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背景

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于制備免疫效應(yīng)細胞的改善平臺和相關(guān)方法。更具體而言，本發(fā)明涉及用于制備包含T細胞的治療性免疫效應(yīng)細胞組合物的可擴展、靈活、可靠且可復(fù)制的方法。

相關(guān)領(lǐng)域的描述

過繼免疫療法或過繼性細胞療法(ACT)是將基因修飾的T淋巴細胞轉(zhuǎn)移至對象，用于疾病的療法。過繼免疫療法尚未發(fā)揮其治療多種疾病的潛能，所述疾病包括癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病和免疫缺陷。然而，大多數(shù)(即使不是全部)的過繼免疫療法策略需要T細胞的活化和擴增步驟以產(chǎn)生臨床有效的治療劑量的T細胞。由于活細胞培養(yǎng)的固有復(fù)雜性以及患者之間的可變性，用于產(chǎn)生治療劑量的T細胞(包括工程化的T細胞)的當前技術(shù)仍然受繁瑣的T細胞制備方法的限制。既有的T細胞制備方法并不是容易擴展、可重復(fù)、可靠或高效的，并且通常產(chǎn)生易于耗竭和喪失效應(yīng)免疫細胞功能的較差T細胞產(chǎn)物。

迄今為止，工程化的T細胞過繼免疫療法僅滿足有限的成就并且通常顯示可變的臨床活性。因此，此類療法不適合于廣泛的臨床用途。

簡要概述

本發(fā)明大體上提供用于過繼性細胞療法的方法。

在不同實施方案中，提供用于制備T細胞治療劑的方法，其包括：獲得包含T細胞和抗原遞呈細胞(APC)的細胞群；將所述細胞群在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述細胞培養(yǎng)基包含：i)一種或多種細胞因子，ii)抗CD3抗體或其CD3結(jié)合片段，以及iii)抗CD28抗體或其CD28結(jié)合片段、B7-1或其CD28結(jié)合片段、或者B7-2或其CD28結(jié)合片段，其中所述培養(yǎng)活化并刺激T細胞；用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的細胞群；以及將細胞群于細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)以擴增轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞；從而制備T細胞治療劑。

在具體實施方案中，細胞群獲自外周血、外周血單核細胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織或腫瘤。

在某些實施方案中，T細胞獲自外周血、外周血單核細胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織、腫瘤或T細胞系。

在另外的實施方案中，APC獲自外周血、外周血單核細胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織或腫瘤。

在一些實施方案中，細胞群包含外周血單核細胞(PBMC)。

在其它實施方案中，得到或獲得細胞群包括白細胞去除術(shù)。

在具體實施方案中，分離細胞群包括沉降。

在另外的實施方案中，沉降包括FICOLL^TM或PERCOLL^TM梯度。

在某些實施方案中，使用半自動直流離心機進行沉降。

在另外的實施方案中，半自動直流離心機是Cobe 2991細胞處理器、Cell Saver 5+或Teruma Elutra。

在具體實施方案中，所述方法還包括在緩沖液或細胞培養(yǎng)基中洗滌細胞群。

在一些實施方案中，在含有一種或多種細胞因子的T細胞生長培養(yǎng)基(TCGM)中洗滌細胞群。

在一些實施方案中，TCGM中的一種或多種細胞因子選自：IL-2、IL7、IL-15、IL-9和IL-21。

在具體實施方案中，細胞因子是IL-2。

在某些實施方案中，IL-2的濃度為約250IU/mL。

在某些實施方案中，IL-2的濃度為約100IU/mL至約300IU/mL。

在一些實施方案中，所分離的細胞群包含PBMC。

在另外的實施方案中，將細胞群在速率可控的冷凍儀中低溫保藏。

在其它實施方案中，將低溫保藏的細胞群解凍。

在其它實施方案中，以約1x10⁸個細胞/mL的密度將細胞群接種于TCGM中，以在步驟(b)中培養(yǎng)。

在其它實施方案中，以約1x10⁷個細胞/mL的密度將細胞群接種于TCGM中，以在步驟(b)中培養(yǎng)。

在其它實施方案中，以約1x10⁶個細胞/mL的密度將細胞群接種于TCGM中，以在步驟(b)中培養(yǎng)。

在其它實施方案中，以約1x10⁶個細胞/mL的密度將約1x10⁸個細胞接種于TCGM中，以在步驟(b)中培養(yǎng)。

在具體實施方案中，將細胞群在細胞培養(yǎng)袋或生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。

