵，提高產(chǎn)酶、發(fā)酵能力。
[0070] 7.本發(fā)明的抗氧化劑可有效防止復(fù)合酶酶分子結(jié)構(gòu)氧化而造成酶活性損失，提高 酶活力穩(wěn)定性。在〇°C和40°C條件下儲(chǔ)存12個(gè)月，復(fù)合酶中單酶酶活損失分別為0. 37% 和0. 50%，比對(duì)比例分別降低22. 9%和66. 7%，有效防止在包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用等環(huán)節(jié) 因環(huán)境改變、操作方法不當(dāng)而造成酶的失活，尤其可防止高溫造成的酶失活。
[0071] 8.本發(fā)明的保護(hù)劑有效減緩了復(fù)合酶制劑的回潮；同時(shí)可增強(qiáng)復(fù)合酶的耐凍、耐 熱性能，保持相同的酶活力，其耐熱溫度可提高20_30°C，耐冷凍溫度可降低10-15攝氏度， 有效防止了復(fù)合酶在運(yùn)輸、保存和使用過程中酶活力的損失，延長(zhǎng)了復(fù)合酶的保質(zhì)期，達(dá)到 同樣的酶活力，比同類產(chǎn)品保質(zhì)期可延長(zhǎng)2-3年。
[0072] 9.本發(fā)明的激活劑創(chuàng)造了酶催化作用的最佳條件，充分發(fā)揮了酶的活力，徹底有 效的分解了釀造原料中蛋白質(zhì)、淀粉、半纖維素、脂肪等大分子物質(zhì)，不僅提高了原料利用 率，而且增加醬油曲和霉菌孢子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)提供了醬油必須的香味物質(zhì)及其前體物。
【具體實(shí)施方式】
[0073] 下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0074] 實(shí)施例1原料制備
[0075] 1.植物提取物的制備：
[0076] 將大麥芽、小麥芽按質(zhì)量比5:2均勻混合，粉碎至粒度0. 8mm，得粉碎麥芽；然后 將木瓜、菠蘿、無花果分別于盛有〇. 4%的碳酸氫鈉溶液的超聲波清洗機(jī)中在功率200W、頻 率30KHz條件下超聲清洗8min，浙干，室溫下破碎至粒度0. 8mm，并按質(zhì)量比6:3:2均勻混 合，加入混合物質(zhì)量3倍的粉碎麥芽得原料混合物，加入原料混合物質(zhì)量2倍的水，用檸檬 酸調(diào)節(jié)pH值為3. 5,在功率200W、頻率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總 時(shí)間70s，進(jìn)行間隔式輻照：輻照10s，間隔10s，控制溫度30°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率 250W，頻率35KHz條件下進(jìn)行超聲波輔助提?。槐?h，然后，在功率300W、頻率2000Hz條 件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間l〇5s，進(jìn)行間隔式輻照：輻照15s，間隔10s， 控制溫度50°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率400W，頻率45KHz條件下進(jìn)行超聲波輔助提取， 最后自然降溫至室溫，于電場(chǎng)強(qiáng)度30kV/cm，脈沖時(shí)間500 μ s，脈沖頻率250Hz條件下進(jìn)行 高壓脈沖電場(chǎng)提取18min ;提取液過濾得第一濾液，加濾渣2倍的水漂洗、過濾得第二濾液， 將第一濾液和第二濾液按質(zhì)量比1:1. 5均勻混合，混合液超濾濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎即 得植物提取物；
[0077] 2.酸性蛋白酶的制備：
[0078] 所述酸性蛋白酶的制備方法包括如下步驟：
[0079] (1)菌種活化
[0080] 將保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基， 32°C培養(yǎng)40h進(jìn)行菌種活化，如此活化3次；
[0081] (2)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)
[0082] ①一級(jí)種子培養(yǎng)：將步驟（1)活化后斜面菌種以無菌水洗下孢子，接入500毫升搖 瓶中，液體種子培養(yǎng)基裝量100毫升，32°C、lOOrpm搖床培養(yǎng)40h ;
