本發(fā)明屬于組織工程學(xué)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用含血清培養(yǎng)體系在體外構(gòu)建的3d模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

本發(fā)明中3d模型是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將少量種子細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后構(gòu)建而成，其結(jié)構(gòu)與正常人角膜上皮結(jié)構(gòu)高度類似，由下而上的結(jié)構(gòu)依次為基底層、棘層、顆粒層、棘層，均無(wú)角質(zhì)層，具有完整的上皮結(jié)構(gòu)，且表達(dá)角膜相關(guān)角蛋白。該體外構(gòu)建的3d模型主要用作眼刺激體外檢測(cè)，對(duì)小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、化妝品等產(chǎn)品的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

化學(xué)物直接接觸或者暴露于眼部，會(huì)引發(fā)刺激性以及局部毒性。因此，眼表刺激性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是危害評(píng)價(jià)以及風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避程序中非常需要的一項(xiàng)。傳統(tǒng)方法中對(duì)新型化合物的眼刺激潛在風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估主要依賴于體外的兔眼實(shí)驗(yàn)，這種方法耗時(shí)耗力、且成本較高。因此，尋找快速、經(jīng)濟(jì)的化合物篩選方法成為該領(lǐng)域的一項(xiàng)迫切需求，并激發(fā)了大量的關(guān)于眼表刺激性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的體外替代方法的建立的相關(guān)工作的開展，例如牛角膜不透明度及滲透性檢測(cè)，雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)等，上述技術(shù)通過(guò)一定程度的組合可以實(shí)現(xiàn)體外眼刺激性評(píng)價(jià)，但卻都無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)體外兔眼刺激實(shí)驗(yàn)的替代。近年來(lái)，隨著體外器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，基于體外細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的3d重組角膜上皮模型，在眼刺激風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)領(lǐng)域表現(xiàn)出特有的趨勢(shì)。體外構(gòu)建的3d角膜上皮模型，類似于人體角膜上皮的三維結(jié)構(gòu)，其不僅可以更為真實(shí)的反映人體對(duì)化學(xué)物的響應(yīng)，準(zhǔn)確給出化學(xué)物刺激性的預(yù)測(cè)，對(duì)于化合物篩選的種類也具有更寬的應(yīng)用范疇，除了不同功效目的的劑型開發(fā)，也包括化妝品具體成分的危害評(píng)價(jià)。目前，采用體外構(gòu)建3d重組角膜模型進(jìn)行的眼刺激性檢測(cè)已被國(guó)際認(rèn)可，2015年oecd指南492即給出了采用該模型的一種替代方法。

目前，國(guó)際上主要有三種商業(yè)化的體外重組角膜上皮模型，第一款epiocular?(mattek,ma,usa)，hce(skinethic,france)以及cornea-model（labcyte，japen）。其中，mattek的epiocular^tm以人源的表皮角質(zhì)化細(xì)胞作為種子細(xì)胞，體外培養(yǎng)形成類似于角膜上皮結(jié)構(gòu)的模型，雖然該模型在眼刺激性動(dòng)物替代評(píng)價(jià)方法中扮演著重要的角色，但非角膜細(xì)胞系并不能完全等同于人角膜。labcyte的cornea-model采用正常的人角膜上皮細(xì)胞系進(jìn)行構(gòu)建，體外培養(yǎng)形成角膜上皮結(jié)構(gòu)；角膜上皮細(xì)胞是體外研究細(xì)胞分化、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)信號(hào)通路的模式工具，也可以用來(lái)構(gòu)建體外三維的角膜上皮組織模型，但是，可用角膜組織的有限來(lái)源，加之角膜細(xì)胞自身短暫的生命周期以及快速的分化，使得角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)難度大，且非常耗時(shí)。許多嘗試增長(zhǎng)角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)周期的工作都有開展，例如病毒轉(zhuǎn)染，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)染等，skinethic的hce模型采用永生化的角膜上皮細(xì)胞系作為種子細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，形成多細(xì)胞層的角膜上皮組織類似物，其結(jié)構(gòu)上和角膜黏膜非常類似。

中國(guó)專利201410062366申請(qǐng)公開了一種簡(jiǎn)易角膜緣干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)試劑盒及方法，采用該方法進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)，操作簡(jiǎn)單，干細(xì)胞得率高，所得原代干細(xì)胞損傷少，增值能力強(qiáng)，體外培養(yǎng)成功率高，重現(xiàn)性好。

