一種3d細(xì)胞培養(yǎng)材料及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于材料化學(xué)與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的材料及其應(yīng)生。
【背景技術(shù)】
[0002]三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimens1nalcell culture, TDCC )是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中迀移、生長，構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。
[0003]三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有著重要的應(yīng)用。普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生逐漸喪失了原有的性狀，往往和體內(nèi)情況不相符，而動物實驗完全在體內(nèi)進(jìn)行，但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化，難以研宄單一過程，且難以研宄中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術(shù)，既能最大程度的模擬體內(nèi)環(huán)境，又能展現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。
[0004]腫瘤生物學(xué):腫瘤的實驗性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機制、腫瘤的血管形成和營養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達(dá)、測試藥物對腫瘤生長和向鄰近組織轉(zhuǎn)移的抑制效果的模擬等方面。
[0005]軟骨和骨組織:成熟的軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng)，以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關(guān)節(jié)半月板。
[0006]循環(huán)系統(tǒng)和心臟:在成熟的組織中及時產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)是組織工程的重要課題；在治療領(lǐng)域，所關(guān)心的也是如何有目的地改變血管形成，以抑制腫瘤的進(jìn)展。
[0007]神經(jīng)系統(tǒng):培植單一神經(jīng)元成為多細(xì)胞聚集體、海馬體活標(biāo)本切片后測試神經(jīng)元電勢、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)治療老年癡呆癥、帕金森病等。
[0008]可見細(xì)胞培養(yǎng)對生物醫(yī)療領(lǐng)域具有重大的意義。
[0009]目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器研制進(jìn)展迅速，而且種類多樣，各有不同特點，都是以不同的方式提供給細(xì)胞最適宜的生長環(huán)境，目前較有代表性的有攪拌式、中空纖維、旋轉(zhuǎn)等各種生物反應(yīng)器。但到目前為止，針對腫瘤細(xì)胞，干細(xì)胞分化的抑制和培養(yǎng)具有良好的效果。但是針對不同的原代哺乳動物細(xì)胞，具體的微環(huán)境大小，細(xì)胞因子組合，以及微環(huán)境PH調(diào)節(jié)等等，特異性細(xì)胞的生長條件需要進(jìn)一步設(shè)計具體產(chǎn)品。仍然沒有一種細(xì)胞支架能完全同時滿足多種細(xì)胞快速、高活力生長，且能滿足干細(xì)胞有增殖過程中有效維持細(xì)胞干性的需要。
[0010]有鑒于此，有必要對現(xiàn)有三維細(xì)胞培養(yǎng)材料進(jìn)行了改進(jìn)，以解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供一種三維細(xì)胞培養(yǎng)材料。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供上述三維細(xì)胞培養(yǎng)材料的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是: 一種三維細(xì)胞培養(yǎng)材料，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制備方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制備方法:
1)烷基化:取粒徑為15~25nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應(yīng)16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護(hù)膜；
2)將烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液混合，并通過氬氣排除氧氣，再加入金屬鹽，混勻在55?65°C條件下攪拌催化反應(yīng)I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制備方法與上述PEG80000 Fe3O4的制備方法相同，除了將磷酸化PEG8000改用為磷酸化PEG400，其他均不變。
[0014]進(jìn)一步的，上述三維細(xì)胞培養(yǎng)材料還包括納米粒NH2OFe3O4,其制備方法為:
O烷基化:取粒徑為100~200nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應(yīng)16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護(hù)膜；
2)氨基化:取上述烷基化后的Fe3O4納米球加入到含氫氧化鈉的氨水溶液中，混勻，使反應(yīng)完全，即得氨基化的納米粒NH2OFe3O4;
或者將烷基化后的Fe3O4納米球加入純正硅酸乙酯中，于14?18°C磁力攪拌18?22h對納米粒進(jìn)行包埋，洗脫包埋后的納米顆粒，置于含氫氧化鈉的氨水中反應(yīng)完全，即得氨基化的納米粒NH2OFe3O40
[0015]進(jìn)一步的，上述有機物的氨水溶液中有機物的濃度為180?220g/L ;所述有機物為順式十八碳-9-烯酸。
