一種耐高溫的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種耐高溫的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶突變 體及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]飼料中存在相當(dāng)多的非淀粉多糖（Non-starchPolysaccharides,NSPs)，是由纖 維素、半纖維素、果膠和抗性淀粉四部分組成的植物組織中除淀粉以外所有碳水化合物的 總稱。NSPs不僅對單胃動物沒有營養(yǎng)價值，而且還成為腸道內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子，其在動物腸道 內(nèi)能夠結(jié)合大量的水，增大了食糜粘度，影響了消化酶活性，刺激消化管代償性增大，導(dǎo)致 腸道有害菌過度繁殖，降低了腸道對養(yǎng)分的吸收速度。果膠作為一種非淀粉多糖，在單胃動 物營養(yǎng)中被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子直接影響了畜禽的營養(yǎng)吸收和利用等，進(jìn)而甚至影響動 物的生產(chǎn)性能（Choct，1997)。與單胃動物不同，果膠除了作為反芻動物飼料的組成成分而 發(fā)揮其營養(yǎng)供能作用外，還對瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有極強(qiáng)的調(diào)控作用，因此，果膠在反芻動 物瘤胃中的降解對瘤胃環(huán)境的維護(hù)有非常有益的作用。
[0003] 多聚半乳糖醛酸酶（EC3. 2. 1. 15)是以果膠的主鏈多聚半乳糖醛酸為底物，斷裂 a-1，4糖苷鍵的解聚酶。飼料用酶制劑通常需要經(jīng)過質(zhì)粒（瞬時高溫）的加工過程，而多 聚半乳糖醛酸酶屬于中低溫酶（多用于果汁的澄清和提?。?，熱穩(wěn)定性差不僅限制了其應(yīng) 用范圍，而且易于失活，增加了生產(chǎn)成本。
[0004] 酶分子的耐熱性提高可以用T5(l、T1/2和Tm值來體現(xiàn)。T5(|，即最大酶活力的一半所 對應(yīng)的溫度，T5(l越大，則酶越耐熱；T1/2 (亦稱半衰期），即在特定溫度下，酶活力損失一半所 需要的時間，半衰期越長，則酶穩(wěn)定性越好；Tm值，即蛋白質(zhì)解折疊一半時所對應(yīng)的溫度， Tm值越高，則酶越穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種耐高溫的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶突變體。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008] 所述突變體氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0009]MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVI FSGKTSFGYKEWAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPV QAFSINGAENLGVYDVHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGL SIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSAVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTN GVPITDLTVKGVTGTVKSGATRVYILCAKGACSNWKffSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC
[0010] 所述耐高溫多聚半乳糖醛酸酶突變體核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011]ATGATTCCGTCGGTCCTCATTCTTTCCCTCGGCGCCCTGGCGGCGGCCAACCCGCTCCCCGCCAAGCGC GCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACAT CACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGGCACCAAGGTCATCTTCTCCGGCAAGACCT CCTTCGGCTACAAGGAATGGGCCGGGCCTCTCATCTCCGTCTCCGGCAACAACATCCACGTCGAGGGCGCCCCCGGC CATGTCATCGACGGCAACGGTGCCAAGTGGTGGGACACCAAGGGTAGCAATGGCGGCAAGAAGAAGCCCAAGTTCTT CTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAGGGACTCAACGTGAAGAACACGCCCGTCCAGGCCTTCAGCATCA ACGGCGCTGAAAACCTCGGAGTGTACGACGTCCACCTCGACAACTCGGCCGGCGACTCCCAGGGCGGCCACAACACC GACGCGTTCGACGTCGGTTCGTCCAACGGCGTCTACATCTCGGGTGCCGTGGTCAAGAACCAGGACGACTGCCTGGC CATCAACTCCGGCACCAACATCACCTTCACCGGCGGCTCGTGCAGCGGCGGCCACGGCCTGTCCATCGGCTCGGTCG GCGGGCGCAAGGACAACACGGTCAAGACGGTGCGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGCGTGCGC ATCAAGACCGTCTACGGCGCCAAGGGCTCCGTGTCGGCTGTCGAGTACTCGGGCATCACACTGTCCAACATCAGCAA GTACGGCATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCTCGCCCACCGGCAAGCCCACCAACGGCGTGCCCATCACCG ACCTGACCGTCAAGGGCGTCACCGGCACCGTCAAGTCGGGCGCCACCAGAGTCTACATCCTCTGCGCCAAGGGCGCC TGCTCCAACTGGAAGTGGTCTGGCGTCAGCGTCACCGGCGGCAAGAAGTCGTCCAAGTGCTCCAACGTTCCCAGCCC TGCCTCTTGCTAG