中國(guó)專利03150375.6申請(qǐng)公開了一種組織工程自體角膜上皮及其制備方法，該方法將來(lái)源于患者自體的角膜上皮干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞在體外擴(kuò)增和分化后，接種到纖維蛋白生物支架上進(jìn)行培養(yǎng)，在體外構(gòu)建組織工程自體角膜上皮。

中國(guó)專利200410019341.x申請(qǐng)公開了一種角膜緣干細(xì)胞組織工程復(fù)合體及其制備方法，該方法采用去除上皮的羊膜作為載體，以3t3成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，在體外構(gòu)建組織工程角膜復(fù)合體。

中國(guó)專利200410019342.4申請(qǐng)公開了一種人成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)的人角膜緣干細(xì)胞組織工程產(chǎn)品及制備方法，該方法采用去除上皮的羊膜作為載體，以人成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，在體外構(gòu)建組織工程角膜復(fù)合體。

中國(guó)專利201019018004.1申請(qǐng)公開了一種組織工程角膜的制備方法，該方法采用表皮干細(xì)胞和多能基質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)后種植在脫細(xì)胞天然角膜基質(zhì)的兩面，再經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)形成組織工程角膜。

角膜上皮模型的細(xì)胞來(lái)源包括胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞以及口腔黏膜上皮細(xì)胞等，其作為種子細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用已有了報(bào)道并取得了突破性的進(jìn)展，尤其是對(duì)于口腔黏膜上皮細(xì)胞的研究，目前已經(jīng)成為熱點(diǎn)。目前在臨床治療中，使用口腔黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)建生物膜片移植治療眼表疾病，該方法已成為臨床治療中常用方法。自口腔黏膜分離的上皮細(xì)胞與表皮角質(zhì)化細(xì)胞相比處于較低的分化階段，由于其細(xì)胞循環(huán)周期相對(duì)短暫，體外培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)縮短，且延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)維持非角化狀態(tài)；其次，取活組織后殘留的疤痕不明顯，使口腔成為獲取活組織的一個(gè)理想場(chǎng)所。shigeru及nakamura等指出，口腔黏膜上皮組織由5~6層細(xì)胞構(gòu)成，具有基底層、棘層、顆粒層，無(wú)角質(zhì)層，并且具有橋粒、半橋粒等緊密連接結(jié)構(gòu)，該組織結(jié)構(gòu)與角膜組織結(jié)構(gòu)相似；并且研究發(fā)現(xiàn)口腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)非角質(zhì)層特異蛋白ck4、ck13，及角膜特異蛋白ck3。yasutaka等研究也指出，口腔黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)角膜特異蛋白ck3，非角質(zhì)層特異蛋白ck4、ck13，而角質(zhì)層特異蛋白ck1、ck10無(wú)表達(dá)，其表達(dá)情況與角膜中角蛋白的表達(dá)情況相同。

口腔黏膜上皮細(xì)胞在臨床治療上的成功應(yīng)用，說(shuō)明口腔黏膜上皮細(xì)胞可以作為角膜上皮細(xì)胞理想替代物用于眼表重建，表明口腔黏膜上皮細(xì)胞具有替代角膜細(xì)胞構(gòu)建體外模型的潛能。

中國(guó)專利200610128698.0申請(qǐng)公開了一種自體角膜上皮的制備方法，該方法采用原代培養(yǎng)患者自體的口腔黏膜組織細(xì)胞3~15天，對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增培養(yǎng)7~30天，再接種到纖維蛋白生物支架上進(jìn)行培養(yǎng)構(gòu)建，最終制備成角膜上皮，應(yīng)用于臨床治療。但目前使用口腔黏膜細(xì)胞構(gòu)建的角膜模型，其構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，體外構(gòu)建一批模型需長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)的構(gòu)建時(shí)間會(huì)增加過(guò)程中的不可控因素，影響模型的穩(wěn)定性；需要滋養(yǎng)層，為上皮層提供營(yíng)養(yǎng)；多應(yīng)用于臨床治療。