在某些實施方案中，TCGM包含選自以下的一種或多種細胞因子：IL-2、IL7、IL-15、IL-9和IL-21。

在其它實施方案中，一種或多種細胞因子選自IL-2、IL-7和IL-15。

在另外的實施方案中，一種或多種細胞因子包括IL-2。

在另外的實施方案中，一種或多種細胞因子的濃度為約250IU/mL。

在另外的實施方案中，一種或多種細胞因子的濃度為約25IU/mL至約500IU/mL。

在其它實施方案中，用可溶的抗CD3抗體和可溶的抗CD28抗體培養(yǎng)細胞群。

在某些實施方案中，抗CD3抗體的濃度為約50ng/mL。

在具體實施方案中，抗CD28抗體的濃度為約50ng/mL。

在具體實施方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將步驟b)的細胞群培養(yǎng)約12小時至約48小時。

在其它實施方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將步驟b)的細胞群培養(yǎng)約16小時至約32小時。

在另外的實施方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將步驟b)的細胞群培養(yǎng)至少18小時。

在其它實施方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將步驟b)的細胞群培養(yǎng)至少24小時。

在某些實施方案中，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟d)的細胞群。

在某些實施方案中，用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟d)的細胞群。

在其它實施方案中，將約1x10⁹TU至約2x10⁹TU的病毒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)1x10⁸個接種細胞。

在其它實施方案中，將約1x10⁹TU至約4x10⁹TU的病毒載體用于轉(zhuǎn)導(dǎo)1x10⁸個接種細胞。

在具體實施方案中，將病毒載體稀釋至總培養(yǎng)體積的20％v/v。

在具體實施方案中，將病毒載體稀釋至總培養(yǎng)體積的約20％至約40％v/v。

在另外的實施方案中，將細胞群轉(zhuǎn)導(dǎo)約18至約48小時。

在其它實施方案中，將細胞群轉(zhuǎn)導(dǎo)約18至約36小時。

在其它實施方案中，將細胞群轉(zhuǎn)導(dǎo)約24小時。

在另外的實施方案中，病毒載體包含編碼嵌合抗原受體的多核苷酸。

在某些實施方案中，CAR包含胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域：所述胞外結(jié)構(gòu)域與選自以下的抗原結(jié)合：α葉酸受體、5T4、αvβ6整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自以下的多肽：CD8α；CD4、CD28、CD45、PD1和CD152；所述一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD54(ICAM)、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD152(CTLA4)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)和CD278(ICOS)。

在具體實施方案中，胞外結(jié)構(gòu)域包含與抗原結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段。

在其它實施方案中，跨膜結(jié)構(gòu)域源自CD8α或CD28。

在某些實施方案中，一個或多個共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

在其它實施方案中，其包含鉸鏈區(qū)多肽。

在另外的實施方案中，鉸鏈區(qū)多肽包含IgG1或CD8α的鉸鏈區(qū)。

在具體實施方案中，CAR還包含信號肽。

在具體實施方案中，信號肽包括IgG1重鏈信號多肽、CD8α信號多肽或人GM-CSF受體α信號多肽。

在另外的實施方案中，將步驟d)中的細胞群培養(yǎng)擴增約5至約8天。

在某些實施方案中，將步驟d)中的細胞群在細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)擴增約5天至約8天。

在其它實施方案中，將步驟d)中的細胞群在細胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)擴增約5天，然后在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)約3天。

在另外的實施方案中，將步驟d)中的細胞群在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)擴增約5天至約8天。

