本發(fā)明涉及用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物、其制造方法及其用途，所述組合物含有通過特定的退行期誘導(dǎo)物(包括TGF-β)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

背景技術(shù)：

隨著環(huán)境污染、壓力、老齡化和工業(yè)發(fā)展的進(jìn)行，禿頭癥(Alopecia)癥狀或脫發(fā)癥狀變得更加嚴(yán)重，并且隨著福利時(shí)代的到來，對(duì)生活質(zhì)量和軀體外觀的關(guān)注日益增加。

禿頭癥(頭發(fā)從頭皮脫落的癥狀)是由各種原因引起的，包括例如內(nèi)在因素(如遺傳性狀和雄性激素的作用)；日常生活中的精神壓力；以及外部因素(如脂質(zhì)過氧化物的積累)，并且已知禿頭癥癥狀由非常復(fù)雜的過程引起。

毛發(fā)光禿并不意味著毛發(fā)喪失并且永不再生長，而是毛發(fā)逐漸變得更細(xì)成為絨毛狀毛發(fā)，并且存在于毛發(fā)根部中的真皮乳頭變小。隨著真皮乳頭變得更小，毛發(fā)厚度也變得更細(xì)，并且毛發(fā)周期變得更短，從而使新生長的毛發(fā)變得更細(xì)。隨著光禿不斷發(fā)展，毛發(fā)變成絨毛狀毛發(fā)，并且使毛發(fā)周期更短，從而在短的生長之后失去毛發(fā)。另外，目前還關(guān)注了已知為自身免疫性疾病的斑禿，以及歸因于內(nèi)分泌疾病、營養(yǎng)缺乏、藥物、軀體或精神的壓力(例如分娩等)而發(fā)生的暫時(shí)性禿頭癥。

最近，不僅是男性型禿頭癥，而且女性的肥胖性禿頭癥和年輕人禿頭癥正在逐漸增加。根據(jù)由韓國國家保障服務(wù)部的健康福利政策研究所在2009年發(fā)布的消息，2008年的國內(nèi)禿頭癥患者的數(shù)量與2001年相比增加了至少60％。此外，兒童和青少年禿頭癥患者的數(shù)量從2006年的21,643例增加至2011年的23,025例，在5年中表現(xiàn)出了約6.4％的增加。

為了矯正上述脫發(fā)現(xiàn)象，市場上已經(jīng)有了許多類型的毛發(fā)生長劑和毛發(fā)滋養(yǎng)劑。根據(jù)Economy 21的報(bào)告，在韓國當(dāng)前的脫發(fā)服務(wù)國內(nèi)市場中，化妝品和準(zhǔn)藥品占80％，且藥品占約20％，其中，看過醫(yī)生的禿頭癥患者僅占5％。目前，在使用毛發(fā)生長相關(guān)產(chǎn)品的人群中，約72.7％的使用者對(duì)產(chǎn)品不滿意，并且除了由美國FDA在1998年(即大約15年前)公布的經(jīng)批準(zhǔn)的兩種制劑和之外，并沒有已批準(zhǔn)的用于脫發(fā)治療的療法。因此，這兩種制劑不足以治愈所有的各種類型的脫發(fā)相關(guān)的癥狀。特別地，作為非那雄胺制劑而制備的并不是毛發(fā)生長劑，而是脫發(fā)預(yù)防劑。僅具有通過阻斷5-α還原酶而抑制DHT的產(chǎn)生來最大程度地延緩男性類型的禿頭癥的進(jìn)展的作用。

在目前市場上可獲得的毛發(fā)生長劑和毛發(fā)滋養(yǎng)劑(例如和)的情況下，由于應(yīng)用激素制劑，該試劑可能引起副作用，或者它們僅在發(fā)根激活的區(qū)域發(fā)揮作用。因此，盡管該試劑具有有關(guān)預(yù)防脫發(fā)的作用，但是它們對(duì)處于長期休止期的毛發(fā)的生長(即毛發(fā)生長)的作用可忽略不計(jì)，或者只有當(dāng)它們連續(xù)給予或施用時(shí)才可能表現(xiàn)出作用，因此，有必要開發(fā)用于解決禿頭癥或脫發(fā)癥狀的有成本效益且穩(wěn)定的技術(shù)。韓國用于禿頭癥的治療劑的研發(fā)水平在技術(shù)上落后于發(fā)達(dá)國家，并且急需研發(fā)用于預(yù)防脫發(fā)、促進(jìn)毛發(fā)生長和毛發(fā)再生的治療劑。關(guān)于針對(duì)韓國的脫發(fā)的研究，自1950年以來已經(jīng)公開了關(guān)于毛發(fā)生長和發(fā)根再生的報(bào)告，但是由于缺乏再現(xiàn)性等，在過去的50年中毛發(fā)再生被認(rèn)為是不可能的。

然而，美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Costarelis教授在1990年首次發(fā)現(xiàn)了毛囊干細(xì)胞(Cell，1990)，成功地分離了人毛囊干細(xì)胞(J.Clin.Invest，2006)，并發(fā)布了其對(duì)于毛囊再生的可能性的研究結(jié)果(Nature，2007)，其再現(xiàn)性在那時(shí)被認(rèn)為是不可能的，并且開辟了研究禿發(fā)本身的基礎(chǔ)治療的可能性。

最近，已經(jīng)開發(fā)了使用基因和干細(xì)胞對(duì)脫發(fā)進(jìn)行治療的方法。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)，韓國專利號(hào)10-0771171(2007年10月29日)描述了用于毛囊干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和分化的方法，以及用于禿發(fā)的治療組合物。韓國專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2008-0097593(2008年11月06日)描述了包含來源于人脂肪組織和毛囊細(xì)胞的多能干細(xì)胞的細(xì)胞治療劑。此外，韓國專利號(hào)10-1218101(2013年1月3日)描述了用于促進(jìn)毛發(fā)生長和預(yù)防脫發(fā)的組合物，該組合物包含來自羊水的胎兒來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

然而，使用干細(xì)胞的上述試劑對(duì)毛發(fā)生長的作用并不充分，因此，正在進(jìn)行使用干細(xì)胞的各種嘗試，以開發(fā)用于對(duì)脫發(fā)進(jìn)行治療的有效治療劑。

在這一方面，本發(fā)明人在努力鑒定來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)毛發(fā)生長的作用的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)與先前的看法相反，TGF-β(已知為引起脫發(fā)的物質(zhì))對(duì)臍帶血干細(xì)胞的處理分泌了對(duì)毛發(fā)生長有效的蛋白質(zhì)，并且還確認(rèn)了通過培養(yǎng)用TGF-β刺激的干細(xì)胞而獲得的條件培養(yǎng)基表現(xiàn)出比先前已知的案例更優(yōu)秀的毛發(fā)生長促進(jìn)效果，從而完成了本發(fā)明。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

1.韓國專利號(hào)10-0771171(2007年10月29日)

2.韓國專利號(hào)10-1422559(2014年7月17日)

3.韓國專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2013-0009117(2013年1月23日)

4.韓國專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2014-0125735(2014年10月29日)

5.韓國專利申請(qǐng)公開號(hào)10-2008-0097593(2008年11月6日)

6.韓國專利號(hào)10-1218101(2013年1月3日)

非專利文獻(xiàn)

1.Dong L，Hao H，Xia L，Liu J，Ti D，Tong C，Hou Q，Han Q，Zhao Y，Liu H，F(xiàn)u X，Han W，Treatment of MSCs with Wnt1a-conditioned medium activates DP cells and promotes hair follicle regrowth，Sci Rep.2014Jun 25，4：5432.doi:10.1038/srep05432。