目前，體外構(gòu)建組織工程角膜大多應(yīng)用于臨床治療，而制約組織工程角膜移植的瓶頸是構(gòu)建載體，因此組織工程角膜的研究主要集中在構(gòu)建載體上，其構(gòu)建體系也更加適合載體，且大多需要滋養(yǎng)層為上皮層提供營(yíng)養(yǎng)。另外，目前使用角膜細(xì)胞構(gòu)建的角膜模型，其構(gòu)建時(shí)間長(zhǎng)，體外構(gòu)建一批模型需長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)的構(gòu)建時(shí)間會(huì)增加過(guò)程中的不可控因素，影響模型的穩(wěn)定性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種利用含血清培養(yǎng)體系在體外構(gòu)建的3d模型及其構(gòu)建方法，由于該3d模型的種子細(xì)胞選擇多樣，體外構(gòu)建重復(fù)性佳，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化制備；同時(shí)，使用含血清培養(yǎng)體系，提供細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，減少了因子的添加；并且構(gòu)建培養(yǎng)體系更適合上皮細(xì)胞的增殖分化，使細(xì)胞無(wú)須基質(zhì)和支架也能復(fù)層分化良好，保證了模型的正常復(fù)層化，從而形成了和人體角膜上皮高度類似的連接結(jié)構(gòu)，并正常表達(dá)了角膜上皮相關(guān)蛋白。

本發(fā)明內(nèi)容如下：

一種3d模型，所述模型是一種利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型及其構(gòu)建方法，是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，使用組織分離的原代角膜上皮細(xì)胞，或角膜緣干細(xì)胞，或永生化角膜上皮細(xì)胞，或原代口腔黏膜上皮細(xì)胞，或口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株tr146，經(jīng)體外擴(kuò)增后，采用含血清培養(yǎng)液，及液下-氣液面分段培養(yǎng)法，使其復(fù)層化，形成體外3d模型。

進(jìn)一步地，所用的細(xì)胞為使用組織分離的原代角膜上皮細(xì)胞，或角膜緣干細(xì)胞，或永生化角膜上皮細(xì)胞，或原代口腔黏膜上皮細(xì)胞，或口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株tr146中的一種。

進(jìn)一步地，使用的培養(yǎng)基含5%~20%的胎牛血清fbs。

一種利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建3d模型的體外構(gòu)建方法，包括以下方法步驟：

步驟一、細(xì)胞的準(zhǔn)備

取原代角膜上皮細(xì)胞，或角膜緣干細(xì)胞，或永生化角膜上皮細(xì)胞，或原代口腔黏膜上皮細(xì)胞，或口腔黏膜鱗狀癌細(xì)胞株tr146，復(fù)蘇擴(kuò)增后，使用p4~p20代細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5.0×10⁴個(gè)/ml～5.0×10⁶個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，加含5%~20%胎牛血清的培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0～4.5g/l，谷氨酰胺含量為0.2g/l～20.0g/l。

步驟二、3d模型的液下接種培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×10⁴個(gè)/ml～5.0×10⁶個(gè)/ml，以200μl/室的體積，接種于小室內(nèi)，將小室置于模型培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加適量培養(yǎng)液ⅱ，使小室內(nèi)外液面高度一致，進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)；置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)0.5～2小時(shí)，后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1～3天，每天換液；

所述培養(yǎng)液ⅱ，是以dmem：f12含量為3:1～1:3的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎牛血清濃度為5%～20%，維甲酸濃度為4～10μg/ml，人表皮生長(zhǎng)因子濃度為0.1～10.0ng/ml，胰島素濃度為5.0～50.0ng/ml，氫化可的松濃度為0.1～5.0μg/ml，腺嘌呤濃度為5.0～50.0μg/ml，三碘甲狀腺氨酸濃度為0.1～10.0μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.01%～0.1%，黃酮濃度為5.0～50.0μg/ml，谷氨酰胺濃度為0.2g/l～20.0g/l，霍亂毒素濃度為1.0～100.0μg/l，二性霉素b濃度為1.0～10.0mg/l，青霉素濃度為10.0～100.0iu/ml，鏈霉素濃度為10.0～100.0μg/ml；