在其它實施方案中，生物反應(yīng)器是WAVE生物反應(yīng)器或GREX生物反應(yīng)器。

在具體實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少50倍。

在某些實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少100倍。

在具體實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少200倍。

在其它實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少300倍。

在另外的實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少400倍。

在另外的實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少500倍。

在其它實施方案中，在步驟d)的培養(yǎng)期間，T細胞的數(shù)目擴增至少600倍。

在某些實施方案中，所述方法還包括回收所制備的T細胞治療劑。

在某些實施方案中，回收T細胞治療劑包括濃縮并洗滌步驟d)中擴增的細胞。

在具體實施方案中，使用半自動直流離心機(semiautomated flowthrough centrifuge)濃縮并洗滌T細胞治療劑。

在其它實施方案中，半自動直流離心機為Cell Saver 5+或LOVO。

在具體實施方案中，所述方法還包括將T細胞治療劑低溫保藏。

在另外的實施方案中，將低溫保藏的T細胞解凍，以用于過繼性細胞療法的方法。

在不同實施方案中，提供組合物，其包含以上所描述的前述實施方案中任一項以及本文別處所述制備的T細胞以及生理學可接受的賦形劑。

在各種其它實施方案中，提供治療有此需要的對象中的惡性腫瘤的方法，其包括向所述對象施用以上所描述的前述實施方案中任一項以及本文別處所述的T細胞治療劑。

附圖幾個視圖的簡要描述

圖1顯示了在T細胞制備過程期間，在不同時間進行轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和VCN。在D0、D1和D2，用表達GFP的慢病毒以1-2x108TU/106個PBMC對細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。對表達GFP的細胞進行的CD3、CD8或CD4表達的FACS分析確定，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和VCN在活化之后20至24小時(D1)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中最高。

圖2顯示了使用不同的方法活化的細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。使用(i)板結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體；(ii)可溶的抗CD3和抗CD28抗體；以及(iii)珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體來活化PBMC。用表達抗CD19CAR的慢病毒以1-2x108TU/106個PBMC對活化的細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。與其它方法相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和VCN在用可溶的抗CD3和抗CD28抗體活化的表達T細胞標志物CD3、CD8或CD4的表達GFP的細胞中較高。

圖3顯示，在細胞培養(yǎng)袋中的活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)可與在瓶中的轉(zhuǎn)導(dǎo)相比較。在D0，使用濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體對PBMC進行活化。在D1，用表達κLC的慢病毒，以3x108TU/106個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的細胞。當細胞在細胞培養(yǎng)袋或瓶中活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)時，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是可比較的。在細胞培養(yǎng)袋中活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中，VCN略高。

圖4顯示，通過不同方法活化的PBMC中T細胞的擴增是可比較的。使用(i)板結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體；和(ii)可溶的抗CD3和抗CD28抗體，來活化PBMC；或者使用(iii)珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體來活化純化的淋巴細胞。PBMC和淋巴細胞來自相同來源。用表達抗CD19CAR的慢病毒，以1-2x108TU/106個PBMC對活化的細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過三種方法活化的PBMC中的細胞擴增在十天的擴增培養(yǎng)期是可比較的。

圖5顯示，來自多個供體的PBMC顯示可比較的和穩(wěn)健的擴增。使用可溶的抗CD3和抗CD28抗體對PBMC進行活化。用表達抗CD19CAR的慢病毒，以1-2x108TU/106個PBMC對活化的細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。培養(yǎng)10天的來自多個供體的活化且轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在彼此和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照(UTD)之間顯示可比較的生長速率。還顯示了在第10天，存在于各擴增培養(yǎng)物中的淋巴細胞的數(shù)目。

圖6是代表性的FACS分析，其顯示抗CD19CAR的表達在產(chǎn)生自不同患者的細胞產(chǎn)物中是可比較的，平均值為約61％標記的，范圍為29％至80％(n＝5)。qPCR也表明，細胞產(chǎn)物中的VCN在產(chǎn)生自不同患者的細胞產(chǎn)物中是可比較的。

圖7顯示，通過用可溶的抗體活化的T細胞進行的抗原特異性腫瘤清除與使用其它方法活化的T細胞一樣好，或者優(yōu)于使用其它方法活化的T細胞。使用(i)板結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體；(ii)可溶的抗CD3和抗CD28抗體；以及(iii)珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體，對PBMC進行活化。用表達抗CD19CAR的慢病毒，以1-2x108TU/106個PBMC對活化的細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將擴增的抗CD19CAR T細胞與表達CD19的Daudi細胞或不表達CD19的K562細胞共培養(yǎng)。使用可溶的抗體活化的抗CD19CAR T細胞以抗原特異性的方式殺死Daudi細胞，但是不殺死K562細胞，其與通過其它方法活化的抗CD19CAR T細胞一樣好，或者優(yōu)于通過其它方法活化的抗CD19CAR T細胞。

圖8顯示了通過使用本文所考慮的方法制備的CAR T細胞進行的抗原特異性腫瘤清除的代表性實驗。使用可溶的抗CD3和抗CD28抗體對PBMC進行活化，用表達抗CD19CAR的慢病毒，以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC進行轉(zhuǎn)導(dǎo)?？笴D19CAR T細胞殺死表達CD19的Daudi細胞，但是不殺死不表達CD19的K562細胞。

