專利名稱：一種乳糖酸高產率的酶工藝的制作方法
技術領域：
一種乳糖酶轉化為乳糖酸工藝，該工藝具有增加了的乳糖酸產率和/或降低了的反應時間，該工藝包含添加乳品酶底物如奶、乳清或乳糖溶液，一種能將乳糖轉化為乳糖酸的糖類氧化酶、其中將工藝中的PH值控制和保持在特定的水平。
背景技術：
通常被稱為牛奶糖的乳糖是牛奶的初級糖類。在牛奶基乳品中如酸乳酪和干酪，乳糖被認為是低價值的糖類原因在于乳糖的不耐性并且還在于其還涉及褐變和結晶反應。乳糖產率占了乳清和聚集物中的整個干物質的75％，世界范圍的年產量接近120萬噸，但是沒有很多直接利用其的有利方法。
然而，乳糖可以轉化為醫(yī)藥中很有用的化合物即乳糖酸(4-o-β-D-吡喃半乳糖-D-葡萄糖酸)，此外還因為乳糖的甜酸味道而將其用在食品中。乳糖酸可以在奶制品的生產中產生并可以提供所需感官性質并且乳糖含量降低的結果產品。進一步，從本質上說，乳糖酸及其鹽類是通過乳糖的酶轉化而得的，并可將其用作特定食品產物的添加劑，如用作抗氧劑、乳化劑、食品產物中的常規(guī)酸化劑、飲食性礦物補充劑并且在干酪生產中用作干酪發(fā)酵劑培養(yǎng)物的替代物。在制藥工業(yè)中，乳糖酸是器官保存溶液的重要組分。在美容業(yè)中，乳糖酸用作常規(guī)皮膚護理液和護理霜中的活性成分。此外，乳糖酸還可用在技術應用中如，用作清凈劑中的成分。
在大多數(shù)的應用中，優(yōu)選通過乳糖的酶轉化來產生乳糖酸，并且眾所周知，糖類氧化酶能將乳糖轉化為乳糖酸。反應式如下
乳糖酸的CAS登記號為96-82-2。
WO02/089592(Kraft Foods)描述了在牛奶基奶制品的生產中使用乳糖酸的優(yōu)點，并且還描述了在牛奶基奶制品如奶酪的制備過程中，使用糖類氧化酶當場將乳糖轉化為乳糖酸的優(yōu)點。
關于奶制品制備中的優(yōu)點在于具有降低的乳糖含量(如奶中乳糖的降低)，并且在生產已加工的乳酪制品(例如批薩)可以減少褐變的問題。此外，如在乳酪的生產過程中，可將乳糖酸用于增加酸度。通常，通過用乳酸菌來發(fā)酵奶來增加酸度，該乳酸菌通過對乳糖產生新成代謝來生產乳酸。因此，通過添加乳糖酸則有可能降低乳酸菌的使用來生產相關的奶制品。
關于糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸，WO02/089592描述了將酶添加到奶制品酶底物并且接著在適宜的溫度下發(fā)酵特定的一段時間以完成酶反應。該文獻并沒有清晰地教導關于在酶反應中保持特定的pH值所具有的優(yōu)點。事實上，在反應過程中，因為產生了乳糖酸從而pH值有所降低，因此酸化了奶制品。
在WO02/089592的實施例9中，將奶用糖類氧化酶發(fā)酵一整夜。沒有任何關于控制pH值的教導。在整夜的發(fā)酵后，已處理的奶中含有1.5％的乳糖和3.2％的乳糖酸，因此提供了乳糖轉化為乳糖酸的68％的轉化率。
在實施例12B)和C)中，將奶用糖類氧化酶在55℃下發(fā)酵了48小時。在反應過程中，pH值保持了7。在這些實施例中，并沒有對此pH值控制給出解釋也沒有給出乳糖酸的產率。
WO03/037093(Novozymes)也描述了在牛奶基奶制品的制備過程中，使用糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸。對于WO02/089592這篇文獻而言，其并沒有描述關于在酶反應中保持特定的pH值所具有的優(yōu)點。僅有的特別工作實施例描述了全脂奶用氧化酶進行發(fā)酵并在40℃保持反應直到pH值為4.2。因為天然鮮奶的pH值接近6.6，可見其并沒有對pH值進行控制。
WO02/39828(Danisco)涉及了一種工藝，其中將糖類氧化酶(己醣氧化酶)溶液和乳酪撒在批薩上，并且描述了批薩乳酪具有降低褐化的優(yōu)點(術語為“梅拉德反應”)。該文獻也沒有描述關于在酶反應中保持特定的pH值所具有的優(yōu)點。
因此，在該領域中有一些文獻公開了涉及乳糖酶轉化為乳糖酸的食品生產工藝。然而，還是需要改進用于上述目的的酶工藝，特別用于實質上是乳糖酸工業(yè)生產的酶工藝。

發(fā)明內容
本發(fā)明所解決的問題是提供了一種從酶底物中將乳糖酶轉化為乳糖酸的工藝，該工藝具有增加了的乳糖酸產率和/或降低了的反應時間。產率定義為特定時間內乳糖轉化為乳糖酸的分數(shù)。因此，在本文獻中，產率等同于特定時間內的“轉化率”。在所需特定轉化率的場合中，本發(fā)明提供了一種具有降低了的反應時間的工藝。
本發(fā)明基于令人驚奇的觀察而得到的，即通過在乳糖的糖類氧化酶基酶轉化為乳糖酸的工藝中將pH值保持穩(wěn)定從而在酶轉化中獲得了較高的產率和/或降低了的反應時間。