上述步驟中采用的培養(yǎng)液ⅱ，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，添加了胎牛血清，胎牛血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無(wú)機(jī)物等，能夠提供人工合成培養(yǎng)液中所缺少的生物因子及物理因素，形成與體內(nèi)微環(huán)境相似的細(xì)胞生長(zhǎng)場(chǎng)所，使細(xì)胞生長(zhǎng)或抑制達(dá)到生理平衡。并且，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞似乎只有在基質(zhì)或支架材料上才能良好復(fù)層分化形成黏膜片，而添加血清的培養(yǎng)基，細(xì)胞無(wú)須基質(zhì)和支架也能復(fù)層分化良好。但血清中一些成分也會(huì)對(duì)上皮細(xì)胞的分化產(chǎn)生一定的抑制作用，因此，培養(yǎng)液ⅱ中添加了各種因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及分化。其中維甲酸能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞增生、分化、角質(zhì)溶解等代謝作用。氫化可的松可能兼有促細(xì)胞貼附和增殖作用，細(xì)胞密度高時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分化。透明質(zhì)酸是葡糖醛酸和-n乙酞氨基葡萄糖為雙糖單位構(gòu)成的直鏈高分子多糖，含有大量的羧基和羥基可與水形成氫鍵而結(jié)合大量的水，能進(jìn)行溶液滲透壓的調(diào)節(jié)；并且對(duì)細(xì)胞具有多種保護(hù)作用，對(duì)帶電大分子的擴(kuò)散具有阻止作用，對(duì)細(xì)胞行為也具有一定影響；透明質(zhì)酸還能抑制自由基的形成與釋放。黃酮中含有豐富的酚類物質(zhì)，可與過(guò)氧化自由基結(jié)合，阻斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，提高細(xì)胞的抗氧化能力；黃酮還能夠通過(guò)降低caspase-3蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。針對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)所使用的單一培養(yǎng)基（例如單純使用dmem培養(yǎng)基）只能夠提供氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)化合物、微量元素的缺陷，這些因子的添加，一方面保證了細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)；另一方面從培養(yǎng)基的滲透壓及抗氧化能力等方面保證了細(xì)胞的活性。

步驟三、3d模型的氣液面增殖分化培養(yǎng)

將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換模型培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，使液面與小室內(nèi)細(xì)胞上表面位于同一水平線，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1～7天，每天換液，培養(yǎng)結(jié)束，模型的體外構(gòu)建結(jié)束；

所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，增加氫化可的松濃度為5.0～10.0μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.1%～1%，黃酮濃度為50.0～150.0μg/ml，并添加維生素e濃度為20.0～80.0μg/ml。

上述步驟中采用氣液面分段培養(yǎng)的方法，使其復(fù)層化，形成體外模型。該氣液面培養(yǎng)階段使用的培養(yǎng)液ⅲ，與培養(yǎng)液ⅱ的區(qū)別在于，增加了培養(yǎng)液ⅱ中氫化可的松、透明質(zhì)酸、黃酮的濃度，并添加了維生素e。維生素e是最主要的抗氧化劑之一，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的毒害，抑制細(xì)胞凋亡；并能降低細(xì)胞需要氧量，維持細(xì)胞活性；并參與細(xì)胞dna的合成。氫化可的松濃度的適量增加，能夠在細(xì)胞密度增加的情況下，發(fā)揮了誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用，保證了模型完整復(fù)層化。透明質(zhì)酸一方面抑制自由基的形成與釋放，一方面維持細(xì)胞正常代謝所需的滲透壓，從而保證了細(xì)胞的增殖、分化。黃酮濃度的增加，進(jìn)一步抑制細(xì)胞在快速生長(zhǎng)過(guò)程中的凋亡。上述條件共同作用，保證了細(xì)胞快速健康的增殖、分化，最終形成復(fù)層化角膜上皮結(jié)構(gòu)，并簡(jiǎn)化的構(gòu)建方法，縮短了構(gòu)建時(shí)間。

進(jìn)一步地，該模型構(gòu)建時(shí)間為3~10天，構(gòu)建所需時(shí)間短。

進(jìn)一步地，構(gòu)建體系能夠提供上皮細(xì)胞增殖分化所需營(yíng)養(yǎng)及微環(huán)境，不需要滋養(yǎng)層。

進(jìn)一步地，模型結(jié)構(gòu)與正常人角膜上皮結(jié)構(gòu)相似，均為復(fù)層化結(jié)構(gòu)，無(wú)角質(zhì)層。