圖9顯示了小規(guī)模研究T細胞制備平臺和按比例增加的臨床cGMP藥物制備平臺的流程圖比較。小規(guī)模方法允許對CART構(gòu)建體進行較高通量的評價，確保數(shù)據(jù)與大規(guī)模cGMP制備平臺將是可比較的。

圖10顯示了利用新鮮的PBMC、細胞培養(yǎng)袋以及任選地WAVE生物反應(yīng)器的T細胞制備平臺的流程圖。

圖11顯示了利用冷凍的PBMC、細胞培養(yǎng)袋以及任選地WAVE生物反應(yīng)器的T細胞制備平臺的流程圖。

圖12顯示了利用新鮮的PBMC和GREX生物反應(yīng)器的T細胞制備平臺的流程圖。

圖13顯示了對來自小規(guī)模和大規(guī)模制備方法的最終制備的CAR T細胞產(chǎn)物的表型進行比較的示例性實驗。對CD4、CD8、CAR T構(gòu)建體、CD56和CD62L細胞表面標志物的表達進行的FACS分析確定平臺之間最終CAR T產(chǎn)物的表型中無任何顯著差異。兩個平臺之間所有表面標志物的p≥0.20(n＝3)。

圖14顯示了來自18名供體的PBMC的細胞組合物，其利用FICOLL^TM分離并且在Cell5+自體血回收系統(tǒng)(Haemonetics)上進行洗滌。通過對CD45⁺細胞、T細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、B細胞、NK細胞以及單核細胞和樹突細胞進行FACS，表征得到的細胞群。細胞特性在18名供體之間是一致的。

圖15顯示利用不同的方法制備的CAR T細胞產(chǎn)生可比較的最終細胞產(chǎn)物。利用小規(guī)模(T25瓶)和大規(guī)模(GREX100、靜態(tài)細胞培養(yǎng)袋和WAVE生物反應(yīng)器)設(shè)備制備CAR T細胞。10天培養(yǎng)期內(nèi)的細胞生長速率和擴增的細胞數(shù)在方法之間是可比較的。(A).FACS分析顯示CD3⁺細胞的數(shù)量在制備方法之間是一致的。(B).qPCR顯示CD3⁺細胞的VCN在所測試的各種制備方法之間是可比較的。

圖16顯示了多種慢病毒CAR構(gòu)建體的卡通圖。構(gòu)建體在啟動子、scFV、+/-接頭、鉸鏈、跨膜區(qū)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域方面不同。

圖17顯示，不同的CAR T細胞產(chǎn)物顯示(A)可比較的生長速率；(B)VCN；以及(C)不同CAR構(gòu)建體的細胞表面表達。

圖18顯示了使用表達CAR的T細胞的抗原特異性腫瘤清除。(A).表達抗BCMA的CAR T細胞殺死用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記的表達BCMA的腫瘤細胞；通過FACS測量熒光。(B).將表達抗BCMA的CAR T細胞與K562細胞和被遺傳修飾以表達BCMA的K562細胞共培養(yǎng)，以及在24小時后收集上清液，并經(jīng)ELISA分析IFN-γ的釋放(n＝3)。

詳細描述

A.概述

既有的用于制備過繼性細胞療法的方法繁瑣且昂貴，并且對在臨床上使用ACT作為廣泛的治療呈現(xiàn)巨大障礙。所述組合物和方法為涉及制備基于細胞的治療劑的這些和其它問題提供了解決方案。本發(fā)明大體上涉及用于制備T細胞治療劑的改善方法。不希望束縛于任何具體理論，與本領(lǐng)域中既有的T細胞組合物相比，本文所考慮的發(fā)明方法產(chǎn)生可復(fù)制、可靠且穩(wěn)健的ACT制備平臺。

在不同實施方案中，提供用于制備過繼性細胞療法的方法、免疫效應(yīng)細胞組合物或治療劑的方法，用于擴增免疫效應(yīng)細胞的方法，以及免疫效應(yīng)細胞制備平臺。在具體的優(yōu)選實施方案中，通過本文所考慮的方法制備工程化的TCR或CAR免疫效應(yīng)細胞組合物，其還可以增加免疫效應(yīng)細胞過繼性細胞療法的效力。本文所考慮的制備的細胞組合物在眾多病況的治療或預(yù)防中有益，所述病況包括但不限于癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病和免疫缺陷。