[0083] ②二級(jí)種子培養(yǎng)：將一級(jí)種子按照10%的接種量接入500毫升二級(jí)種子搖瓶中， 培養(yǎng)條件與一級(jí)種子相同；
[0084] ③三級(jí)種子培養(yǎng)：將二級(jí)種子以8%接種量接入5000毫升三級(jí)種子搖瓶中，液體 培養(yǎng)基裝量1000毫升，32°C、lOOrpm搖床培養(yǎng)40h ;
[0085] ④種子罐培養(yǎng)：將三級(jí)種子以8%接種量接入總?cè)莘e為150L的一級(jí)種子罐，種子 罐培養(yǎng)基裝量100L，控制pH值為6,培養(yǎng)溫度31°C，攪拌速度300rpm，通風(fēng)量（V/V) 1: 1，培 養(yǎng)時(shí)間40h ;
[0086] 所述種子罐發(fā)酵液菌體濃度為8. Ox 10s個(gè)/ml ;
[0087] (3)發(fā)酵罐發(fā)酵
[0088] 將步驟（2)中種子罐液體種子以5%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度32°C， 攪拌速度300r/m，通風(fēng)量（V/V) 1:1. 5,培養(yǎng)時(shí)間llh ;然后以2°C /h降溫速率緩慢降溫至 28°C，攪拌速度500r/m，通風(fēng)量（V/V) 1:2,恒溫培養(yǎng)9h ;繼續(xù)以2°C /h降溫速率緩慢降溫至 24°C，攪拌速度600r/m，通風(fēng)量（V/V)l:3,培養(yǎng)時(shí)間27h，然后，將步驟（2)中種子罐液體種 子以3%接種量追加接入發(fā)酵罐，最后以2°C /h升溫速率緩慢升溫至32°C，攪拌速度300r/ m，通風(fēng)量（V/V)l:l. 5,恒溫培養(yǎng)llh ;接著以2°C/h降溫速率緩慢降溫至24°C，攪拌速度 600r/m，通風(fēng)量（V/V) 1:3,恒溫培養(yǎng)27h ;
[0089] (4)發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性蛋白酶。
[0090] 經(jīng)上述方法制備的酸性蛋白酶在室溫下保存12個(gè)月后酶活損失為1. 8%，發(fā)酵液 酸性蛋白酶酶活力可達(dá)22000U/mL。
[0091] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物7g，干酪素4g，磷酸 氫二鉀2g，氯化鎂0. 6g，氯化鉀0. 8g，蒸餾水1000mL，pH值5. 8,121°C滅菌20min。
[0092] 所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：麩皮70g，玉米粉55g，豆餅粉38g，海藻 糖12g，魚粉8g，氯化銨1 lg，氯化鈣8g，干酪素8g，中草藥提取物8g，硫酸鎂3g，磷酸氫二鉀 2g，純凈水 1000mL，pH 值 6,121°C滅菌 20min ;
[0093] 所述種子罐培養(yǎng)基組成為：麩皮70g，玉米粉55g，豆餅粉38g，海藻糖12g，中草藥 提取物12g，魚粉8g，氯化銨llg，氯化鈣8g，干酪素8g，硫酸鎂3g，磷酸氫二鉀2g，純凈水 1000mL，pH 值 6,121°C滅菌 20min ;
[0094] 所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：麩皮70g，玉米粉55g，植物提取物50g，豆餅粉38g，中 草藥提取物25g，海藻糖20g，魚粉8g，氯化銨1 lg，氯化鈣8g，干酪素4g，硫酸鎂3g，磷酸氫 二鉀2g，硝酸鉀2g，硫酸鋅0. 2g，純凈水1000mL，pH值6,121°C滅菌20min ;
[0095] 所述中草藥提取物的制備方法如下：按重量份數(shù)計(jì)，稱取黃芪65份，當(dāng)歸55份， 黨參42份，甘草42份，魚腥草40份，神曲40份，柴胡12份，黃芩12份；將上述中草藥粉 碎至粒徑為2毫米以下，然后于容器中均勻混合并添加5倍重量的水，控制溫度80°C保持 3h，然后降溫至52°C，加入混合物料總重量8 %的混合酶制劑進(jìn)行酶解，用乳酸調(diào)節(jié)pH值 為6. 2,酶解3h，最后添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，乙醇和丙醇混合的質(zhì)量 比為1:1. 5,控制溫度至70°C保持4h，過濾，得