進(jìn)一步地，模型角膜特異性蛋白表達(dá)與正常人角膜上皮相似，表達(dá)角膜特異性蛋白ck3。

進(jìn)一步地，使用et50法（0.3%tritonx-100使模型內(nèi)半數(shù)細(xì)胞死亡所需的時(shí)間）檢測(cè)其屏障功能，在液下培養(yǎng)結(jié)束后，其et50為5~15min。

進(jìn)一步地，使用et50法檢測(cè)其屏障功能，在氣液面培養(yǎng)結(jié)束后，其et50為30~70min。

進(jìn)一步地，該模型應(yīng)用于小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、化妝品等產(chǎn)品的眼刺激性體外檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果是：

采用本發(fā)明提供的方法構(gòu)建的3d模型，具有以下優(yōu)點(diǎn)：一，種子細(xì)胞選擇多樣，體外構(gòu)建重復(fù)性佳，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化制備；二、使用含血清培養(yǎng)體系，提供細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，減少了因子的添加；三，透明質(zhì)酸的添加，一方面抑制自由基的形成與釋放，一方面能進(jìn)行溶液滲透壓的調(diào)節(jié)，維持細(xì)胞正常代謝所需的滲透壓，從而保證了細(xì)胞的增殖、分化；四、黃酮的添加，降低了caspase-3蛋白的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生；五、液下及氣液面階段不同的氫化可的松濃度，保證了細(xì)胞不同時(shí)期的需求，有利于復(fù)層化角膜上皮結(jié)構(gòu)的形成；六、氣液面培養(yǎng)階段的簡(jiǎn)化，在保證細(xì)胞快速增殖分化的同時(shí)，縮短了構(gòu)建時(shí)間、降低生產(chǎn)成本；七，該構(gòu)建培養(yǎng)體系更適合上皮細(xì)胞的增殖分化，使細(xì)胞無(wú)須基質(zhì)和支架也能復(fù)層分化良好，保證了模型的正常復(fù)層化，從而形成了和人體角膜上皮高度類似的連接結(jié)構(gòu)，并正常表達(dá)了角膜上皮相關(guān)蛋白，這種自身結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外微環(huán)境的影響可進(jìn)一步提升模型的屏障功能，最終構(gòu)建的體外3d模型與人角膜上皮組織具有高度相似的結(jié)構(gòu)及功能；八，使用構(gòu)建的3d模型對(duì)《全球化學(xué)品統(tǒng)一分類和標(biāo)簽制度》中部分化學(xué)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，使用本發(fā)明提供的方法制備的3d模型能夠準(zhǔn)確判定該化學(xué)品是否具有眼刺激性，其結(jié)果與兔眼實(shí)驗(yàn)的判定結(jié)果一致，因此，3d模型能夠客觀真實(shí)的反映檢測(cè)結(jié)果，能夠很好的替代動(dòng)物模型，成為體外測(cè)試的核心工具，應(yīng)用于小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、化妝品等產(chǎn)品的眼刺激性體外檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型的組織學(xué)切片he染色照片；

圖2為利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型的角蛋白ck3免疫組化染色照片；

圖3為利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型的液下培養(yǎng)結(jié)束后組織活性與0.3%tritonx-100作用時(shí)間的曲線圖，可計(jì)算得出et50值；

圖4為利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型的氣液面培養(yǎng)結(jié)束后組織活性與0.3%tritonx-100作用時(shí)間的曲線圖，可計(jì)算得出et50值；

圖5為利用含血清培養(yǎng)液體外構(gòu)建的3d模型進(jìn)行化合物眼刺激性檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并不作為對(duì)權(quán)利要求的限制。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例著重介紹利用原代角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型的體外構(gòu)建方法步驟：

步驟一、細(xì)胞的準(zhǔn)備

取原代角膜上皮細(xì)胞，復(fù)蘇擴(kuò)增后，使用p7代細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5.0×10⁴個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，加10%胎牛血清的培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0g/l，谷氨酰胺含量為0.2g/l。

步驟二、3d模型的液下接種培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×10⁴個(gè)/ml，以200μl/室的體積，接種于小室內(nèi)，將小室置于模型培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加適量培養(yǎng)液ⅱ，使小室內(nèi)外液面高度一致，進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)；置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)0.5小時(shí)，后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3天，每天換液；