2.Park BS，Kim WS，Choi JS，Kim HK，Won JH，Ohkubo F，F(xiàn)ukuoka H，Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia:evidence of increased growth factor secretion，Biomed Res.，2010年2月，31(1)：27-34。

3.Jeong YM，Sung YK，Kim WK，Kim JH，Kwack MH，Yoon I，Kim DD，Sung JH，Ultraviolet B preconditioning enhances the hair growth-promoting effects of adipose-derived stem cells via generation of reactive oxygen species，Stem Cells Dev，2013年1月1日，22(1)：158-68.doi:10.1089/scd.2012.0167.Epub 2012Aug 13。

在本發(fā)明的整個(gè)申請(qǐng)文件中，參考了許多參考文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)，并且適當(dāng)?shù)刂赋隽似湟?。將所引用的參考文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以其整體作為參考并入本申請(qǐng)文件中，從而對(duì)本發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域的水平和本發(fā)明的公開內(nèi)容進(jìn)行更清楚地解釋。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明使用通過特定的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，通過刺激干細(xì)胞分泌與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，并且本發(fā)明的主要目的是提供用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物，該組合物含有通過特定的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。

本發(fā)明的另一目的是提供使用該組合物用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的方法。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供有效使用該組合物的方法。

技術(shù)方案

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了通過用特定的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(包括TGF-β)刺激干細(xì)胞經(jīng)由分泌與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白而利用非常有效的毛發(fā)生長功能的各種用途。

在示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物，該組合物包含通過至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分，所述毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了通過包括TGF-β的至少一種因子刺激的條件培養(yǎng)基。

由于通過毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞產(chǎn)生了分泌Wnt3a、Bcl-2、細(xì)胞周期蛋白D-1等(已知為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)的效用，因此實(shí)現(xiàn)了預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。

具體而言，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的條件培養(yǎng)基具有以下功能：

(i)縮短毛發(fā)周期中的從休止期至生長期的轉(zhuǎn)變時(shí)間；

(ii)產(chǎn)生真皮乳頭細(xì)胞并促進(jìn)長度方面的生長；

(iii)增加毛囊的數(shù)量和大小；以及

(iv)增加頭皮皮膚的厚度。

特別地，干細(xì)胞可以是選自于由如下所組成的組中的至少一種：來源于骨髓、臍帶血、脂肪、血液、肝臟和腸道、皮膚、胃腸道、胎盤、神經(jīng)、腎上腺、上皮和子宮的人組織成體干細(xì)胞；以及胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選地，干細(xì)胞可以來源于骨髓、臍帶血或脂肪；更優(yōu)選來源于臍帶血的成體干細(xì)胞，例如，來源于臍帶血的間充質(zhì)細(xì)胞。此外，待使用的臍帶血優(yōu)選為來源于人的臍帶血。

通過毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的終濃度優(yōu)選為10％至30％、終濃度更優(yōu)選為25％。

另外，待使用的條件培養(yǎng)基可以是適用于動(dòng)物細(xì)胞生長的任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例可以包括MEM(最低必需培養(yǎng)基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基)和KM(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)、KBM(角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、EpiLife KM(角質(zhì)形成細(xì)胞-EpiLife培養(yǎng)基)等，并且優(yōu)選KM(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)、KBM(角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和EpiLife KM(角質(zhì)形成細(xì)胞-EpiLife培養(yǎng)基)。

特別地，可以通過在將毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物加入至干細(xì)胞后將干細(xì)胞刺激22小時(shí)至26小時(shí)，然后培養(yǎng)選自1至3天的時(shí)間段，獲得通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4等所組成的組中的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。更具體的實(shí)例可以參考本發(fā)明的實(shí)施例。

在本發(fā)明中，通過包括TGF-β的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞分泌已知作為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等，而干細(xì)胞的培養(yǎng)、本發(fā)明的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的特征在于該條件培養(yǎng)基包含選自于由Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1所組成的組中的至少一種蛋白質(zhì)。

能夠以藥物組合物或化妝品組合物的形式來制備和提供本發(fā)明的組合物。

同時(shí)，在另一示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明可以提供使用該組合物用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的優(yōu)選方法，如上所解釋的，所述組合物含有通過毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，所述毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組。

另外，本發(fā)明可以提供通過促進(jìn)毛發(fā)生長來對(duì)脫發(fā)進(jìn)行治療的方法，所述方法使用含有通過毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分的毛發(fā)生長促進(jìn)組合物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，可以通過局部涂抹或注射、更優(yōu)選局部涂抹來使用皮膚外給予。

因此，本發(fā)明基于以下事實(shí)的發(fā)現(xiàn)：使用已知為脫發(fā)誘導(dǎo)物質(zhì)的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(例如TGF-β、BMP等)、更優(yōu)選包括TGF-β的試劑對(duì)來源于臍帶血的干細(xì)胞進(jìn)行處理，能夠分泌對(duì)毛發(fā)生長有效的蛋白質(zhì)。這與常規(guī)的看法相反，并且本發(fā)明提供了經(jīng)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的優(yōu)異的預(yù)防脫發(fā)和毛發(fā)生長作用及其各種用途。

附圖說明

圖1是示出了用通過TGF-β刺激的來源于各種來源的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和對(duì)照組進(jìn)行處理的hDPC的細(xì)胞增殖的評(píng)估結(jié)果的圖；

圖2是確認(rèn)了在通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中包含的、與毛發(fā)組織分化關(guān)聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；

圖3是確認(rèn)了在用通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和對(duì)照組進(jìn)行處理后，真皮乳頭(DP)細(xì)胞長度生長的結(jié)果；

圖4是關(guān)于用通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和對(duì)照組進(jìn)行處理后，毛囊形成數(shù)的圖表和立體顯微照片；以及

圖5是確認(rèn)了用通過TGF-β刺激的來源于UCB(臍帶血)的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和對(duì)照組涂覆CH3小鼠3周后的毛發(fā)生長特征的圖片。

圖6是確認(rèn)了用通過TGF-β刺激的來源于脂肪和骨髓的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和對(duì)照組涂覆CH3小鼠4周(28天)后的毛發(fā)生長特征的圖片。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明中使用的術(shù)語可以如下文所述進(jìn)行定義。

“毛發(fā)生長促進(jìn)”和“脫發(fā)預(yù)防”是具有相似含義的術(shù)語，它們是指本領(lǐng)域中的促進(jìn)毛發(fā)形成和毛發(fā)生長以及預(yù)防脫發(fā)或毛發(fā)劣化的所有效果。

本文所使用的術(shù)語“干細(xì)胞”是指可以發(fā)育成任何組織的細(xì)胞。干細(xì)胞的兩個(gè)基礎(chǔ)特征是能夠通過重復(fù)分裂產(chǎn)生自我的自我更新以及能夠根據(jù)環(huán)境而分化成具有特定功能的細(xì)胞的多分化潛能。

本文所使用的術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”是指分離自人或哺乳動(dòng)物且可來源于各種組織的一類未分化的成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞中的造血干細(xì)胞主要以非粘附狀態(tài)存在，但是間充質(zhì)干細(xì)胞通常是粘附細(xì)胞。特別地，間充質(zhì)干細(xì)胞可以是臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)元來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且優(yōu)選臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。從各組織中分離干細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。

本文所使用的術(shù)語“條件培養(yǎng)基”是指包含在通過培養(yǎng)干細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基中含有的構(gòu)成成分的物質(zhì)，并且用于制備上述條件培養(yǎng)基的干細(xì)胞在其種類方面不受限制。例如，用于制備條件培養(yǎng)基的干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。此外，成體干細(xì)胞可以來源于所有組織的成體干細(xì)胞。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中，使用臍帶血來源的成體干細(xì)胞來制備條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，通過將TGF-β向其中加入22小時(shí)至26小時(shí)進(jìn)行刺激，隨后培養(yǎng)選自1至3天的時(shí)間段而獲得干細(xì)胞。

