本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活，在細(xì)胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)因子才能使細(xì)胞得以生長(zhǎng)并維持生長(zhǎng)狀態(tài)。因此采用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基常常要添加血清，如馬血清或胎牛血清；因?yàn)檠迨怯珊芏啻笮〔煌锓肿咏M成的極為復(fù)雜的混合物，它能提供細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)所需要的生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用；而且本身血清中還富含有絲分裂因子，也利于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。但血清培養(yǎng)基存在一定的弊端，無(wú)法規(guī)避動(dòng)物血清中的異源體，如果使用動(dòng)物血清培養(yǎng)基培育出來(lái)的細(xì)胞，會(huì)存在人體異源體排斥和沖突。尤其是在干細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中，血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)，給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)困難，其中復(fù)雜的蛋白和多重的細(xì)胞因子，會(huì)導(dǎo)致本身就容易分化的干細(xì)胞生出多種完全不同的細(xì)胞表型，而產(chǎn)生多種完全不同的細(xì)胞分化趨勢(shì)，也給細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化和結(jié)果的重復(fù)性帶來(lái)很大的困難。中國(guó)專利申請(qǐng)CN105087480A公開(kāi)了一種無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的補(bǔ)充因子，補(bǔ)充因子包括亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、胰島素、纖粘連蛋白和氫化可的松。中國(guó)專利申請(qǐng)CN104357379A公開(kāi)了一種干細(xì)胞培養(yǎng)基，包含以下組分：水溶性非聚電解質(zhì)高分子、無(wú)機(jī)鹽類、維生素、氨基酸、葡萄糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或類胰島素功能替代品如(IGF-1/2)、成纖維生長(zhǎng)因子。目前，已經(jīng)研發(fā)出不含血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基，但是，現(xiàn)有的干細(xì)胞培養(yǎng)基存在細(xì)胞增殖的速度慢的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的干細(xì)胞培養(yǎng)基能快速擴(kuò)增干細(xì)胞，大大縮短了干細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：人血白蛋白1-3mg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白8-13μg/mL，胰高血糖素0.12-0.15μg/mL，活性炭2.5-3μg/mL，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子13-18ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子7-11ng/mL，亞油酸3-6μM，槲皮素5-9μg/mL，桔梗皂苷D20-25μg/mL，昆布氨酸2-5mg/mL，腺苷脫氨酶3-7μg/mL，肉豆蔻酸1.2-1.6μM。進(jìn)一步地，所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：人血白蛋白2mg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/mL，胰高血糖素0.14μg/mL，活性炭2.8μg/mL，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子9ng/mL，亞油酸5μM，槲皮素6μg/mL，桔梗皂苷D23μg/mL，昆布氨酸4mg/mL，腺苷脫氨酶5μg/mL，肉豆蔻酸1.4μM。進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM或F12培養(yǎng)基。另外，本發(fā)明還提供了所述干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌25-35分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續(xù)攪拌30-40分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置2-4小時(shí)，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6-8％的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2-7.4，滅菌溫度為118℃-123℃，滅菌時(shí)間為16-20分鐘，即得。優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌30分鐘。優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌36分鐘。優(yōu)選地，所述步驟S1靜置3小時(shí)。優(yōu)選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％的碳酸鈉溶液。優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.3。優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌溫度為121℃。優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌時(shí)間為18分鐘。本發(fā)明提供的干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，加入的添加劑包括人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰高血糖素和活性炭等。在本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供干細(xì)胞的生存和最低的生理活動(dòng)。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵元素的代謝，通過(guò)細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體將鐵元素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)，它還可以與其他微量元素結(jié)合，從而調(diào)節(jié)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖與功能表達(dá)。在本發(fā)明中，人血白蛋白主要用作滲透壓調(diào)節(jié)劑、生長(zhǎng)因子的運(yùn)載體、穩(wěn)定劑和自由基清除劑以及營(yíng)養(yǎng)劑等。在本發(fā)明中，胰高血糖素參與干細(xì)胞的糖代謝、脂類代謝等，能調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖與功能表達(dá)。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的活性炭，能夠吸附干細(xì)胞生長(zhǎng)中代謝的有毒物質(zhì)，但是，活性炭在吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)的同時(shí)，也能吸附生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它培養(yǎng)基中的成分，發(fā)明人在使用活性炭時(shí)，考慮到活性炭的兩面性，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)，得到合適的活性炭與培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，使其都能更好的發(fā)揮作用。在本發(fā)明中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子主要作為維持干細(xì)胞體外培養(yǎng)生存、增殖和分化所需的補(bǔ)充因子。在本發(fā)明中，亞油酸能夠提供細(xì)胞膜合成所需的脂質(zhì)。在本發(fā)明中，昆布氨酸能夠促進(jìn)干細(xì)胞的粘附，及其貼壁生長(zhǎng)。在本發(fā)明中，腺苷脫氨酶能夠加速細(xì)胞代謝。在本發(fā)明中，肉豆蔻酸能夠促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，在干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入桔梗皂苷D和槲皮素，這兩種成分能與其他成分間相互作用，使干細(xì)胞的擴(kuò)增速度得到進(jìn)一步的提高。本發(fā)明干細(xì)胞培養(yǎng)基搭配合理，各成分間相互協(xié)調(diào)，共同作用，提高了干細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了干細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的干細(xì)胞培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)本發(fā)明提供的干細(xì)胞培養(yǎng)基能快速擴(kuò)增干細(xì)胞，大大縮短了干細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。