因此，本發(fā)明的第一個方面涉及了一種乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化工藝，其獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間，所述工藝包含i)將一種糖類氧化酶添加到奶制品酶底物中，ii)對所述奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸的條件下進行發(fā)酵，iii)通過添加堿類物質使得pH值在發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定，如果使用強堿來保持pH值，則所述穩(wěn)定值不為7.0，并且因此獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間。
在該工藝的一個非常有趣的實施方式中，添加到步驟iii)中的是弱堿。進一步，一個優(yōu)選的實施方式中包含了可選擇的，在該工藝的步驟i)中添加過氧化氫酶和H2O2。
在本發(fā)明進一步的一個重要方面，上述的工藝中包含在步驟i)中添加過氧化氫酶。乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化中需要氧氣并且在轉化過程中產生了H2O2。通過添加過氧化氫酶而將所產生的H2O2轉化為氧氣。因此，當在工藝中引入過氧化氫酶時，則可降低氧氣的供應。
本發(fā)明進一步的方面在于提供了將上述任意方面的工藝作為食品生產工藝的一個集成部分。
具體實施例方式
奶制品酶底物(Dairy Substrate)術語“奶制品酶底物”應該理解為任何奶或奶類似產物的溶液/懸浮液，該奶類似產物包含乳糖，如全脂或低脂奶、脫脂奶、黃油奶、壓縮奶粉、全脂奶粉、乳清、乳清滲透物、乳糖、乳糖結晶的母液、乳清蛋白質濃縮物、或來自任何動物的乳脂。酶底物上的乳糖并不需要完全溶解，即，如反應可以在濃縮的漿液與超過反應溫度下可溶解含量的乳糖含量條件下進行。進一步，反應可在奶制品酶底物上進行，其中在部分該奶制品酶底物上有乳糖或部分該奶制品酶底物被乳糖酶水解了。在這種情況下，不僅產生了乳糖酸，而且還通過糖類氧化酶的作用還產生了半乳糖醛酸和葡萄糖酸。
優(yōu)選，奶制品酶底物是奶，更優(yōu)選是乳清或乳清餾分或乳糖溶液/懸浮液。
術語“奶”應該理解為是通過對任何哺乳動物進行擠奶而得到的乳液分泌物，該哺乳動物如奶牛、綿羊、山羊、水?；蝰橊?。
正如在此下文中所進一步描述的，本工藝特別適于乳糖酸的相對大規(guī)模生產。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所用的奶制品酶底物為50kg至500000kg。
乳糖酸(Lactobionic acid)術語“乳糖酸”應該理解為涉及乳糖酸或其鹽類。適宜的鹽類包含乳糖酸鈉鹽、乳糖酸鈣鹽、乳糖酸銨鹽和乳糖酸鉀鹽。
所選用于pH值控制的堿類可以控制所產生的乳糖酸鹽類。通過控制pH值而產生的乳糖酸鹽中，可以通過去除陽離子如使用離子交換來獲得純化乳糖酸。此外，還可以通過利用強酸如硫酸或磷酸的沉淀來去除陽離子如鈣離子。
糖類氧化酶(carbohydrate oxidase)對于本領域技術人員來說，已熟知并可獲得許多適宜的糖類氧化酶，該糖類氧化酶可以將乳糖轉化為乳糖酸。例如，可以是己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶。
目前所推薦的糖類氧化酶是微生物糖類氧化酶。
適宜的己糖氧化酶(EC1.1.3.5)在WO96/40935(Bioteknologisk Institut，丹麥)中得到了描述。該文獻中描述了來自海藻類的一種適宜己糖氧化酶，尤為特別的是，其中海藻類選自角叉菜、Iridophycus flaccidum和Euthoracristata。
其他適宜的糖類氧化酶可以源自有絲分裂孢子的果囊菌亞綱的真菌，如支頂孢菌，特別是A.strictum，如ATCC34717或T1；A.fusidioide，如IFO6813；或A.potronii，如IFO31197。在一個優(yōu)選的實施方式中，所獲得的糖類氧化酶源自Lin等和JP-A-5-84074中的公開。
在一個優(yōu)選的實施方式中，糖類氧化酶來自Microdochium真菌屬，更優(yōu)選其中真菌是Microdochium nivale，甚至更優(yōu)選是Microdochium nivaleCBS100236。在WO99/31990(Novo Nordisk A/S)中詳細地描述了該類優(yōu)選氧化酶。
氧化酶的使用量通常取決于特定的需求和特定的酶。氧化酶的添加量優(yōu)選，在特定時間內，足以產生所需程度的乳糖向乳糖酸的轉化。通常，氧化酶添加量約1-10000OXU/奶制品酶底物(kg)是足夠的，特別是約5-5000OXU/奶制品酶底物(kg)，并且更為特別是約5-100OXU/奶制品酶底物(kg)。對于特定奶制品酶底物轉化所需特定酶含量的調節(jié)在本領域技術人員的普通知識范圍內。
在文獻中，氧化酶單元(OXU)通常被定義為在特定條件下每分鐘氧化1μmol的乳糖所需的酶含量。然而，在此提供的實施例中，OXU被定義為相對一種酶標準所測得的1mg純乳糖氧化酶。