本文所使用的術(shù)語“分化”是指細(xì)胞中的現(xiàn)象，其中，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能在通過細(xì)胞分裂的細(xì)胞生長期間特化，即，生物體的組織或細(xì)胞的形狀或功能方面的漸進(jìn)性變化，使得它們可以執(zhí)行分配給它們的工作。通常，該術(shù)語是指將相對(duì)簡單的系統(tǒng)分化為兩個(gè)以上的不同性質(zhì)的部分系統(tǒng)的現(xiàn)象。

本文所使用的術(shù)語細(xì)胞的“增殖”或“生長”是指通過細(xì)胞分裂使具有相同性質(zhì)的細(xì)胞增加，并且通常是指多細(xì)胞生物體的軀體中的細(xì)胞數(shù)目的增加。當(dāng)增殖(擴(kuò)增)后的細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到一定時(shí)期時(shí)，細(xì)胞的特征在其變化(分化)時(shí)受到調(diào)整。

本文所使用的術(shù)語“培養(yǎng)基”是指細(xì)胞的體外生長和增殖所必需的混合物，包含細(xì)胞生長和增殖所必需的元素，例如氨基酸、各種營養(yǎng)物質(zhì)、血清、生長因子、無機(jī)物質(zhì)等。特別地，本發(fā)明的培養(yǎng)基是用于干細(xì)胞的生長和增殖的培養(yǎng)基。

本文所使用的術(shù)語“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞存活所需的糖、氨基酸和水等而不包含血清、營養(yǎng)物質(zhì)和各種生長因子的混合物。可以通過人工合成加以制備或通過購買可商購的培養(yǎng)基來使用本發(fā)明所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。商業(yè)上制備的培養(yǎng)基可以包括例如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)、EDM(內(nèi)皮分化培養(yǎng)基)、MEM(最低必需培養(yǎng)基)、BME(基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最低必需培養(yǎng)基)、G-MEM(Glasgow最低必需培養(yǎng)基)和Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基，但不限于此。

本文所使用的術(shù)語“治療”是指為了獲得有利或優(yōu)選的臨床結(jié)果的手段(access)。對(duì)于本發(fā)明的益處，有利或優(yōu)選的臨床結(jié)果作為非限制性實(shí)例可包括癥狀緩解、疾病范圍縮小、疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即不惡化)、疾病進(jìn)程延遲或減弱、疾病狀態(tài)(部分或全部地)改善或暫時(shí)緩解和變好、以及存在物的可檢測或不可檢測。術(shù)語“治療”同時(shí)指治療性處理和預(yù)防性或防治性治療方法。治療不僅包括可預(yù)防傷殘，而且還包括在已經(jīng)發(fā)生的傷殘中所需的治療。術(shù)語“緩和(palliating)”是指相對(duì)于未進(jìn)行治療的情況而言的不期望的臨床征象和/或疾病狀態(tài)范圍的減小和/或進(jìn)展時(shí)程的延長或延伸。

本文所使用的術(shù)語“有效量”是指能夠影響有利或期望的臨床結(jié)果或生化結(jié)果的合適的量。有效量可以一次給予或多次給予。有效量是適于暫時(shí)緩解、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減緩或延緩疾病狀態(tài)進(jìn)展的量。在本發(fā)明中，有效量是指緩解或延緩脫發(fā)進(jìn)展或促進(jìn)毛發(fā)生長所需的量。如果待獲得益處的動(dòng)物可以耐受組合物的給予，或者該給予適合于動(dòng)物，則該組合物被認(rèn)為是“藥學(xué)上或生理上可接受的”。當(dāng)給予的量在生理學(xué)上重要時(shí)，可以認(rèn)為制劑以“治療學(xué)上有效量”給予。當(dāng)制劑本身的存在引起有益患者數(shù)量方面的生理學(xué)上可檢測的變化時(shí)，該制劑被認(rèn)為是生理上有意義的。

本文所使用的術(shù)語“約”是指相對(duì)于參比的量、水平、值、數(shù)量、頻次、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度而言，變化程度為30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、數(shù)量、頻次、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。

在本發(fā)明的申請(qǐng)文件中，除非在上下文中另有需要，否則術(shù)語“包括/包含(include/including)”應(yīng)當(dāng)解釋為包括/包含所表明的步驟或成分或者步驟或成分的組，但并不排除其它可選的步驟或成分或者步驟或成分的組。

下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

本發(fā)明涉及用特定因子處理的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的特定功能(即，預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的功能)及其用途。

可用作用來顯著預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物的因子為選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF、BMP2/4等所組成的組中的至少一種，最優(yōu)選包括TGF-β的因子。

干細(xì)胞是能夠自我復(fù)制并分化成兩種以上細(xì)胞的細(xì)胞，并且根據(jù)其來源可以使用胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。在本發(fā)明中，待使用的干細(xì)胞可以是來源于各種組織來源的成體干細(xì)胞，例如來源于脂肪、子宮、骨髓、肌肉、胎盤、臍帶血或皮膚(上皮)的組織。特別地，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。間充質(zhì)干細(xì)胞通常是有助于血細(xì)胞生成的基質(zhì)，并且可以分化成各種中胚層細(xì)胞，并且容易增殖且同時(shí)保持未分化狀態(tài)。在示例性實(shí)施方式中，使用來源于脂肪、骨髓和臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。最優(yōu)選使用來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞。

臍帶血是指來自臍帶的血液，并且含有大量的產(chǎn)生白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等的造血干細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞，而且還含有產(chǎn)生軟骨、骨骼、肌肉、神經(jīng)等的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此，其具有高的藥用價(jià)值。臍帶血的特征不僅在于造血干細(xì)胞的數(shù)量以高于骨髓或外周血液中的濃度存在于臍帶血中，而且還在于臍帶血具有比起骨髓中發(fā)現(xiàn)的造血干細(xì)胞而言顯著更高的增殖能力、自我復(fù)制能力和分化能力。另外，臍帶血可以通過簡單的外科手術(shù)從待丟棄的臍帶中獲得，并且相對(duì)于其量而言還有相對(duì)大量的造血干細(xì)胞和干細(xì)胞。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明使用人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSC)。

特別地，臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞：(i)當(dāng)作為細(xì)胞治療劑使用時(shí)，與來源于其它組織的干細(xì)胞不同，其幾乎沒有免疫排斥；(ii)由于它們是從待丟棄的胎盤和臍帶中收集的，因而并不會(huì)伴有從中獲取干細(xì)胞的受試者的病痛；以及(iii)當(dāng)施用時(shí)，可以直接施用至患有疾病的區(qū)域。特別地，其優(yōu)點(diǎn)在于，當(dāng)將該間充質(zhì)干細(xì)胞移植入實(shí)際靶區(qū)域中時(shí)，旁分泌效應(yīng)被激活，并因此分泌能夠治療、復(fù)原或恢復(fù)患有疾病的區(qū)域的因子(蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子)，從而治愈疾病。

待用于分離和培養(yǎng)從臍帶血收集的間充質(zhì)干細(xì)胞的方法可以為本領(lǐng)域已知的任何方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)，例如，可以使用包括韓國專利號(hào)10-0494265中公開的方法在內(nèi)的所有常規(guī)方法。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用以下方法。

通過離心將單核細(xì)胞從收集的臍帶血中分離，并洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)。將所得到的單核細(xì)胞通過以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N在培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，從而使細(xì)胞能夠增殖，并同時(shí)形成單層。本文中，當(dāng)在相差顯微鏡下觀察時(shí)，以具有長的均勻的紡錘形狀的集落的形式增殖的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。然后當(dāng)細(xì)胞生長至融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)和增殖直至獲得適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。