(2)本發(fā)明提供的干細(xì)胞培養(yǎng)基不含血清，排除了動(dòng)物來(lái)源的病原體污染。(3)本發(fā)明提供的是一種無(wú)動(dòng)物源性成分、成分確定的干細(xì)胞培養(yǎng)基，可以有效保證產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中DMEM培養(yǎng)基可購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)12培養(yǎng)基可購(gòu)自Sigma公司，槲皮素可購(gòu)自上海譜振生物有限公司，。實(shí)施例1、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表1所示。表1：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白1mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白8μg/mL胰高血糖素0.12μg/mL活性炭2.5μg/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子13ng/mL表皮生長(zhǎng)因子7ng/mL亞油酸3μM槲皮素5μg/mL桔梗皂苷D20μg/mL昆布氨酸2mg/mL腺苷脫氨酶3μg/mL肉豆蔻酸1.2μM所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。制備方法：S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌25分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續(xù)攪拌30分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置2小時(shí)，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.2，滅菌溫度為118℃，滅菌時(shí)間為16分鐘，即得。實(shí)施例2、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表2所示。表2：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白3mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白13μg/mL胰高血糖素0.15μg/mL活性炭3μg/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18ng/mL表皮生長(zhǎng)因子11ng/mL亞油酸6μM槲皮素9μg/mL桔梗皂苷D25μg/mL昆布氨酸5mg/mL腺苷脫氨酶7μg/mL肉豆蔻酸1.6μM所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。制備方法：S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌35分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續(xù)攪拌40分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置4小時(shí)，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.4，滅菌溫度為123℃，滅菌時(shí)間為20分鐘，即得。實(shí)施例3、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表3所示。表3：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白2mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/mL胰高血糖素0.14μg/mL活性炭2.8μg/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15ng/mL表皮生長(zhǎng)因子9ng/mL亞油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脫氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。制備方法：S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入人血白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰高血糖素、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、亞油酸、槲皮素、桔梗皂苷D、昆布氨酸和肉豆蔻酸，攪拌30分鐘，加入腺苷脫氨酶，繼續(xù)攪拌36分鐘，加入活性炭，攪拌均勻，靜置3小時(shí)，得混合物；S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.3，滅菌溫度為121℃，滅菌時(shí)間為18分鐘，即得。對(duì)比例1、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表4所示。表4：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。制備方法與實(shí)施例3類似。與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將桔梗皂苷D替換為人參皂苷。對(duì)比例2、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表5所示。表5：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。制備方法與實(shí)施例3類似。與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將槲皮素替換為黃芩素。對(duì)比例3、一種干細(xì)胞培養(yǎng)基所述干細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，如表6所示。表6：添加在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑的終濃度添加劑終濃度人血白蛋白2mg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/mL胰高血糖素1.47μg/mL活性炭1.47μg/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子15ng/mL表皮生長(zhǎng)因子9ng/mL亞油酸5μM槲皮素6μg/mL桔梗皂苷D23μg/mL昆布氨酸4mg/mL腺苷脫氨酶5μg/mL肉豆蔻酸1.4μM所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為F12培養(yǎng)基。制備方法與實(shí)施例3類似。與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將胰高血糖素和活性炭的終濃度均調(diào)整為1.47μg/mL。試驗(yàn)例一、本發(fā)明干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響1、試驗(yàn)對(duì)象：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基。2、試驗(yàn)方法：用無(wú)菌針管從臀上方吸取深層脂肪組織20mL，在1h內(nèi)將其移至離心管內(nèi)，加入等量PBS緩沖液，充分振蕩后800r/min離心10分鐘，反復(fù)沖洗3次后加入等量15g/LⅠ型膠原酶，37℃水浴中充分振蕩30分鐘。800r/min離心10分鐘后棄去上清。將下層細(xì)胞用PBS懸浮后加入16mmol/LNH4Cl37℃水浴中10min以裂解紅細(xì)胞。800r/min離心10分鐘后，再用PBS沖洗3次。最后，將細(xì)胞分別用本發(fā)明本發(fā)明實(shí)施例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮后移入培養(yǎng)瓶中，37℃，50mL/LCO2培養(yǎng)箱中孵育。在培養(yǎng)開(kāi)始，及第7天、14天、21天和28天時(shí)，分別計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。結(jié)果如表7所示。表7：干細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中擴(kuò)增倍數(shù)培養(yǎng)基7天14天21天28天實(shí)施例1156.3±24.51371.6±48.56567.2±42.411236.1±77.3實(shí)施例2157.8±25.61370.6±42.86464.7±55.411238.5±81.3實(shí)施例3161.9±25.31374.5±41.76472.6±58.311244.2±83.3對(duì)比例151.2±14.7742.3±26.83825.6±45.16132.8±52.5對(duì)比例252.7±15.2752.1±25.73886.2±43.56242.9±50.6對(duì)比例352.5±14.5756.4±23.23873.5±44.86253.4±51.2由表7可以看出，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，生長(zhǎng)在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)，明顯大于生長(zhǎng)在對(duì)比例1-3所得干細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。這說(shuō)明，本發(fā)明干細(xì)胞培養(yǎng)基的擴(kuò)增效果好。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3