[0016]進(jìn)一步的，上述步驟2)中烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液的質(zhì)量體積比為10g: (350-450)mL ;所述磷酸化PEG8000水溶液中PEG8000濃度為0.2-0.3g/mL。
[0017]進(jìn)一步的，上述步驟2)中所述金屬鹽為CoCl2，金屬鹽加入量為使其終濃度為0.18—0.22mol/Lo
[0018]進(jìn)一步的，上述所制得的PEG80000 Fe3O4、PEG400@ Fe3O4分別經(jīng)紅外線滅菌后，再用稀鹽酸清洗，洗后分別保存在PBS緩沖液中，備用。
[0019]進(jìn)一步的，上述步驟2)中所述含氫氧化鈉的氨水溶液中的氫氧化鈉濃度為1.8?2.2%w/v0
[0020]三維細(xì)胞培養(yǎng)材料的應(yīng)用，應(yīng)用過程中的具體操作包括以下步驟:
1)取權(quán)利要求1中所述的PEG8000@Fe304、PEG400@Fe3O4溶解到細(xì)胞培養(yǎng)基中，
2)將步驟I)中的培養(yǎng)基經(jīng)超聲波處理3~5min制備細(xì)胞培養(yǎng)空腔；
3 )將需要培養(yǎng)的細(xì)胞加入到上述經(jīng)超聲波處理后的培養(yǎng)基中，混勻，在常規(guī)培養(yǎng)條下進(jìn)行培養(yǎng)即可。
[0021]進(jìn)一步的，上述步驟I)中所述PEG8000@Fe304、PEG4000 Fe3O4、細(xì)胞培養(yǎng)基的用量比為(22?27) mg:(8?12) mg:(15?30) mL。
[0022]進(jìn)一步的，在上述步驟I)的操作過程中，根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞的需求，可以將培養(yǎng)過程中需加入的細(xì)胞因子先與權(quán)利要求2所述的納米粒NH2OFe3O4進(jìn)行反應(yīng)，制得納米粒狀的細(xì)胞因子OFe3O4,再將細(xì)胞因子OFe3O4與PEG8000@Fe 304、PEG4000 Fe3O4—起加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中；
上述細(xì)胞因子OFe3O4的具體制備過程為:將權(quán)利要求2所述納米粒NH2OFe3O4和細(xì)胞因子加入甲醛溶液或者戊二醛溶液中，混勻，反應(yīng)完全即可。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:
I)控制細(xì)胞微環(huán)境的變化是模擬細(xì)胞活體離體培養(yǎng)、抑制細(xì)胞分化、保持細(xì)胞活性大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明三維細(xì)胞培養(yǎng)材料對腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞分化的抑制和培養(yǎng)具有良好的效果；且可滿足對不同的原代哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0024]2)本發(fā)明三維細(xì)胞培養(yǎng)材料可長時間保持微環(huán)境pH和細(xì)胞因子活性和濃度，更有利于細(xì)胞的快速生長、增殖以及細(xì)胞活的維持。在本發(fā)明中，三維細(xì)胞培養(yǎng)材料中納米粒NH2OFe3O4方便、容易的固定細(xì)胞因子，束膠的外殘基能以氫鍵在低濃度戊二醛的條件下結(jié)合細(xì)胞因子蛋白。防止了蛋白在水基中游離產(chǎn)生培養(yǎng)效率的低下。
[0025]3)在本發(fā)明中，PEG束膠的羥基端結(jié)合納米Fe磁珠，在培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行下一步的細(xì)胞治療或者其他分子生物學(xué)實驗，傳統(tǒng)的分離膠原和細(xì)胞的方法，無比復(fù)雜并且極端傷害細(xì)胞。本專利通過磁珠聯(lián)合束膠，在磁場的作用下，沒有磁性的細(xì)胞會游離到水基中。
[0026]4)本發(fā)明的3D細(xì)胞培養(yǎng)束膠構(gòu)造的羥基端帶上納米磁珠。便于細(xì)胞脫膠，將培養(yǎng)好的細(xì)胞完好地的釋放到水基中。
[0027]5)腫瘤細(xì)胞可以通過自分泌和旁分泌，改變和維持自身生存和發(fā)展的條件，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。干細(xì)胞龕(the stem cell niche)是干細(xì)胞的集中存儲部位，通過特定的細(xì)胞外基質(zhì)和龕細(xì)胞提供特殊的微環(huán)境，對維持干細(xì)胞的高增殖力和誘導(dǎo)定向分化起關(guān)鍵作用。原代細(xì)胞在活體特定部位也有其特定的培養(yǎng)條件。本發(fā)明3D培養(yǎng)材料采用PEG為基本結(jié)構(gòu)，惰性強，pH值穩(wěn)定，在形成的三維微環(huán)境中可以保持腫瘤所需要的生長因子作用活性；保持三維微環(huán)境中保持干細(xì)胞干性的細(xì)胞因子。也能長時間地維持模擬原代細(xì)胞生長的微環(huán)境。
[0028]6)細(xì)胞三維培養(yǎng)時，需要把三維材料的微環(huán)境打開，讓細(xì)胞釋放到水基中，這是傳統(tǒng)三維培養(yǎng)比較困難的部分，而本發(fā)明3D培養(yǎng)材料在束膠上帶上Fe性磁珠，結(jié)合磁力架的使用，該材料的構(gòu)象會發(fā)生改變，細(xì)胞很容易融解到水基中。
【附圖說明】
[0029]圖1為含有本發(fā)明材料的細(xì)胞培養(yǎng)基的穩(wěn)定性檢測；
圖2為本發(fā)明3D細(xì)胞培養(yǎng)材料形成微環(huán)境的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0030]一種三維細(xì)胞培養(yǎng)材料，所述三維細(xì)胞培養(yǎng)材料包括PEG8000@ Fe3O4和PEG4000Fe3O4; 二者的制備方法如下，
PEG8000i Fe3O4的制備方法:
1)烷基化:取粒徑為15~25nm的Fe3O4納米球，加入有機物的氨水溶液，混勻，于8°C ~10°C條件下反應(yīng)16?20h，使Fe3O4納米球表面被陽離子烷基化形成保護(hù)膜；
2)將烷基化的Fe3O4納米球與磷酸化PEG8000水溶液混合，并通過氬氣排除氧氣，再加入金屬鹽，混勻在55?65°C條件下攪拌催化反應(yīng)I?2h，即得PEG80000 Fe3O4;
PEG400i Fe3O4的制備方法與