特別地，本發(fā)明的特征在于優(yōu)選通過用特定的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物進(jìn)行處理來刺激干細(xì)胞。退行期誘導(dǎo)物包括選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種因子，并且最優(yōu)選TGF-β。

相對(duì)于細(xì)胞體積，用于處理的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物的濃度為8-15ng/mL、優(yōu)選8-12ng/mL、最優(yōu)選9-11ng/mL。在本發(fā)明的示例性實(shí)施方式中，當(dāng)細(xì)胞融合被確定為80％以上時(shí)，用約10ng/mL的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

TGF-β是具有各種功能的細(xì)胞因子，并且是已知通過經(jīng)由Smads調(diào)節(jié)TGF-β相關(guān)基因的表達(dá)而與細(xì)胞生長和分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的基質(zhì)合成密切相關(guān)的物質(zhì)，其是存在于細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子并且據(jù)報(bào)道參與毛囊細(xì)胞的壞死。

脫發(fā)的最大原因是作為激素的二氫睪酮(DHT)綴合至作為還原劑的5-α-還原酶和睪酮，并且進(jìn)入正常毛發(fā)細(xì)胞的DHT遞送了破壞細(xì)胞核信號(hào)的DNA細(xì)胞，從而導(dǎo)致減小毛囊尺寸或損壞以及脫發(fā)。特別地，毛囊細(xì)胞凋亡因子通過毛發(fā)細(xì)胞的DNA破壞信號(hào)來攻擊鄰近的毛囊細(xì)胞，從而導(dǎo)致脫發(fā)，毛囊的壞死因子的實(shí)例包括BMP、DKK-1和TGF-β(J Cell.Sci，2006，J.Anat.，2003)。也就是說，TGF-β或BMP等是已知的誘導(dǎo)脫發(fā)的物質(zhì)。

因此，為了預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的效果而用這些物質(zhì)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不容易想到的技術(shù)，并且它也是構(gòu)成了本發(fā)明的重要特征的特點(diǎn)。

本發(fā)明人首次確認(rèn)了通過用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物進(jìn)行處理來刺激干細(xì)胞分泌出了有效用于毛發(fā)生長的物質(zhì)。

用這些因子刺激的干細(xì)胞分泌出了已知為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等，并且通過這些蛋白質(zhì)可以進(jìn)一步改善預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的功能。

因此，在本發(fā)明中，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含選自于由Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1所組成的組中的至少一種蛋白質(zhì)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以通過向干細(xì)胞添加TGF-β而將干細(xì)胞刺激22小時(shí)至26小時(shí)、最優(yōu)選約24小時(shí)，獲得經(jīng)毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激、例如經(jīng)TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，將經(jīng)刺激的干細(xì)胞培養(yǎng)選自1至3天的時(shí)間段。代表性的制備方法可以參考本發(fā)明的實(shí)施例。

因此，在另一示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明包括通過用毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激干細(xì)胞來制備用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法。

干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的終濃度優(yōu)選為約10％至50％、更優(yōu)選約10％至30％、甚至更優(yōu)選20％至30％、并且最優(yōu)選約25％。

特別地，本發(fā)明的干細(xì)胞可通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行增殖和培養(yǎng)。

作為合適的培養(yǎng)基，可以使用可在實(shí)驗(yàn)室中制備的伴隨有用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)所必需或所開發(fā)的合適組分(例如合成代謝碳、氮和/或痕量營養(yǎng)物)的任何可用的培養(yǎng)基。

作為非限制性實(shí)例，培養(yǎng)基是適合于動(dòng)物細(xì)胞生長的任何基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并且通常用于培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以包括MEM(最低必需培養(yǎng)基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基)和KM(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)，以及可以不受限地使用的本領(lǐng)域中使用的任何培養(yǎng)基。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可以選自于由如下所組成的組：α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)、KM(角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基)、KBM(角質(zhì)形成細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、EpiLife KM培養(yǎng)基(角質(zhì)形成細(xì)胞-EpiLife培養(yǎng)基)、DMEM培養(yǎng)基(Welgene)、MCDB 131培養(yǎng)基(Welgene)、IMEM培養(yǎng)基(GIBCO)、DMEM/F12培養(yǎng)基、PCM培養(yǎng)基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC擴(kuò)增培養(yǎng)基(Chemicon)。

可以向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入痕量營養(yǎng)物、氮和碳的合成代謝供應(yīng)源，并且作為非限制性實(shí)例，可以加入血清供應(yīng)源、生長因子、氨基酸、抗生素、維生素、還原劑和/或糖供給源。然而，顯而易見的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以選擇用于來源于各種組織來源的干細(xì)胞的最合適的培養(yǎng)基，或者根據(jù)已知的方法組合并適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，使用α-MEM培養(yǎng)基和K-SFM培養(yǎng)基等。

另外，顯然可以基于本領(lǐng)域的常識(shí)，在調(diào)節(jié)例如培養(yǎng)環(huán)境、時(shí)間、溫度等條件的同時(shí)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

在示例性的實(shí)施方式中，將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)在α-MEM培養(yǎng)基中，直至細(xì)胞融合為約80％-90％、優(yōu)選約90％，并且例如，使用PBS等對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)一步在K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20小時(shí)至25小時(shí)、優(yōu)選24小時(shí)。

本文所使用的術(shù)語“融合(％)”是表示本領(lǐng)域常規(guī)使用的每面積的細(xì)胞濃度(飽和程度)的術(shù)語，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)中頻繁使用的相對(duì)地表示每單位面積的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞濃度)的單位。本發(fā)明還包括制備這些尺寸為8μm以下的干細(xì)胞及用于該干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法。

同時(shí)，該方法可以進(jìn)一步包括用胰蛋白酶對(duì)在根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟。當(dāng)用胰蛋白酶對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，可以獲得處于單核細(xì)胞形狀的干細(xì)胞。特別地，胰蛋白酶進(jìn)行處理以抑制細(xì)胞之間的積聚，從而獲得單細(xì)胞形狀，并且可以使用能夠抑制細(xì)胞之間形成積聚的任何物質(zhì)。

可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)已知的容器進(jìn)行干細(xì)胞的培養(yǎng)。例如，可以使用三維生物反應(yīng)器或旋轉(zhuǎn)器、或者在普通的粘附容器中培養(yǎng)干細(xì)胞。

本發(fā)明涉及通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的條件培養(yǎng)基的用途，所述條件培養(yǎng)基具有極其出色的預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的作用。

特別地，通過這些因子刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含已知為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等，因此，通過真正的真皮乳頭細(xì)胞的產(chǎn)生、長度生長的促進(jìn)、毛囊數(shù)量和大小的增加、頭皮厚度的增加等作用，它們不僅具有簡單的延緩脫發(fā)癥狀的作用，而且還具有毛發(fā)生長的作用(即，毛發(fā)形成和生長的作用)。

用于減少DHT(其為脫發(fā)的原因)的藥物(迄今為止所使用的)的實(shí)例包括使用非那雄胺制備的然而，該藥物的主要機(jī)理是該藥物抑制5-α還原酶的作用以減少DHT，從而矯正脫發(fā)。僅具有阻斷5-α還原酶以抑制DHT形成的作用，從而最大程度地延緩男性類型脫發(fā)的進(jìn)展。因此，是用于男性的治療劑，并因此具有如下局限：它不是用于促進(jìn)毛發(fā)生長的試劑，而僅僅是用于預(yù)防脫發(fā)的試劑。