在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸條件下進行的發(fā)酵(incubating)本發(fā)明步驟i)中所得到的奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸條件下進行發(fā)酵。此類條件包含，但不限于，溫度、氧氣、糖類氧化酶的含量及特性、其他的添加劑如過氧化氫酶和反應/發(fā)酵時間。很明顯，所選擇的發(fā)酵條件將完成本發(fā)明，即在乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化中獲得了增加了的產率和/或降低了的反應時間。
通常，適宜的發(fā)酵時間使得乳糖轉化為所感興趣程度的乳糖酸。
因為乳糖轉化為乳糖酸要消耗氧氣，所以氧氣是本發(fā)明中的一個重要因素。這可以從實施例1的表中看出。因此，如果在酶反應過程中監(jiān)視氧氣，則通?？梢杂^察到，氧氣含量有個起始降低，如果如持續(xù)提供空氣，則氧氣含量在酶反應結束時會恢復起始水平。當氧氣恢復到起始水平的90％時，這就表明了酶反應已經結束或至少有了顯著的降低。因此，優(yōu)選的適宜發(fā)酵時間至少持續(xù)到發(fā)酵奶制品酶底物中氧氣含量恢復到超過起始含量的90％。特別是，所需乳糖的最大轉化率。
其后進一步描述了本發(fā)明的一個特別方面，優(yōu)選在乳糖的酶轉化過程中加入過氧化氫酶?？梢栽谌我膺m合的時候加入過氧化氫酶如在該工藝的步驟i)中。可選擇的，與過氧化氫酶一起加入H2O2。
為保持pH值恒定而加入了堿等同物，該堿等同物含量的確定也可用于監(jiān)視反應。
通常，適宜的發(fā)酵時間為1/2小時至3天，最優(yōu)選是2小時至48小時。
發(fā)酵溫度通常取決于所用的糖類氧化酶，并且選自糖類氧化酶的最優(yōu)反應溫度。然而，隨著反應溫度的升高氧氣的溶解度會降低，為了獲得最佳工藝必須要考慮其他的因素。本領域技術人員知道怎樣平衡關于如酶活性和氧氣溶解度之間的最優(yōu)溫度。通常，適宜的溫度為約0℃至約80℃。低溫，如5℃會導致相對低的反應速度，但是其具有代表了冷藏產品常規(guī)溫度的優(yōu)點。因此，可能在奶制品的生產和/或儲藏進行該反應。
適宜的氧氣源包含常壓空氣、富集氧氣的常壓空氣和純氧。在高于1個大氣壓的壓力下進行該工藝會增加氧氣的溶解度并在任何應用中都是優(yōu)選。
可以通過在發(fā)酵過程中將空氣連續(xù)混入到奶制品酶底物中來為該工藝供給氧氣。進一步，一種提供氧氣的選擇是在過氧化氫酶的存在下添加H2O2。
當工藝在利用氧氣加入非常困難的固定酶時，特別優(yōu)選使用H2O2作為氧氣源。
穩(wěn)定pH值下的發(fā)酵如上所解釋的，在此所述本發(fā)明的一個重要特征在于在發(fā)酵(步驟(ii))中通過添加堿類來保持穩(wěn)定的pH值，當使用強堿時，穩(wěn)定的pH值不是7.0。在特定的實施方式中，通過添加弱堿使得穩(wěn)定的pH值保持在約3.0至約9.0或通過添加任何堿使得穩(wěn)定的pH值保持在約3.0至約6.9和從約7.1至約9.0，如約3.0至約6.8和從約7.2至約9.0，包含從約3.0至約6.5和從約7.5至約9.0，如從約3.0至約6.0和從約8.0至約9.0。優(yōu)選，發(fā)酵所進行的時間足以使得乳糖轉化為乳糖酸的轉化率至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?.5％，該對照工藝的唯一比較區(qū)別在于其不添加足夠量的堿來保持發(fā)酵過程中的pH值。
除了不加入堿以保持pH值外，該相當?shù)膶φ展に嚺c在此所述工藝在相同的條件下進行(即相同量的相同氧化酶、相同的奶制品酶底物、相同的發(fā)酵時間、溫度和存在氧等)，在此所述的工藝在乳糖轉化為乳糖酸酶轉化中具有增大了的產率和/或降低了的反應時間。在此所用的對照組具有普通的含義，即對照組確定了保持pH值穩(wěn)定的積極效果。
對于特定所感興趣的工藝而言，正如本領域技術人員所欣賞的，優(yōu)選的穩(wěn)定pH值取決于許多因素。例如，如果所用的奶制品酶底物是奶，其天然pH值在6.6左右，則優(yōu)選將pH值保持在6.6左右，如pH值為6.3-6.9。如前所述的，因為工藝常用于最終產品的酸化，所以常規(guī)乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化中并不進行pH值的控制。在許多情況中描述了最終產品的pH值調整，例如在生產低乳糖的奶中，pH值的減少低于所需的水平。因此，純粹為了與最終產品pH值相匹配，可以進行pH值先前調整，并不如此一樣，是工藝的優(yōu)選。
根據(jù)本發(fā)明，也欣賞將乳糖酸產品或包含乳糖酸的組合物的pH值在所進行的酶轉化末期或其后調整為優(yōu)選的pH值，如當已進行了95％的乳糖所需轉化時，pH值可以降低到所需的值。pH值的降低以及空氣的鼓泡進一步使得CO2脫離奶制品酶底物。當在反應中用碳酸鹽來進行pH值控制時，這就特別的重要了。
在本文中“穩(wěn)定pH值”應該被廣義的理解為在該工藝中通過添加堿類將pH值控制和保持在特定范圍內，或接近/為特定值。