在不同實施方案中，用于制備包含免疫效應(yīng)細胞的治療性組合物的方法包括：獲得包含免疫效應(yīng)細胞的細胞群，活化所述細胞群，以及培養(yǎng)所述細胞群以擴增免疫效應(yīng)細胞。在具體實施方案中，免疫效應(yīng)細胞包含T細胞，以及任選地包含NK細胞和/或NKT細胞。

在不同實施方案中，在細胞培養(yǎng)袋和/或生物反應(yīng)器中制備免疫效應(yīng)細胞。

在其它不同的實施方案中，在生物反應(yīng)器中制備免疫效應(yīng)細胞。

在一個實施方案中，用于制備包含T細胞的治療性組合物的方法包括從對象中得到細胞，并且使用封閉的系統(tǒng)方法分離細胞群。在具體實施方案中，可以從任何合適的新鮮或冷凍來源分離細胞。在某些實施方案中，分離的細胞群包含外周血單核細胞(PBMC)。接種分離的細胞群以起始培養(yǎng)，以及通過使細胞與初級配體(primary ligand)和共刺激配體接觸，活化并刺激T細胞。在具體實施方案中，用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的細胞群，以便將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞重定向至特定的靶抗原。在某些實施方案中，用編碼CAR或工程化的TCR的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。然后可以將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞或非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)以擴增免疫效應(yīng)細胞，例如T細胞。然后可以將制備的免疫效應(yīng)細胞組合物用來治療有此需要的對象或者冷凍備用。

使用本文所考慮的方法制備的過繼性細胞療法在產(chǎn)生具有可復(fù)制水平的擴增、細胞特性、VCN的細胞藥物產(chǎn)品方面是有效的，并且所述藥物產(chǎn)品在介導(dǎo)抗原特異性腫瘤清除方面是有效的。所述方法在產(chǎn)生過繼性細胞療法中提供降低的患者間的可變性，并且是可復(fù)制、可靠、可擴展且可轉(zhuǎn)移的cGMP制備方法。因此，與既有的過繼性細胞免疫療法相比，本文所考慮的方法和組合物顯示重大改善。

除非明確指明相反，否則本發(fā)明的實踐將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術(shù)、遺傳學、免疫學和細胞生物學方法，出于示例的目的，下文描述其中的一些。此類技術(shù)在文獻中被充分解釋。參見，例如，Sambrook等人，《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版,2001)；Sambrook等人，《分子克隆：實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；Maniatis等人，《分子克?。簩嶒炇沂謨浴?Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons,2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊專著如Advances in Immunology。

在此，將本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用整體并入。

B.定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中可以使用與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了組合物、方法和材料的優(yōu)選實施方案。出于本發(fā)明的目的，在下文定義了以下術(shù)語。

冠詞“一個/一種(a)”、“一個/一種(an)”和“所述(the)”在本文用來指“一個/一種(one)”或者指“多個/多種(more than one)”(即，指“至少一個/至少一種(at least one)”)的所述冠詞的語法上對象。舉例來說，“元素(an element)”意指一種元素或多種元素。

本文使用的術(shù)語“約”或“大約”指針對參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度變化多達30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。在具體實施方案中，當在數(shù)值之前時，術(shù)語“約”或“大約”表示加或減15％、10％、5％或1％范圍的值。

本文使用的術(shù)語“基本上”指為參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度的80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。在一個實施方案中，“基本上相同”指產(chǎn)生與參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度大約相同的效果(例如，生理效應(yīng))的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺寸、大小、數(shù)量、重量或長度。

在整個說明書中，除非上下文另有要求，單詞“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”將被理解為暗示包括指定的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的組。“由...組成”意指包括且限于短語“由...組成”之后的任何內(nèi)容。因此，短語“由...組成”表示列出的元素是必需或強制的，并且不可以存在其它元素?！盎旧嫌?..組成”意指包括短語之后列出的任何元素，且限于不干擾或者不促進本公開詳細說明的所列元素的活性或作用的其它元素。因此，短語“基本上由...組成”表示所列元素是必需的或強制的，但是其它元素不是任選的，且可以存在或不可以存在，這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。