然而，通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(最優(yōu)選包括TGF-β的誘導(dǎo)物)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)在于其是用于預(yù)防脫發(fā)的藥劑，同時(shí)也是用于促進(jìn)毛發(fā)生長的出色的試劑。

在下文中，將對(duì)如下的條件培養(yǎng)基的脫發(fā)預(yù)防和毛發(fā)生長特性進(jìn)行描述，所述條件培養(yǎng)基是通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。

(i)減少毛發(fā)周期中的從休止期至生長期的轉(zhuǎn)變時(shí)間。

人毛發(fā)喪失，同時(shí)周期性地重復(fù)生長期、退行期和休止期，然后再次形成，并且毛發(fā)周期通過激素調(diào)節(jié)或多種生長因子的調(diào)節(jié)來建立。真皮乳頭細(xì)胞具有生長期(其中生長變得活躍)、退行期(其中開始退化)和休止期的周期。在休止期后，當(dāng)接收到來自相鄰細(xì)胞的信號(hào)時(shí)，真皮乳頭細(xì)胞進(jìn)入生長期，并且建立細(xì)胞更新，并最終引起新的毛發(fā)的形成。

通過誘導(dǎo)物刺激的本發(fā)明的條件培養(yǎng)基并不具有歸因于激素等的暫時(shí)性作用，而是通過使毛發(fā)周期調(diào)節(jié)正常化而具有永久性毛發(fā)生長效應(yīng)的作用。

(ii)產(chǎn)生真皮乳頭(DP)細(xì)胞，促進(jìn)長度生長并顯著增加毛囊的數(shù)量和大小。

毛囊是僅由哺乳動(dòng)物擁有的皮膚的附屬器官，從胎兒期產(chǎn)生，并且通過上皮和間充質(zhì)之間的相互作用而形成。

胎兒期的毛囊的產(chǎn)生通過來自真皮的信號(hào)觸發(fā)，其結(jié)果是上皮變厚并形成平板。來自厚的上皮平板的真皮信號(hào)誘導(dǎo)了來源于間充質(zhì)的真皮細(xì)胞的凝集，并且從由此形成的凝集體再次發(fā)出真皮信號(hào)。該信號(hào)促進(jìn)了真皮細(xì)胞的增殖，并同時(shí)誘導(dǎo)向上皮細(xì)胞的真皮侵襲，從而包圍在凝集體的周圍，并隨后形成真皮乳頭。因此，形成了第一毛囊結(jié)構(gòu)，并且隨著上皮細(xì)胞繼續(xù)增殖和分化，它們發(fā)育成形成毛發(fā)的成熟毛囊。毛囊的基質(zhì)細(xì)胞和真皮乳頭細(xì)胞之間的相互作用通過成熟的毛囊中的基底膜引起毛囊的基質(zhì)細(xì)胞的特定分化，其結(jié)果是形成毛發(fā)并使其生長。此外，該相互作用產(chǎn)生了毛囊的周期、維持了器官、并確定了生物特性(例如毛發(fā)的厚度和形狀)。

在毛囊中，決定生物特性的兩個(gè)重要因素是外根鞘(ORS)(其為毛囊上皮)和間充質(zhì)來源的真皮乳頭(DP)，并且毛發(fā)通過重復(fù)毛發(fā)周期而生長和喪失。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，確認(rèn)了使用hDPC、ORS、hKC和HaCaT細(xì)胞的通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基有效地增殖了真皮乳頭(DP)細(xì)胞。

此外，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了，原始DP細(xì)胞的毛囊長度的助長作用、毛囊形成的促進(jìn)作用、毛發(fā)生長的速度和量極其出色。

(iii)增加頭皮皮膚的厚度。

此外，通過上述因子刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基還可以有效地增加皮膚的厚度和長度，從而改善與毛發(fā)生長相關(guān)的整體環(huán)境。

因此，基于如下的新事實(shí)，毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物、特別是TGF-β和BMP等(盡管它們已知為脫發(fā)誘導(dǎo)物質(zhì))對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行處理，可以分泌對(duì)毛發(fā)生長而有效的蛋白質(zhì)，本發(fā)明展示出改善毛發(fā)生長所需的整體環(huán)境的作用。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，通過使用小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及體外和離體實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了用TGF-β處理的臍帶血來源的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基展示出極其優(yōu)異的毛發(fā)生長作用。

能夠觀察毛發(fā)生長可能性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的實(shí)例可以確認(rèn)在具有正常的毛發(fā)生長周期和快速誘導(dǎo)的生長期的小鼠中縮短休止期的作用。特別地，可以常規(guī)地使用C57/BL6小鼠或C3H小鼠，因?yàn)檫@些小鼠能夠觀察具有黑色素顏色的毛發(fā)。使用使毛發(fā)生長和毛囊增殖的能夠觀察到DP增殖的裸鼠。在本發(fā)明中，可以使用本領(lǐng)域已知的用于確認(rèn)毛發(fā)生長作用的任何小鼠。

然而，優(yōu)選使用C3H小鼠。與具有約兩周的休止期的普通小鼠不同，C3H小鼠可以保持至少4周的休止期，并因此作為斑禿小鼠模型更有用。也就是說，可以通過確認(rèn)誘導(dǎo)C3H小鼠的毛發(fā)周期進(jìn)入生長期的作用來對(duì)毛發(fā)生長作用的優(yōu)越性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

因此，一方面，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物、其制備方法以及使用該組合物預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的方法，所述組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(最優(yōu)選包括TGF-β的誘導(dǎo)物)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

該組合物能夠以不顯示任何細(xì)胞毒性的10％至50％(v/v)、優(yōu)選約10％至30％(v/v)、優(yōu)選20％至30％(v/v)、最優(yōu)選25％(v/v)的有效濃度而被包含，但不限于此。

在本發(fā)明的實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物可以包括藥物組合物和/或化妝品組合物。

藥物組合物

在另一方面，本發(fā)明可以提供用于促進(jìn)毛發(fā)生長的藥物組合物，所述藥物組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(最優(yōu)選包括TGF-β的誘導(dǎo)物)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

脫發(fā)主要分為瘢痕性脫發(fā)和非瘢痕性脫發(fā)，非瘢痕性脫發(fā)包括先天性脫發(fā)、男性類型脫發(fā)和斑禿等。在本發(fā)明中，脫發(fā)包括上述所有的脫發(fā)，并且不限于此。

待包含在本發(fā)明的藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的載體為在制造中常規(guī)使用的載體，并且可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、海藻酸鹽/酯、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油等，但不限于此。除了上述成分之外，本發(fā)明的藥物組合物還可以含有潤滑劑、保濕劑、甜味劑、矯味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等。

本發(fā)明的藥物組合物的劑量的適當(dāng)量可以根據(jù)各種因素而變化，所述因素包括配制方法、給予方法、患者年齡、體重、性別、疾病嚴(yán)重程度、飲食、給予持續(xù)時(shí)間、給予途徑、釋放速率和反應(yīng)靈敏度，并且經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)生可以容易地確定和開出用于預(yù)期治療的有效劑量。同時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物的劑量不限于此，并且可以是每天0.01mg/kg(體重)至2000mg/kg(體重)。

本發(fā)明的藥物組合物可以口服給予或腸胃外給予。當(dāng)腸胃外給予時(shí)，可以通過靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮膚外給予來給予藥物組合物。優(yōu)選地，藥物組合物經(jīng)腸胃外給予。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物的給予途徑可以根據(jù)疾病的類型來確定。