[0012] 去除信號肽后成熟的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] NPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFS GKTSFGYKEWAGP LISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVKNTPVQAFSINGAENLGVYD VHLDNSAGDSQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCSGGHGLSIGSVGGRKDNTVKT VRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSAVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPTGKPTNGVPITDLTVKGVTGT VKSGATRVYILCAKGACSNWKWSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC
[0014] 成熟的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶突變體編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 不〇
[0015] AACCCGCTCCCCGCCAAGCGCGCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAG AGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACATCACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGG CACCAAGGTCATCTTCTCCGGCAAGACCTCCTTCGGCTACAAGGAATGGGCCGGGCCTCTCATCTCCGTCTCCGGCA ACAACATCCACGTCGAGGGCGCCCCCGGCCATGTCATCGACGGCAACGGTGCCAAGTGGTGGGACACCAAGGGTAGC AATGGCGGCAAGAAGAAGCCCAAGTTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAGGGACTCAACGTGAA GAACACGCCCGTCCAGGCCTTCAGCATCAACGGCGCTGAAAACCTCGGAGTGTACGACGTCCACCTCGACAACTCGG CCGGCGACTCCCAGGGCGGCCACAACACCGACGCGTTCGACGTCGGTTCGTCCAACGGCGTCTACATCTCGGGTGCC GTGGTCAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCCGGCACCAACATCACCTTCACCGGCGGCTCGTGCAGCGG CGGCCACGGCCTGTCCATCGGCTCGGTCGGCGGGCGCAAGGACAACACGGTCAAGACGGTGCGCATCCTCAACTCGT CCATCAGCAACTCGCAGAACGGCGTGCGCATCAAGACCGTCTACGGCGCCAAGGGCTCCGTGTCGGCTGTCGAGTAC TCGGGCATCACACTGTCCAACATCAGCAAGTACGGCATCGTCATCGAGCAGGACTACGAGAACGGCTCGCCCACCGG CAAGCCCACCAACGGCGTGCCCATCACCGACCTGACCGTCAAGGGCGTCACCGGCACCGTCAAGTCGGGCGCCACCA GAGTCTACATCCTCTGCGCCAAGGGCGCCTGCTCCAACTGGAAGTGGTCTGGCGTCAGCGTCACCGGCGGCAAGAAG TCGTCCAAGTGCTCCAACGTTCCCAGCCCTGCCTCTTGCTAG
[0016] 突變前的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0017] MIPSVLILSLGALAAANPLPAKRASCTFTDAASAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTK VIFSGKTSFGYKEffAGPLISVSGNNIHVEGAPGHVIDGNGAKWWDTKGSNGGKKKPKFFYAHSMKNSNIKGLNVK NTPVQAFSINGAENLGVYDVHLDNSA⑶SQGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAWKNQDDCLAINSGTNITFTGGSCS GGHGLSIGSVGGRKDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGAKGSVSDVEYSGITLSNISKYGIVIEQDYENGSPT GKPTNGVPITDLTVKGVTGTVKSGATDVYILCAKGACSNWKffSGVSVTGGKKSSKCSNVPSPASC
[0018] 突變前的毛殼菌多聚半乳糖醛酸酶的編碼序列如SEQIDNO. 6所示。
[0019]ATGATTCCGTCGGTCCTCATTCTTTCCCTCGGCGCCCTGGCGGCGGCCAACCCGCTCCCCGCCAAGCGC GCGAGCTGCACCTTTACCGATGCTGCCTCTGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTCAAGGACAT CACCGTCCCCGCCGGCACCACGTTGGACCTCACAAAGCTCAACGACGGCACCAAGGTC