在發(fā)酵過程中pH值的控制和調整/保持是一個標準步驟，其在高度精確性下進行。因此，穩(wěn)定pH值是保持恒定的值，其變化量低于0.1個pH單位變化或甚至低于0.05個pH單位變化。根據(jù)本發(fā)明，最優(yōu)范圍由特定的酶工藝所決定，并且該pH值將以上述的精確度被控制并保持在該范圍內。在本發(fā)明的工藝中，適宜的特定pH值范圍或pH值選自約3-約9。當用強堿來進行pH值調整時，特定pH值的限制就是不能為7.0。
優(yōu)選通過添加足量的堿而將pH值保持在約5.5至6.9，更優(yōu)選為從6.0-6.9。
優(yōu)選，從酶反應起始就保持在此所述的穩(wěn)定pH值。即，將氧化酶添加到奶制品酶底物后，緊接著添加堿類以保持在此所述的穩(wěn)定pH值。
特別的是，如果需要最大的乳糖轉化率，則將在此所述的穩(wěn)定pH值保持一段時間，至少持續(xù)到發(fā)酵奶制品酶底物中氧氣量恢復為起始量的90％。
優(yōu)選，將在此所述的穩(wěn)定pH值保持30分鐘至48小時，更優(yōu)選為1小時至36小時，更為優(yōu)選從2小時至24小時。
在本工藝中，可能使用任何堿類將pH值保持在上述范圍內。原則上說，任何能中和所產生酸的物質均可用于本工藝。但是，在實際應用中，優(yōu)選使用弱堿和碳酸鹽。弱堿包含，但不限于，例如CaCO3、Na2CO3、K2CO3、(NH4)CO3和NH4OH。目前優(yōu)選的弱堿是NH4OH和CaCO3。
本領域技術人員直到許多其他可以用于本發(fā)明工藝中的堿類，例如強堿如Ca(OH)2、KOH、NaOH和Mg(OH)2。
當所用的堿是例如Ca(OH)2或CaCO3時，則有可能利用上述工藝從適宜的奶制品酶底物中來生產乳糖酸鈣鹽。接著該產品可被用作例如奶制品添加劑或在此所描述工藝中的一種成分。
因此，如上所述，優(yōu)選堿類通常是涉及最終產品所需礦物組分的堿類。在一個特別實施方式中會要求富含有鈣的奶。在這種情況下，優(yōu)選堿類為Ca(OH)2，因為碳酸鹽會對口味產生不希望的影響所以碳酸鹽并不適合。(實施例4)術語“弱”對“強”堿指的是堿類的分解能力。在本文中，弱堿被定義為pKb值至少為3.5的堿類(對于像CO32-類的雙質子堿類而言，該pKb值指的是第一步驟)。
優(yōu)選，在發(fā)酵過程(步驟(ii))中，通過添加足量的堿類來將pH值保持一段時間從而足以使得乳糖轉化為乳糖酸的轉化率至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于在發(fā)酵過程中不通過添加堿類來保持pH值，更優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?5％，甚至更優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?0％，最優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?5％。
為了說明，在此的工作實施例1和2中，對照組中乳糖轉化為乳糖酸的轉化率為41％而通過將pH值保持在5-6，則轉化率增加到90％。進一步，如實施例5所述，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，使用弱堿(例如0.5M Na2CO3)比類似工藝的反應時間降低了24％，該類似工藝是通過添加強堿(1M NaOH)來保持pH值。因此，用弱堿來代替強堿會降低本工藝的反應時間。反應時間降低了至少5％如至少25％，至少50％，或甚至至少80％。
此外，如實施例5所述，在轉化工藝結束后，發(fā)現(xiàn)殘留酶活性接近100％。這就公開了可能操作，在一批新料中重新利用酶，例如通過膜過濾來回收酶。
本發(fā)明的一個特別方面，下述步驟所定義的一種乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化工藝，其獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間，所述步驟i)將一種糖類氧化酶添加到奶制品酶底物中，ii)對所述奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸的條件下進行發(fā)酵，iii)通過添加弱堿(A)使得pH值在發(fā)酵過程中保持為約3.0至約9.0或通過使用任意堿類(B)使得上述pH值保持為約3.0至6.9和7.1至約9.0，并且因此獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間。
因此，從上文描述和在此所提供的實施例中可以看出，本發(fā)明對于乳糖工業(yè)轉化為乳糖酸是很有價值的，原因在于本工藝所定義的特征使得可以進行乳糖酸的經濟性生產。基于本發(fā)明公開的變化、改進、適應性改進都是被欣賞的，并且在本發(fā)明的范圍和精神之內。