例如，本發(fā)明的藥物組合物可更優(yōu)選地局部(locally或topically)給予以施用于皮膚上。用于施用本發(fā)明的藥物組合物的區(qū)域不僅包括頭皮，還包括需要毛發(fā)生長的軀體的任何部分。例如，可將其用于改善其中的毛發(fā)或其它體毛由于損傷造成的疤痕而損壞的區(qū)域，或用于改善需要美容護(hù)理作用的區(qū)域，例如寬前額或M型前額、睫毛或眉毛，以及用于改善無毛癥

優(yōu)選地，可經(jīng)由涂抹或注射、更優(yōu)選經(jīng)由涂抹的皮膚外給予來給予本發(fā)明的組合物。

在使用涂抹給予的情況下，通過簡單地將組合物以一次至三次涂抹在頭皮上，本發(fā)明示出了預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的顯著的作用。

特別地，在經(jīng)由注射給予的情況下，推薦將該組合物注射至真皮層中，同時(shí)注射器的針的端部的孔朝上，從而使組合物在充分?jǐn)U散入皮膚的真皮層之后遞送至毛細(xì)血管中，即，為了防止組合物在真皮層上短暫保留后立即進(jìn)入真皮層。

化妝品組合物

在另一方面，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)毛發(fā)生長的化妝品組合物，所述化妝品組合物含有通過選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(最優(yōu)選包括TGF-β的誘導(dǎo)物)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

本發(fā)明的化妝品組合物能夠以本領(lǐng)域中常規(guī)制造的任何制劑制備。例如，化妝品組合物可以配制成乳液、面霜、化妝水、面膜、粉底、洗液、美容液、發(fā)用化妝品，但不限于此。

優(yōu)選地，可以通過加入常規(guī)添加劑將化妝品組合物制備為組合物，例如洗發(fā)香波、潤發(fā)劑、生發(fā)油、發(fā)膠、洗發(fā)劑、發(fā)膜、噴發(fā)劑、發(fā)用摩絲、焗油膏、染發(fā)劑、護(hù)發(fā)素、用于促進(jìn)毛發(fā)生長的它們的混合類型(例如洗發(fā)香波和潤發(fā)劑的混合類型、潤發(fā)劑和焗油膏的混合類型)和用于毛發(fā)生長的液態(tài)試劑等，并且可以包括其氣溶膠類型。

當(dāng)制劑類型為膏劑、面霜或凝膠時(shí)，載體的組分可以為動(dòng)物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等。當(dāng)制劑類型為粉劑或噴霧劑時(shí)，載體的組分可以為乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末，特別地，在噴霧劑的情況下，可以包含推進(jìn)劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。當(dāng)制劑類型為液體或乳劑時(shí)，載體的組分可以為溶劑、增溶劑或乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇的脂肪酸酯。當(dāng)制劑類型為懸浮劑時(shí)，載體的組分可以為液相稀釋劑，例如水、乙醇或丙二醇；懸浮液，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯；微晶纖維素；偏氫氧化鋁；膨潤土；瓊脂或黃蓍膠等。當(dāng)制劑類型為含表面活性劑的清潔劑時(shí)，載體的組分可以為脂族醇硫酸酯/鹽、脂族醇醚硫酸鹽/酯、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、?；撬峒柞?、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽/酯、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

除了活性成分以外，待包含在本發(fā)明的化妝品組合物中的成分可包括在化妝品組合物中常用的組分和載體，所述組分例如抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、常規(guī)助劑(如色素和矯味劑)。

可以通過任何常用的方法來制備化妝品組合物。

優(yōu)選地，用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的化妝品組合物可以通過直接將其施用在頭皮或毛發(fā)上或者將其注射在頭皮或毛發(fā)上的皮膚施用來使用。

基于成人體重，本發(fā)明的組合物中包含的作為活性成分的混合提取物的施用量為40mg/kg以下、優(yōu)選20mg/kg-40mg/kg。

將組合物施用在皮膚上的方法可以包括本領(lǐng)域公開的任何方法。本發(fā)明的化妝品組合物可以單次使用或重復(fù)使用，或者可以與其它化妝品組合物組合使用。另外，可以根據(jù)常規(guī)使用方法來使用具有出色的皮膚保護(hù)作用的本發(fā)明的化妝品組合物，并且其施用頻率可以根據(jù)使用者的皮膚狀況或品味而變化。

脫發(fā)治療的方法

此外，另一方面，本發(fā)明涉及通過使用促進(jìn)毛發(fā)生長的組合物促進(jìn)毛發(fā)生長來治療脫發(fā)的方法、制備該組合物的方法以及使用該組合物預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的方法，所述化妝品組合物含有用選自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所組成的組中的至少一種毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(最優(yōu)選包括TGF-β的誘導(dǎo)物)刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

在上述的治療脫發(fā)的方法中，干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或組合物的細(xì)節(jié)與上文的描述相同。

在上述的治療脫發(fā)的方法中，特別優(yōu)選使用利用涂抹或注射方法的皮膚外給予方法。特別地，優(yōu)選將該組合物的活性成分注射入真皮層中，同時(shí)注射器的針的端部的孔朝上，從而使得組合物在充分?jǐn)U散至皮膚的真皮層之后遞送至毛細(xì)血管中，即，為了防止組合物在真皮層上短暫保留后立即進(jìn)入真皮層。

如上所述，參考藥物組合物和化妝品組合物，對(duì)通過前述解釋的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的功能進(jìn)行了解釋。然而，對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明涉及用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的各種形式的組合物以及使用具有各種應(yīng)用的組合物的方法，所述組合物含有通過毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為活性成分。

實(shí)施例

在下文中，將參照所附的示例性實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。這些實(shí)施方式僅出于說明目的而公開，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)顯而易見的是它們不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。

盡管本發(fā)明人使用了臍帶血來源的干細(xì)胞和TGF-β，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，也可以使用其它來源的干細(xì)胞和其它毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物(Current Biology，19，R132-R142，2009年2月10日；J Invest Dermatol，124：675-685，2005年)。

材料和方法

1.干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的制備

(1)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

在本發(fā)明中，使用通過Medipost Co.,Ltd.(韓國)提供的人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。可以從收集臍帶血的步驟和從臍帶血分離間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)的步驟獲得所述細(xì)胞。下面將對(duì)各個(gè)步驟的細(xì)節(jié)進(jìn)行描述。

在收集臍帶血的步驟中，在正常的自然陰道分娩(NSVD)的情況下，在嬰兒分娩之后，從排出的臍帶靜脈中收集臍帶血，而胎盤仍保留在子宮中；或者在剖宮產(chǎn)的情況下，在嬰兒分娩后胎盤也從子宮中排出的狀態(tài)下，從臍帶靜脈中收集臍帶血。

在本發(fā)明中，當(dāng)從分娩后自子宮排出的臍帶靜脈中收集臍帶血時(shí)，在新生兒誕生之后，通過無菌操作從與胎盤和胎兒相連接的臍帶靜脈中收集臍帶血。一旦獲得臍帶靜脈，使用收集針將臍帶血收集到含有抗凝血?jiǎng)┑哪殠а占?儲(chǔ)袋)中。

關(guān)于從由此收集的臍帶血中分離干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)的方法，可以使用包括韓國專利號(hào)10-0494265中公開的方法在內(nèi)的任何常規(guī)方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)。

本發(fā)明人通過離心從由此收集的臍帶血中分離出單核細(xì)胞，漂洗數(shù)次以除去雜質(zhì)，并將單核細(xì)胞以適當(dāng)?shù)臐舛冉臃N在培養(yǎng)容器中并進(jìn)行培養(yǎng)。本文中，當(dāng)在相差顯微鏡下觀察時(shí)，確認(rèn)以具有長的均勻的紡錘體形狀的集落形式增殖的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。然后當(dāng)細(xì)胞生長至融合時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)和增殖直至獲得適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞。