所述培養(yǎng)液ⅱ，是以dmem：f12含量為3:1的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎牛血清濃度為20%，維甲酸濃度為8μg/ml，人表皮生長(zhǎng)因子濃度為0.8ng/ml，胰島素濃度為20.0ng/ml，氫化可的松濃度為0.5μg/ml，腺嘌呤濃度為25.0μg/ml，三碘甲狀腺氨酸濃度為0.1μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.1%，黃酮濃度為10.0μg/ml，谷氨酰胺濃度為0.2g/l，霍亂毒素濃度為1.0μg/l，二性霉素b濃度為1.0mg/l，青霉素濃度為100.0iu/ml，鏈霉素濃度為100.0μg/ml；

步驟三、3d模型的氣液面增殖分化培養(yǎng)

將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換模型培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，使液面與小室內(nèi)細(xì)胞上表面位于同一水平線，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，每天換液，培養(yǎng)結(jié)束，3d模型的體外構(gòu)建結(jié)束；

所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，增加氫化可的松濃度為10.0μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為1%，黃酮濃度為100.0μg/ml，并添加維生素e濃度為50.0μg/ml。

利用原代角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型的組織學(xué)切片he染色結(jié)果見圖1，說(shuō)明利用原代角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型復(fù)層化結(jié)構(gòu)完整。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例著重介紹利用永生化角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型的體外構(gòu)建方法步驟：

步驟一、細(xì)胞的準(zhǔn)備

取永生化角膜上皮細(xì)胞，復(fù)蘇擴(kuò)增后，使用p20代細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5.0×10⁵個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，加10%胎牛血清的培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為4.5g/l，谷氨酰胺含量為0.2g/l。

步驟二、3d模型的液下接種培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×10⁵個(gè)/ml，以200μl/室的體積，接種于小室內(nèi)，將小室置于模型培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加適量培養(yǎng)液ⅱ，使小室內(nèi)外液面高度一致，進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)；置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3天，每天換液；

所述培養(yǎng)液ⅱ，是以dmem：f12含量為3:1的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎牛血清濃度為20%，維甲酸濃度為8μg/ml，人表皮生長(zhǎng)因子濃度為0.5ng/ml，胰島素濃度為20.0ng/ml，氫化可的松濃度為0.5μg/ml，腺嘌呤濃度為25.0μg/ml，三碘甲狀腺氨酸濃度為0.1μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.1%，黃酮濃度為8.0μg/ml，谷氨酰胺濃度為0.2g/l，霍亂毒素濃度為1.0μg/l，二性霉素b濃度為1.0mg/l，青霉素濃度為100.0iu/ml，鏈霉素濃度為100.0μg/ml；

步驟三、3d模型的氣液面增殖分化培養(yǎng)

將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換模型培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，使液面與小室內(nèi)細(xì)胞上表面位于同一水平線，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7天，每天換液，培養(yǎng)結(jié)束，3d模型的體外構(gòu)建結(jié)束；

所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，增加氫化可的松濃度為8.0μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.5%，黃酮濃度為80.0μg/ml，并添加維生素e濃度為40.0μg/ml。

利用永生化角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型的角蛋白ck3免疫組化染色結(jié)果見圖2，說(shuō)明利用永生化角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型蛋白表達(dá)與人角膜相似。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例著重介紹利用口腔粘膜鱗狀癌細(xì)胞株tr146體外構(gòu)建的3d模型的體外構(gòu)建方法步驟：

步驟一、細(xì)胞的準(zhǔn)備

取口腔粘膜鱗狀癌細(xì)胞株tr146，復(fù)蘇擴(kuò)增后，使用p14代細(xì)胞，以胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5.0×10⁶個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中，加10%胎牛血清的培養(yǎng)液ⅰ培養(yǎng)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散均勻后，置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)；

所述培養(yǎng)液ⅰ，為dmem，其所含葡萄糖含量為1.0g/l，谷氨酰胺含量為0.2g/l。

步驟二、3d模型的液下接種培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以培養(yǎng)液ⅱ制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×10⁶個(gè)/ml，以200μl/室的體積，接種于小室內(nèi)，將小室置于模型培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加適量培養(yǎng)液ⅱ，使小室內(nèi)外液面高度一致，進(jìn)行浸沒式培養(yǎng)；置于37℃、5%co2條件下培養(yǎng)2小時(shí)，后轉(zhuǎn)入液下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2天，每天換液；