很明顯，所公開的工藝使用于本質上是乳糖酸的工業(yè)生產。然而，該工藝也可以組成奶制品制備的生產工藝中的一部分，該奶制品如乳酪、酸奶、奶等等。
乳糖酸的純化可選擇的，可能以任何適宜的方法來純化乳糖酸以獲得所需乳糖酸純度的乳糖酸產品或包含乳糖酸的組合物。
本領域技術人員知道如何進行純化，并且取決于特定所感興趣的需要，可以獲得含有至少30％乳糖酸的組合物，至少為90％的乳糖酸或甚至是95％或99％的乳糖酸。
純化乳糖酸的適宜方法包含過濾、離子交換、濃縮和干燥。
含有乳糖酸的組合物可作為食品添加劑或食品成分而用在食品產品的生產中。此外，該組合物還可具有如上所述的其他應用。
含有乳酸菌的發(fā)酵液培養(yǎng)物通常，按照特定的需求在此所述的工藝中還包含附加的元素或成分。本領域技術人員知道所需的很多此類附加元素或成分。
在一個優(yōu)選的實施方式中，在此所述的工藝中包含了含有乳酸菌的發(fā)酵液培養(yǎng)物?？梢栽谀讨破访傅孜锾砑友趸盖盎蚝螅尤氚l(fā)酵液培養(yǎng)物，并且可任選將過氧化氫酶加入到酶底物中。這取決于所感興趣的特定發(fā)酵分布。
在此的術語“乳酸菌”指的是革蘭氏陽性菌、非孢子菌類，其進行糖類的乳酸發(fā)酵。
在其他，其包含乳酸菌類，其屬于乳酸桿菌類例如瑞士乳酸桿菌、保加利亞德爾布呂克乳酸桿菌亞類等等，屬于乳球菌類，如乳酸乳球菌，乳酸菌屬于鏈狀球菌類，如唾液鏈狀球菌，乳酸菌屬于明串珠菌類，如乳酸明串珠菌。乳酸菌屬于雙歧桿菌類，如長雙歧桿菌或短雙歧桿菌，乳酸菌屬于小球菌類。
乳酸菌可以和其他微生物如酵母菌混合來使用。
過氧化氫酶(catalase)過氧化氫酶是一種催化下式反應的酶。EC號是EC1.11.1.6。
如在此的工作實施例3所示，過氧化氫酶的使用顯著的改進了乳糖轉化為乳糖酸的轉化率。此外，過氧化氫酶的使用減少了乳糖轉化為乳糖酸過程中所產生的H2O2。
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，將過氧化氫酶加入到了本發(fā)明的工藝中。
如上所述，當糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸時會產生H2O2。反應式如下所述
可以在糖類氧化酶反應產生乳糖酸后加入過氧化氫酶。然而，優(yōu)選，在本工藝的步驟(i)與糖類氧化酶一起加入過氧化氫酶。在本工藝的步驟(i)與糖類氧化酶一起加入過氧化氫酶的優(yōu)點在于氧需求量會顯著降低(達到50％)。因此，供應氧，例如以空氣的形式，會顯著的降低。實際上，如果與H2O2一起加入了足夠量的過氧化氫酶，就沒必要供應額外的氧氣了例如以空氣的形式。該額外添加H2O2可以來自任何經濟性的來源。
因此，一個優(yōu)選的實施方式中，基本上在本工藝的步驟(ii)中所需的全部氧氣可以通過添加額外H2O2來獲得并且其中過氧化氫酶通過轉化可用的H2O2來產生所需的氧氣。
在本文中，“基本上所有的氧氣”這樣的表達用來描述了酶反應充分進行所需供應的氧氣，并且特別是在發(fā)酵過程中不需要主動加入額外的氧氣，例如在發(fā)酵中連續(xù)將空氣混入到奶制品酶底物中。
一個優(yōu)選實施方式中，通過添加足量的堿類來將發(fā)酵過程中的pH值保持一段時間從而足以使得乳糖轉化為乳糖酸的轉化率至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?.5％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于在發(fā)酵過程中不通過添加堿類來保持pH值。
一個優(yōu)選實施方式中，在工藝的步驟(i)中加入了過氧化氫酶，與不加入過氧化氫酶的類似工藝相比，該過氧化氫酶的加入量足以降低H2O2的濃度。
優(yōu)選，過氧化氫酶的添加量還可以改進乳糖轉化為乳糖酸的轉化率。
本領域技術人員已知許多適宜的過氧化氫酶。例如，來自Novozymes A/S的商業(yè)可夠過氧化氫酶Catazyme。
在此所述工藝中過氧化氫酶的添加量通常取決于最終產品所需H2O2的量。因此，取決于所感興趣的特別奶制品，特別是如果奶制品是奶時，在此所述工藝中所添加的過氧化氫酶的量足以使得H2O2的含量至少比相當?shù)膶φ展に囅陆盗?0％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于不加入過氧化氫酶。
更優(yōu)選，在此所述工藝中所添加的過氧化氫酶的量足以使得H2O2的含量至少比相當?shù)膶φ展に囅陆盗?5％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于不加入過氧化氫酶，甚至更優(yōu)選，在此所述工藝中所添加的過氧化氫酶的量足以使得H2O2的含量至少比相當?shù)膶φ展に囅陆盗?5％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于不加入過氧化氫酶。
除了不加入過氧化氫酶以外，該相當?shù)膶φ展に嚺c在此所述用于改進乳糖酸的工藝在相同的條件下進行(即相同量的相同氧化酶、相同的奶制品酶底物、相同的發(fā)酵時間、溫度、存在氧以及加入堿類等)。在此所用的對照組具有普通的含義，因為對照組確定了加入過氧化氫酶的積極效果。