另外，將來源于骨髓(LONZA，USA)和脂肪細(xì)胞(ATCC，USA)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)進(jìn)行培養(yǎng)，并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。下文中將該細(xì)胞分別描述為BM-MSC和AD-MSC。

(2)樣品條件培養(yǎng)基的制備

分別從hUCB-MSC、AD-MSC和BM-MSC制備樣品條件培養(yǎng)基。在保持于37℃和5％CO₂下的培養(yǎng)箱中，將儲(chǔ)存的細(xì)胞(儲(chǔ)存在LN2槽中)解凍并進(jìn)行培養(yǎng)，特別地，將細(xì)胞在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至細(xì)胞融合達(dá)到約90％。

然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細(xì)胞洗滌3次，在不添加酚紅的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(KM)中培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)基，并將整個(gè)過程重復(fù)3天。然后，將收集的培養(yǎng)基分別過濾(Top Filer System，Nunc)并冷藏保存及冷凍待用。

(3)經(jīng)刺激的CM的制備

CM制備方法與前述方法幾乎相同，但當(dāng)對(duì)來源于骨髓、臍帶血和脂肪的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，將所述細(xì)胞在不含酚紅的培養(yǎng)基中用TGF-β(10ng/ml)進(jìn)行處理，并將干細(xì)胞刺激24小時(shí)。

用PBS對(duì)用TGF-β處理的培養(yǎng)基漂洗3次，并用不含酚紅的新鮮K-SFM培養(yǎng)基替換，重復(fù)所述24小時(shí)培養(yǎng)至3天并收集。將由此收集的用TGF-β處理的條件培養(yǎng)基分別過濾，并用于實(shí)驗(yàn)用途，在不含酚紅的K-SFM培養(yǎng)基中稀釋至待使用的10％、25％和50％的終濃度。

2.用于觀察毛發(fā)生長的C3H小鼠的制備

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為Medipost(IRB批準(zhǔn)編號(hào)：131021-1)和Gyeongi Biocenter(IACUC項(xiàng)目編號(hào)：IACUC2014-4-10)，C3H小鼠購自Saeronbio Inc.(韓國)，并在Jackson實(shí)驗(yàn)室制備。

特別地，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中使用的C3H小鼠(Jackson lab，日本)當(dāng)它們的毛發(fā)被除去時(shí)開始休止期。不同于其它物種，C3H小鼠需要極長的時(shí)間才能轉(zhuǎn)變至生長期，因此將它們用作用于研究毛發(fā)生長作用的動(dòng)物模型。也就是說，不同于其它小鼠物種，在不用誘導(dǎo)物藥物進(jìn)行處理時(shí)，它們具有非常長的休止期，因此它們是用于確認(rèn)毛發(fā)生長作用的出色的動(dòng)物模型(Journal of Investigative Dermatology(2005)124，288-289)。

在作為毛發(fā)生長的一個(gè)時(shí)期的生長期期間，C3H小鼠皮膚表面的顏色變成黑色，而在退行期期間，它們的皮膚表面變成粉紅色，因此可以通過觀察它們的皮膚顏色來確認(rèn)毛發(fā)生長的時(shí)期。

本發(fā)明人獲得了7周齡C3H小鼠，并使它們能夠通過1周的適應(yīng)期來適應(yīng)新環(huán)境。此外，本發(fā)明人用來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)小鼠進(jìn)行接種，以觀察毛發(fā)生長周期的休止期(退行期)和進(jìn)入生長期的轉(zhuǎn)變時(shí)間。在該實(shí)例中，將用PBS注射的小鼠用作陰性對(duì)照。

同時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉以除去毛發(fā)。通過將3.36ml甲苯噻嗪(Bayer Korea Ltd.，2094L，韓國)與5ml舒泰(zoletil)(條形碼#3UHC，韓國)混合并加入7.47ml鹽水(JW-Pharma，REG#10055，韓國)來制備量為15.83ml的麻醉劑，并使用胰島素注射器(BD Ultra-Fine^TM II，韓國)用20μl所述麻醉劑對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。

然后，在確認(rèn)小鼠被麻醉后，使用毛發(fā)修剪器除去小鼠的毛發(fā)。將小鼠置于干凈的紙上，以與毛發(fā)生長方向相反的方向進(jìn)行首次毛發(fā)去除，將小鼠放置24小時(shí)，觀察任何剩余毛發(fā)的存在，然后將剩余毛發(fā)除去。

3.本發(fā)明的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的局部施用

作為局部方法，將本發(fā)明的條件培養(yǎng)基以100μl的量以12小時(shí)的間隔施用于小鼠皮膚的外層上，并以相同方向擦洗8次，從而使它們可以被涂抹至皮膚中，同時(shí)注意不要污染鄰近區(qū)域。在4個(gè)點(diǎn)處以100μl的量施用條件培養(yǎng)基，并通過裸眼每天觀察毛發(fā)生長量、毛發(fā)厚度和局部顏色等。

4.MTT分析

為了測試細(xì)胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO₂下的培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，置于饑餓下24小時(shí)，并在各自的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)。

此外，使所完成的各自的實(shí)驗(yàn)組通過MTT分析接受關(guān)于細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖使率的測定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次以確保實(shí)驗(yàn)的可靠性。

用5mg/ml MTT試劑對(duì)各相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組(其以用于建立MTT分析實(shí)驗(yàn)方法的培養(yǎng)而完成)進(jìn)行處理至終濃度為1mg/ml，再培養(yǎng)另外的4個(gè)小時(shí)。然后，棄去上清液，將所得物溶解在DMSO中，將所得到的溶液以200μl/孔的量轉(zhuǎn)移至96孔板中，通過ELISA讀數(shù)器對(duì)570nm處的吸光度進(jìn)行測量。

5.作為原始細(xì)胞的原始hDPC和原始ORS的分離

在鹽水中準(zhǔn)備枕骨區(qū)的尸檢組織，并使用刀片將其分割成單個(gè)毛囊單位，以切割毛球，并去除毛干。將兩個(gè)注射器中的一個(gè)固定在毛球的下部(DP的下部)，而將另一注射器用于輕微接觸毛球的上部(DP的上部)，從而使真皮乳頭(DP)可以出來。

將真皮乳頭細(xì)胞放置在注射器的末端，并將混合物(DMEM+20％FBS+1％抗生素+1％兩性霉素B)和約10個(gè)真皮乳頭細(xì)胞加入至35mm的I型膠原涂布培養(yǎng)皿中，并當(dāng)以不足的量添加而不更換培養(yǎng)基時(shí)培養(yǎng)10天。在確認(rèn)真皮乳頭細(xì)胞粘附至培養(yǎng)皿后，3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)達(dá)到細(xì)胞融合時(shí)或當(dāng)其變?yōu)榈?周時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以供使用。

6.斑片(patch)分析法

當(dāng)C57BL/6小鼠出生時(shí)，將它們的皮膚剝離，洗掉血跡，用聚乙烯吡啶酮滅菌，并再次用鹽水洗滌以除去聚乙烯吡啶酮。

在從剝離的皮膚中除去脂肪層后，用膠原/分散酶對(duì)小鼠進(jìn)行處理，并在4℃下培養(yǎng)過夜。使用鉗狀骨針(forcep)將真皮和表皮分離，渦旋15分鐘，用過濾器篩分組織，并通過離心進(jìn)行分離(細(xì)胞下沉)。對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分開為1×10⁶個(gè)細(xì)胞，分別添加100μl培養(yǎng)基，并重懸浮以釋放細(xì)胞。使用胰島素注射器以在裸鼠背部上的4個(gè)部分進(jìn)行皮下注射。注射2周后，對(duì)皮膚進(jìn)行解剖，并確認(rèn)內(nèi)部形成的毛囊數(shù)。