所述培養(yǎng)液ⅱ，是以dmem：f12含量為3:1的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胎牛血清濃度為10%，維甲酸濃度為8μg/ml，人表皮生長(zhǎng)因子濃度為0.5ng/ml，胰島素濃度為30.0ng/ml，氫化可的松濃度為1.0μg/ml，腺嘌呤濃度為50.0μg/ml，三碘甲狀腺氨酸濃度為0.1μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.3%，黃酮濃度為8.0μg/ml，谷氨酰胺濃度為0.2g/l，霍亂毒素濃度為1.0μg/l，二性霉素b濃度為1.0mg/l，青霉素濃度為100.0iu/ml，鏈霉素濃度為100.0μg/ml；

步驟三、3d模型的氣液面增殖分化培養(yǎng)

將上述小室內(nèi)的培養(yǎng)液棄掉，更換模型培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液為培養(yǎng)液ⅲ，使液面與小室內(nèi)細(xì)胞上表面位于同一水平線，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為6天，每天換液，培養(yǎng)結(jié)束，3d模型的體外構(gòu)建結(jié)束；

所述培養(yǎng)液ⅲ，為在培養(yǎng)液ⅱ中，增加氫化可的松濃度為8.0μg/ml，透明質(zhì)酸濃度為0.6%，黃酮濃度為100.0μg/ml，并添加維生素e濃度為50.0μg/ml。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例著重介紹利用原代角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型進(jìn)行et50檢測(cè)的步驟：

1）將模型放入6孔板，在孔板內(nèi)添加0.9ml的培養(yǎng)液。

2）吸取80μl0.3%tritonx-100，緩慢滴加于組織表面，確保試劑能夠盡量覆蓋在組織表面。

3）給藥時(shí)間分別為0、30、60min。

4）最后一塊組織給藥后，將所有的6孔板轉(zhuǎn)移到恒溫培養(yǎng)箱中（37±1℃、5±1%co2、95%相對(duì)濕度）。

5）在組織孵育結(jié)束前30min，預(yù)備1mg/mlmtt溶液，并向24孔板每孔加入300μl的mtt溶液。

6）給藥結(jié)束后開始洗滌程序，采用裝有無(wú)菌dpbs的洗瓶清洗組織，清洗10次以后，采用dpbs浸洗組織培養(yǎng)小室里、外各一次。

7）將清洗好并且干燥的組織，轉(zhuǎn)移至加有mtt測(cè)試溶液的24孔板中，恒溫培養(yǎng)箱中（37±1℃、5±1%co2、95%相對(duì)濕度），孵育3hmin。

8）mtt孵育完成后，從孔板中輕柔的吸去mtt溶液，給孔板中加入dpbs溶液進(jìn)行清洗過(guò)程。

9）洗滌完畢后，將組織底面用吸水紙擦干，轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，在培養(yǎng)小室中加入2ml異丙醇，它能夠溶解mtt產(chǎn)生的結(jié)晶。采用封口膜密封24孔板間隙避免異丙醇揮發(fā)影響終體積。4℃靜置過(guò)夜溶解。

10）溶解完成后，對(duì)于每個(gè)組織，吸取2份200μl的紫色甲瓚溶液到同一96孔板中。重復(fù)處理平行的組織，并依據(jù)孔板的設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)移液體，采用異丙醇作為空白對(duì)照。分光光度計(jì)570nm波長(zhǎng)讀取吸光度，不采用濾光鏡。

11）3d模型的液下培養(yǎng)結(jié)束后組織活性與0.3%tritonx-100作用時(shí)間的曲線圖見圖3，可計(jì)算得出et50值為11.7min。3d模型的氣液面培養(yǎng)結(jié)束后組織活性與0.3%tritonx-100作用時(shí)間的曲線圖見圖4，可計(jì)算得出et50值為59.6min。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例著重介紹利用永生化角膜上皮細(xì)胞體外構(gòu)建的3d模型進(jìn)行化合物眼刺激性檢測(cè)的步驟：