在本發(fā)明的一個單獨方面，涉及了一種乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化工藝，其獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間，所述工藝包含將一種糖類氧化酶和一種過氧化氫酶添加到奶制品酶底物中，對所述奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸的條件下進行發(fā)酵通過添加堿類物質使得pH值在發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定，并且因此獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間。
在此所描述的所有實施方式，關于本發(fā)明的第一方面也是關于本發(fā)明該單獨方面的優(yōu)選實施方式。
制備奶制品的工藝如上所述，根據(jù)本發(fā)明任一方面的工藝可以是任何其它工藝的集成部分，例如在食品生產工藝中，如奶制品制備工藝中，其中需要將乳糖轉化為乳糖酸。因此，利用本發(fā)明可以得到最終食品產品。此外，根據(jù)本發(fā)明工藝所生產的包含乳糖酸的組合物可以用在例如奶制品的生產中。本領域技術人員知道此類乳糖酸和包含乳糖酸的組合物的相關用途，并且可以參考上述的先前技術以及在本發(fā)明背景技術部分所提到的應用。因此，一旦通過本工藝獲得了包含乳糖酸組合物或本質上是乳糖酸的產品，則可以用任意適宜的方式來利用該組合物或產品。
術語“奶制品”應被理解為如上所定義的，包含奶制品酶底物的任何奶制品。應用在本發(fā)明中的奶制品實施例是像酸奶、奶這類的，例如富含鈣的奶和乳酪如混合干酪(例如用在批薩中)，奶乳酪和小乳酪。
在此所描述的所有實施方式，關于本發(fā)明的先前方面也是關于本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方式。
已經對本發(fā)明工藝的方面和實施方式作了一般性的描述，在此要用特別實施例對本發(fā)明進行描述。這些實施例進一步描述了發(fā)明的不同特征和優(yōu)點，但是目的并不在于限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1以大型試驗方式用了400kg含有6％乳清滲透性粉末(來自EPI，法國)的酶底物溶液進行了試驗。溫度調整到49℃。所用的糖類氧化酶用量相對于400升溶液中的40000OXU，即使用了1250g的酶溶液。如專利WO9931990中所描述的，從Microdochium nivale中獲得了酶。在文獻中，一個氧化酶單元(OXU)通常定義為在特定條件下每分鐘氧化1μmol的乳糖所需的酶含量。然而，在此提供的實施例中，OXU被定義為相對一種酶標準所測得的1mg純乳糖氧化酶。
通過監(jiān)視溶液的pH值和氧氣張力來進行反應。利用泵湍流(Landia泵5.5kWh)通過將酶底物循環(huán)回到箱中而將空氣混入到酶底物中。
當氧氣恢復量＞90％時，反應結束，并將產品加熱到85℃以進行酶滅活。在反應中取出樣本，并且將其加熱到85℃以進行酶滅活。
在加入酶前，酶底物溶液的pH值是6.52。在反應結束后(反應時間為5個小時)pH值降低到3.62。在時間＝0時，酶底物中氧氣含量為5.82mg/L，在酶加入后的5分鐘內，其降低到小于0.5mg/L。可從下表中看來自實驗的數(shù)據(jù)。

氧氣含量的單位是mg/L。
乳糖轉化為乳糖酸的轉化率為41％。
實施例2與實施例1類似，將833g(相對應于26700OXU)糖類氧化酶加入到166kg的酶底物中。所用的氧化酶與實施例1相同。通過加入5N NaOH溶液將pH值保持在5-6。當氧氣含量恢復到起始水平時(5個小時后)，總共用了3910mL用于pH值控制的5N NaOH溶液。根據(jù)下述反應式，該使用量相對應于乳糖轉化為乳糖酸的轉化率＞90％，其中NaOH用來中和所產生的酸。
實施例3與實施例1類似，將441g(相對應于14100OXU)糖類氧化酶溶液和39g過氧化氫酶25L加入到166kg的酶底物中。所用的氧化酶與實施例1相同。氧化氫酶為來自Novozymes A/S的Catazyme。
過加入5N的NaOH溶液將pH值保持在5-6。當氧氣含量恢復到起始水平時(4小時40分鐘后)，總共用了4860g用于pH值控制的5N NaOH溶液。該使用量相對應于乳糖轉化為乳糖酸的轉化率為100％。
實施例4目標目標是要測試生產富含Ca奶的方法，其在奶的乳糖氧化酶催化反應中添加Ca(OH)2并保持了pH值。在不同堿性添加劑中進行了取樣并將奶進行了熱處理和評估(口感和穩(wěn)定性)。
方法酶底物脫脂奶1.5kg溫度50℃新鮮空氣流過攪動酶底物的表面酶是M.nivale所制備的一種糖類氧化酶，其為0.085OXU/g的溶液＝3.98g的酶溶液。
所用氧化酶與實施例1相同。