7.初始毛發(fā)器官的培養(yǎng)

通過在枕骨區(qū)進(jìn)行解剖來收集毛發(fā)器官，并在鹽水中制備，以毛囊單位進(jìn)行修剪，并切割皮脂腺正下方的點(diǎn)。3天更換一次培養(yǎng)基，并對(duì)長度進(jìn)行測量。

實(shí)施例1：經(jīng)TGF-β激活的干細(xì)胞培養(yǎng)基的毛發(fā)生長作用的確認(rèn)

由于在增殖和真皮乳頭(DP)的形成期間可能起始毛發(fā)生長，通過觀察經(jīng)hUCB-MSC-CM增加DP生長的特征來檢查毛發(fā)生長的可能性。

對(duì)通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和未刺激的條件培養(yǎng)基針對(duì)毛發(fā)生長的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而使條件培養(yǎng)基的終濃度變成10％、25％和50％，并將它們用于體內(nèi)和離體實(shí)驗(yàn)。

1-1體外實(shí)驗(yàn)

使用原始人真皮乳頭細(xì)胞(DPC)通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)條件培養(yǎng)基的作用進(jìn)行檢查。

首先，為了測試細(xì)胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO₂下的培養(yǎng)箱中，將細(xì)胞在各自的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，置于饑餓下24小時(shí)，并在各自的實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，并通過MTT分析對(duì)細(xì)胞的增殖和毒性進(jìn)行測量。

結(jié)果，如圖1所示，通過TGF-β刺激的臍帶血來源的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出最高的細(xì)胞存活率。

此外，還對(duì)AD-MSC和BM-MSC的增殖進(jìn)行了測量(圖1和表1)。

[表1]

由這些結(jié)果，我們可以確認(rèn)通過TGF-β刺激的干細(xì)胞比起未經(jīng)刺激的培養(yǎng)基具有更優(yōu)秀的增殖。

1-2蛋白免疫印跡

同時(shí)，為了確認(rèn)與通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行的毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，用條件培養(yǎng)基候選物對(duì)hDPC進(jìn)行處理，并通過蛋白免疫印跡確認(rèn)與毛發(fā)組織分化相關(guān)的蛋白質(zhì)水平，結(jié)果示于圖2中。

結(jié)果，通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等(已知為毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)的高表達(dá)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的TGF-β對(duì)與毛發(fā)組織分化相關(guān)的干細(xì)胞具有作用。

也就是說，通過TGF-β刺激的本發(fā)明的臍帶血來源的干細(xì)胞有效地分泌了Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等(其為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白)，因此，根據(jù)毛發(fā)生長，含有該干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出最優(yōu)異的毛發(fā)生長作用(圖2)。

1-3離體實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明人還通過培養(yǎng)原始毛發(fā)器官進(jìn)行了針對(duì)毛發(fā)生長作用的離體實(shí)驗(yàn)。

為這一目的，作為能夠觀察毛發(fā)生長可能性的離體模型，制備了來自從人頭皮組織收集的毛囊的人原始真皮乳頭(DP)，并在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)。通過觀察，對(duì)就處理物質(zhì)而言的DP長度生長的促進(jìn)作用進(jìn)行比較。也就是說，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行處理，觀察原始DP長度的生長，并選擇有效的CM，或通過觀察比較CM對(duì)毛發(fā)生長的作用。

結(jié)果如圖3所示，與未處理的對(duì)照組相比，未經(jīng)刺激的CM和用TGF-β刺激的CM均誘導(dǎo)了毛發(fā)增殖，特別地，通過TGF-β刺激的CM顯示出比未經(jīng)刺激的CM更高的毛發(fā)生長作用(圖3A)。

此外，在毛囊生長長度的四重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與未經(jīng)刺激的條件培養(yǎng)基相比，通過TGF-β刺激的條件培養(yǎng)基顯示出更高的毛囊平均生長長度(圖3B)。

實(shí)施例2：斑片分析法

通過斑片分析模型對(duì)基于臍帶干細(xì)胞引發(fā)的條件培養(yǎng)基針對(duì)毛囊形成的作用進(jìn)行檢查。

作為經(jīng)由斑片分析模型進(jìn)行的離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，與對(duì)照培養(yǎng)基或用未經(jīng)刺激的條件培養(yǎng)基處理的組相比，通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出顯著更高的形成原始毛囊的作用。特別地，通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在形成原始毛囊方面顯示出最高的數(shù)量(圖4A)。

此外，在通過立體顯微鏡進(jìn)行的觀察中，與對(duì)照培養(yǎng)基或用未經(jīng)刺激的條件培養(yǎng)基處理的組相比，通過TGF-β刺激的條件培養(yǎng)基顯示出顯著更高的形成原始毛囊的作用(圖4B)。

實(shí)施例3：針對(duì)小鼠的局部施用

通過將本發(fā)明的條件培養(yǎng)基局部施用于處于休止期的C3H/HeJ小鼠上對(duì)毛發(fā)生長作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

為了對(duì)預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用通過各種因子刺激的條件培養(yǎng)基對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)。將條件培養(yǎng)基施用至各小鼠的背部上的四處位置，每天施用兩次，并且在約3周時(shí)對(duì)毛發(fā)生長特征進(jìn)行檢查。

結(jié)果，與對(duì)照培養(yǎng)基或用未經(jīng)刺激的條件培養(yǎng)基處理的組相比，確認(rèn)了通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出更高的毛發(fā)生長作用，其中，甚至與已報(bào)道的研究結(jié)果相比，通過TGF-β刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在毛發(fā)生長的各個(gè)領(lǐng)域(例如毛發(fā)生長速度、毛發(fā)生長量和毛發(fā)厚度等)均顯示出最優(yōu)異的作用(圖5)。

此外，在用AD-MSC和BM-MSC對(duì)CM和通過TGF-β刺激的CM進(jìn)行約28天后，對(duì)C3H/HeJ小鼠的毛發(fā)生長特征進(jìn)行檢查，在其中局部施用通過TGF-β刺激的CM的小鼠也顯示出優(yōu)異的毛發(fā)生長作用(圖6)。

因此，經(jīng)由體內(nèi)模型可以確認(rèn)通過TGF-β刺激的本發(fā)明的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的毛發(fā)生長作用在毛發(fā)生長速率、量和厚度等方面均非常優(yōu)異。

從這些結(jié)果確認(rèn)了用已知為脫發(fā)誘導(dǎo)材料的TGF-β對(duì)臍帶血來源的干細(xì)胞進(jìn)行處理，可以出乎預(yù)料地分泌對(duì)毛發(fā)生長有效的蛋白質(zhì)。

特別地，本發(fā)明的用TGF-β刺激的臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基顯示出遠(yuǎn)比現(xiàn)有的基于干細(xì)胞的物質(zhì)更優(yōu)異的毛發(fā)生長作用，并因此預(yù)期其非常有用地用于預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長。

工業(yè)實(shí)用性

通過包括TGF-β的毛發(fā)退行期誘導(dǎo)物刺激的干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基含有已知為與毛發(fā)組織分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的Wnt3a、Bcl-2和細(xì)胞周期蛋白D-1等。因此，干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基縮短了毛發(fā)周期中的從休止期至生長期的轉(zhuǎn)變時(shí)間，促進(jìn)了真皮乳頭細(xì)胞的長度增長、增加了毛囊的數(shù)量和大小以及頭皮的厚度，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的預(yù)防脫發(fā)和促進(jìn)毛發(fā)生長作用，并因此預(yù)期在可以利用該培養(yǎng)基的領(lǐng)域中非常有用。