1）準(zhǔn)備樣品

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，樣本組為2種液體狀的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品，分別為二丙基二硫醚和n,n-二乙基間甲苯胺，其中二丙基二硫醚在人體試驗(yàn)中屬于非眼表刺激性化學(xué)品，n,n-二乙基間甲苯胺人體試驗(yàn)結(jié)果為眼表刺激性化學(xué)品，陰性對(duì)照組為超純水，陽(yáng)性對(duì)照組為乙酸甲酯。

2）測(cè)試安全性

（1）每種測(cè)試物預(yù)備1個(gè)六孔板，共準(zhǔn)備4個(gè)6孔板。在第一排各孔中添加0.9ml的dmem細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔放置一個(gè)表面積為0.5cm²的體外重組角膜上皮模型。

（2）測(cè)試物及對(duì)照物處理前，用20μl杜氏磷酸鹽緩沖液處理步驟(1)中的組織表面，在黑暗環(huán)境下于36～37℃、5%co2、95%相對(duì)濕度（標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件）的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)15min，模擬人眼潮濕狀態(tài)。

（3）測(cè)試物給藥。在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行所有的給藥操作：每隔30s給藥一個(gè)模型（時(shí)間可不定，根據(jù)自身給藥時(shí)間控制，但須保證每個(gè)模型的給藥時(shí)間是一定的），確保給藥后，留有充分的浸洗時(shí)間間隔。在0.5cm²組織表面分別進(jìn)行給藥，給藥量為83.3μl/cm²（液體化學(xué)品）或83.3mg/cm²（固態(tài)化學(xué)品），給藥后，輕搖細(xì)胞小室促進(jìn)測(cè)試物在組織表面的鋪展，在室溫下，孵育30min，。注意：不可按壓組織表面。

（4）至第一個(gè)給藥的組織的給藥時(shí)間結(jié)束，取出體外重組角膜上皮模型，準(zhǔn)備三個(gè)無(wú)菌24孔板，用于細(xì)胞活力檢測(cè)。

（5）開始洗滌程序?？刂泼總€(gè)培養(yǎng)小室洗滌30s，用杜氏酸鹽緩沖溶液洗體外重組角膜上皮模型15次，用無(wú)菌紗布或無(wú)菌棉棒擦拭。

（6）清洗結(jié)束后，在36～37℃、5%co2、95%相對(duì)濕度培養(yǎng)條件下，使用新鮮的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)組織120min。

（7）mtt測(cè)試將表面干燥的體外重組角膜上皮模型轉(zhuǎn)移到含有1mg/ml噻唑藍(lán)溶液的24孔板中，每孔0.3ml，在36～37℃、5%co2、95％濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育3小時(shí)。

（8）用移液器吸除噻唑藍(lán)溶液，將體外重組角膜上皮模型完全浸沒至每孔含2ml異丙醇的24孔板，用封口膜密封，在4℃靜置提取12～16小時(shí)，得到異丙醇的浸提物。

（9）采用200μl移液器槍尖刺穿培養(yǎng)小室底部，使體外重組角膜上皮模型的異丙醇浸提物流到培養(yǎng)孔中。吸取200μl到異丙醇浸提物到96孔板中。

（10）測(cè)量吸光度：用96孔板分光光度計(jì)檢測(cè)在波長(zhǎng)為550～570nm的吸光度od值。

（11）判定刺激性：以陰性對(duì)照去離子水的吸光度值為分母，分別以測(cè)試樣二丙基二硫醚和n,n-二乙基間甲苯胺的吸光度值為分子，比值的百分?jǐn)?shù)作為各自的相對(duì)細(xì)胞活力。結(jié)果見圖5，二丙基二硫醚的相對(duì)為69.1%，相對(duì)細(xì)胞活力高于60%，所以屬于非眼表刺激性化學(xué)品。n,n-二乙基間甲苯胺的相對(duì)細(xì)胞活力為20.7%，相對(duì)細(xì)胞活力低于60%,說(shuō)明n,n-二乙基間甲苯胺對(duì)眼表具有刺激性。（相對(duì)細(xì)胞活力高于60%，被檢測(cè)的化學(xué)品無(wú)眼表刺激性，相對(duì)細(xì)胞活力低于60%，被檢測(cè)的化學(xué)品具有刺激性。）

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。