過氧化氫酶25L劑量是0.5g(來自Novozymes A/S的Catazyme)。
如下所述，將氧化酶和過氧化氫酶添加到酶底物中并進行發(fā)酵。
通過添加1N Ca(OH)2來使得pH值保持恒定。
在堿消耗量為22.2mL和41.15mL后，取了100mL的樣，并在85℃加熱了15分鐘。
冷卻樣品后測試了其口味和穩(wěn)定性。
結果50℃下脫脂奶的pH值為6.65，該值作為pH滴定單元的原點。
室溫下測得樣品pH值為6.76和6.88。
樣品均不呈現(xiàn)顆粒狀或均未發(fā)現(xiàn)沉積物。最后的樣品似乎有輕微的粘著。所有樣品的口感都良好，均未檢測到風味不對。
在添加了Ca(OH)2后，奶中Ca的含量有所增加樣品148％樣品288％所用堿量對應的乳糖到LBA的轉化率為樣品122.2mL對應于11％的轉化率樣品241.15mL對應于20％的轉化率結論本實施例說明了，只要在滴定設備中添加堿類來保持pH值恒定，則通過在乳糖轉化為乳糖酸的酶氧化過程中添加Ca(OH)2就可以制備出沒有口味缺點的富Ca奶。Ca在脫脂奶中的富集量可以達到88％。該量遠遠超過了奶飲料的正常目標值。
實施例5目標目標是要測試在乳糖轉化為乳糖酸的乳糖氧化酶催化氧化的pH值控制中使用不同堿類的效果。
方法在實驗室規(guī)模工作體積為1.0L的生物反應器中進行實驗。該反應器中裝有兩個Rushton攪拌器，其工作速率為1000轉/分鐘(RPM)。用Mettler-Toledo極譜法傳感器來測量溶解氧氣，通過分別控制氮氣和空氣的兩個質量物流控制器來進行回料控制從而將溶解氧控制在44.1％(相對于38℃時與空氣的飽和度)。物流總流速設定為200mL/分鐘。
酶底物1.0L水性50g/L乳糖以及50mMHPO42-/H2PO4-的緩沖液溫度38℃pH通過添加堿類來測定并保持恒定為6.40。
酶是M.nivale所制備的一種糖類氧化酶，其為60OXU/g的溶液。過氧化氫酶25L劑量是0.25g(來自Novozymes A/S的Catazyme)。通過監(jiān)控用于pH值調節(jié)的堿含量來追蹤反應速度以及反應的變化。
結果在其他方面均相同的實驗中，用了五種不同的堿類來進行中和。在所有的5個實驗中，乳糖的轉化率(通過加入堿量來計算)為100％。然而，總反應時間取決于所用堿的堿度，參見下表。使用如NaOH類強堿的反應時間要長于使用類似NH3或CO32-弱堿的反應時間。當使用NaOH時，反應速率會隨著時間下降，而使用NH3或CO32-時則不會出現(xiàn)這種情況(在乳糖耗盡前)。這反映在相對于表中所給時間＝0時的殘留活度。
結論該實施例說明了使用弱堿進行中和具有很大的優(yōu)點。
權利要求
1.一種乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化工藝，其獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間，所述工藝包含i)將一種糖類氧化酶添加到奶制品酶底物中，ii)對所述奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸的條件下進行發(fā)酵，iii)通過添加堿類物質使得pH值在發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定，如果使用強堿來保持pH值，則所述穩(wěn)定值不為7.0，并且因此獲得了所述的增高了的產率和/或降低了的反應時間。
2.一種如權利要求1所述的工藝，進一步包含純化乳糖酸的步驟以獲得基本純的乳糖酸產品。
3.一種如權利要求1或2所述的工藝，進一步包含在一批新料中重新利用添加到步驟i)中的糖類氧化酶。
4.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中堿類是弱堿。
5.一種如權利要求4所述的工藝，其中弱堿是Na2CO3或NH4OH。
6.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中奶制品酶底物是奶并且堿類是CaOH2。
7.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中發(fā)酵所進行的時間足以使得乳糖轉化為乳糖酸的轉化率至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?.5％，該對照工藝的唯一比較區(qū)別在于其在發(fā)酵過程中不保持pH值。
8.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中奶制品酶底物是奶、乳清或乳清餾分或乳糖溶液/懸浮液。
9.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中糖類氧化酶是微生物糖類氧化酶。
10.一種如權利要求9所述的工藝，其中糖類氧化酶是來自Microdochium真菌屬的真菌，更優(yōu)選其中真菌是Microdochium nivale，并且甚至更優(yōu)選為Microdochium nivale CBS100236。