在整個說明書中提及的“一個實施方案”、“實施方案”、“具體實施方案”、“相關(guān)實施方案”、“某些實施方案”、“另外的實施方案”或“其它實施方案”或者以上的組合意指，與實施方案相關(guān)的所描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或特性被包括在本發(fā)明的至少一個實施方案中。因此，前述短語在整個說明書的不同地方的出現(xiàn)不一定全部指相同的實施方案。而且，可以在一個或多個實施方案中，以任意合適的方式將具體的特征、結(jié)構(gòu)或特性組合。

本文使用的術(shù)語“T細胞制備”或“制備T細胞的方法”或者相當?shù)男g(shù)語指產(chǎn)生T細胞的治療性組合物的方法，所述制備方法可以包括對包含T細胞的細胞群或純化的T細胞群進行一次或多次下述步驟中的一種或多種或者全部：得到、分離、洗滌、刺激、活化、修飾、擴增、低溫保藏以及解凍，或者以上的任何合適組合。

術(shù)語“T細胞”或“T淋巴細胞”是本領(lǐng)域公認的，且旨在包括胸腺細胞、初始T淋巴細胞、不成熟的T淋巴細胞、成熟的T淋巴細胞、靜息T淋巴細胞或活化的T淋巴細胞。適合用于具體實施方案中的示例性T細胞群包括但不限于輔助性T細胞(HTL；CD4⁺T細胞)、細胞毒性T細胞(CTL；CD8⁺T細胞)、CD4⁺CD8⁺T細胞、CD4^-CD8^-T細胞或者T細胞的任何其它亞群。適合用于具體實施方案中的其它示例性T細胞群包括但不限于表達下述標志物中的一種或多種的T細胞：CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD197和HLA-DR，并且若需要，可以通過陽性或陰性選擇技術(shù)進一步分離。

外周血單核細胞(PBMC)被定義為具有圓形核的任何血細胞(即，淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞)。這些血細胞是免疫系統(tǒng)抵抗感染并適應(yīng)入侵者的關(guān)鍵組分。淋巴細胞群由CD4+和CD8+T細胞、B細胞和自然殺傷細胞、CD14+單核細胞和嗜堿性粒細胞/嗜中性粒細胞/嗜酸性粒細胞/樹突細胞組成。通常，使用FICOLL^TM(使血液分層的親水多糖)，從全血或從leukopack分離這些細胞，其中單核細胞和淋巴細胞在血漿層下形成血沉棕黃層。在一個實施方案中，“PBMC”指至少包含T細胞，以及任選地包含NK細胞和抗原遞呈細胞的細胞群。

“抗原遞呈細胞”指通過加工抗原并將抗原遞呈至T細胞來介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的異質(zhì)免疫活性細胞群?？乖f呈細胞包括但不限于：巨噬細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞、B淋巴細胞、血小板和人工抗原遞呈細胞(aAPC)。

可以通過工程化設(shè)計K562、U937、721.221、T2和C1R細胞，以指導(dǎo)各種共刺激分子和細胞因子的穩(wěn)定表達和分泌來制備aAPC。在具體實施方案中，K32或U32aAPC用于指導(dǎo)一種或多種基于抗體的刺激分子在AAPC細胞表面上的展示。可以通過表達各種共刺激分子的aAPC擴增T細胞群，所述共刺激分子包括但不限于，CD137L(4-1BBL)、CD134L(OX40L)和/或CD80或CD86。最后，aAPC提供了擴增遺傳修飾的T細胞并維持CD28在CD8T細胞上的表達的高效平臺。在此將在WO 03/057171和US2003/0147869中提供的aAPC通過引用整體并入。

本文使用的術(shù)語“增殖”指細胞分裂(細胞的對稱或不對稱分裂)的增加。在具體實施方案中，“增殖”指T細胞的對稱或不對稱分裂。當與未處理的樣本中的細胞相比，處理的樣本中的細胞數(shù)存在增加時，發(fā)生“增殖增加”。

“免疫效應(yīng)細胞”是具有一種或多種效應(yīng)功能(例如，細胞毒性細胞殺傷活性、細胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的誘導(dǎo))的免疫系統(tǒng)的任何細胞。本文所考慮的示例性的免疫效應(yīng)細胞是T淋巴細胞，特別是細胞毒性T細胞(CTL；CD8⁺T細胞)和輔助性T細胞(HTL；CD4⁺T細胞)。如技術(shù)人員所理解的，其它細胞也可以用作具有如本文所描述的CAR的免疫效應(yīng)細胞。具體而言，免疫效應(yīng)細胞還包括NK細胞、NKT細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞。在具體實施方案中，使用本文所考慮的制備方法，對T細胞以及一種或多種其它細胞類型(如NK細胞、NKT細胞、嗜中性粒細胞和/或巨噬細胞)進行遺傳修飾和擴增。