11.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中氧化酶添加量為0.1-1000OXU/kg奶制品酶底物，更優(yōu)選為1-500OXU/kg奶制品酶底物，并且更為優(yōu)選的是約5-100OXU/kg奶制品酶底物。
12.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中步驟ii)的條件選自溫度、氧氣添加、糖類氧化酶的類型及使用量、過氧化氫酶的類型及使用量和時間。
13.一種如權利要求12所述的工藝，溫度為0℃至80℃。
14.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中通過添加足量的堿類來將步驟iii)的pH值保持一段時間從而足以使得乳糖轉化為乳糖酸的轉化率至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于在發(fā)酵過程中不通過添加足量的堿類來保持pH值，更優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?5％，甚至更優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?0％，最優(yōu)選至少比相當?shù)膶φ展に嚫叱?5％。
15.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中通過添加足量的堿類使得pH值保持在3.0至6.9和從7.1至9.0，更優(yōu)選如5.0至6.9和從7.1至8。
16.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中在酶反應初期保持穩(wěn)定的pH值，當進行了95％的乳糖所需轉化時，pH值可以降低到所需的水平。
17.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中將pH值穩(wěn)定保持一段時間至少使得發(fā)酵奶制品酶底物中氧氣恢復到超過90％的起始水平。
18.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中在此所述的穩(wěn)定pH值保持30分鐘至48小時，更優(yōu)選為1小時至36小時，更為優(yōu)選從2小時至24小時。
19.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中在工藝步驟(i)中所加入的過氧化氫酶的量可以減少乳糖轉化過程所產生的H2O2。
20.一種如權利要求19所述的工藝，其中所添加的過氧化氫酶的量足以使得H2O2的含量至少比相當?shù)膶φ展に囅陆盗?0％，該對照工藝的唯一區(qū)別在于不加入過氧化氫酶。
21.一種如權利要求19或20所述的工藝，其中基本上在步驟(ii)中所需適宜量的全部氧氣可以通過添加額外適量的H2O2來獲得并且其中過氧化氫酶通過轉化可用的H2O2來產生所需的氧氣。
22.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中可選擇純化使得組合物中含有至少30％的乳糖酸或至少90％的乳糖酸。
23.一種如前任意一項權利要求所述的工藝，其中該工藝中包含了含有乳酸菌的發(fā)酵液培養(yǎng)物并且其中可以在奶制品酶底物添加氧化酶前或后，加入發(fā)酵液培養(yǎng)物。
24.一種乳糖轉化為乳糖酸的酶轉化工藝，其獲得了增高了的產率和/或降低了的反應時間，所述工藝包含i)將一種糖類氧化酶和一種過氧化氫酶添加到奶制品酶底物中，ii)對所述奶制品酶底物在使得糖類氧化酶將乳糖轉化為乳糖酸的條件下進行發(fā)酵iii)通過添加堿類物質使得pH值在發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定，并且因此獲得了所述的增高了的產率和/或降低了的反應時間。
25.一種根據(jù)權利要求1-24中任意一項權利要求所述的工藝是食品生產工藝的一個集成部分。
26.一種如權利要求24所述的工藝，其中食品生產工藝是生產奶制品的工藝如酸奶、奶這類的，例如富含鈣的奶和乳酪如混合干酪(例如用在批薩中)，奶乳酪和小乳酪(cottage cheese)。
全文摘要
一種乳糖酶轉化為乳糖酸工藝，該工藝具有增加了的乳糖酸產率和/或降低了的反應時間，該工藝包含添加乳品酶底物如奶、乳清或乳糖溶液，一種能將乳糖轉化為乳糖酸的糖類氧化酶、其中在pH值穩(wěn)定控制下進行該工藝。
文檔編號A23C17/02GK1976593SQ200580013997
公開日2007年6月6日 申請日期2005年5月2日 優(yōu)先權日2004年5月3日
發(fā)明者P·布茨, J·T·溫德勒夫, P·M·尼爾森, I·阿希, M·努德奎斯特 申請人:科·漢森有限公司, 諾維信有限公司, 諾維信北美有限公司