“修飾的T細胞”指通過引入編碼本文所考慮的工程化的TCR或CAR的多核苷酸而被修飾的T細胞。修飾的T細胞既包含遺傳修飾又包含非遺傳修飾(例如，游離的或染色體外的)。

本文使用的術(shù)語“遺傳工程化的”或“遺傳修飾的”指將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)添加至細胞的總遺傳物質(zhì)中。

術(shù)語“遺傳修飾的細胞”、“修飾的細胞”和“重定向的細胞”可互換使用。

本文使用的術(shù)語“基因療法”指為恢復(fù)、校正或改變基因的表達，或者出于表達治療多肽例如，TCR或CAR和/或一種或多種細胞因子的目的，將DNA或RNA形式的額外的遺傳物質(zhì)引入細胞的總遺傳物質(zhì)中。在具體實施方案中，例如，通過將表達TCR或CAR的附加型載體引入細胞，對T細胞進行修飾以表達工程化的TCR或CAR，而不改變細胞的基因組。

術(shù)語“離體”通常指在有機體外發(fā)生的活動，如在有機體外的人工環(huán)境(優(yōu)選對自然條件進行最小改變)中的活組織內(nèi)或活組織上進行實驗或測量。在具體實施方案中，“離體”程序涉及取自有機體且在實驗室裝置中培養(yǎng)或調(diào)節(jié)的活細胞或組織，所述培養(yǎng)或調(diào)整通常在無菌條件下進行，并且通常持續(xù)幾小時或多至約24小時，但是包括多至48小時或72小時，這取決于環(huán)境。在某些實施方案中，可以將此類組織或細胞收集并冷凍，以及隨后解凍用于離體處理。利用活細胞或組織，持續(xù)時間長于幾天的組織培養(yǎng)實驗或程序通常被認為是“在體外”，但是在某些實施方案中，該術(shù)語與離體可互換使用。

術(shù)語“在體內(nèi)”通常指發(fā)生在有機體內(nèi)的活動，如細胞的自我更新和擴增。在一個實施方案中，術(shù)語“體內(nèi)擴增”指細胞群在體內(nèi)數(shù)量增加的能力。

術(shù)語“刺激”指通過刺激分子(例如，TCR/CD3復(fù)合物)與其同源配體結(jié)合從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(包括但不限于經(jīng)TCR/CD3復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo))而誘導(dǎo)的初始應(yīng)答。

“刺激分子”指與同源刺激配體特異性結(jié)合的T細胞上的分子。

本文使用的“刺激配體”意指這樣的配體，當其存在于抗原遞呈細胞(例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等)上時，可以與T細胞上的同源結(jié)合伴侶(在本文被稱為“刺激分子”)特異性結(jié)合，從而通過T細胞介導(dǎo)初始應(yīng)答，包括但不限于，活化、起始免疫應(yīng)答、增殖等。刺激配體包括但不限于CD3配體或結(jié)合劑(例如，抗CD3抗體)以及CD2配體或結(jié)合劑(例如，抗CD2抗體)。

術(shù)語“活化”指被充分刺激以誘導(dǎo)可檢測的細胞增殖的T細胞的狀態(tài)。在具體實施方案中，活化還可以與誘導(dǎo)的細胞因子的產(chǎn)生和可檢測的效應(yīng)功能相關(guān)。術(shù)語“活化的T細胞”指(除了其它方面)正在增殖的T細胞。通過單獨的TCR產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細胞，還需要一種或多種次級信號或共刺激信號。因此，T細胞的活化包含通過TCR/CD3復(fù)合物的初級刺激信號以及一種或多種次級共刺激信號。由T細胞的增殖和/或細胞因子的產(chǎn)生可以證實共刺激，所述T細胞已接受初級活化信號，如通過CD3/TCR復(fù)合物或通過CD2的刺激。

“共刺激信號”指這樣的信號，其與初級信號(如TCR/CD3結(jié)合)的組合導(dǎo)致T細胞增殖、細胞因子產(chǎn)生和/或特定分子上調(diào)或下調(diào)。

“共刺激配體”指與共刺激分子結(jié)合的分子。共刺激配體可以是可溶解的或者提供于表面上。共刺激配體可以包括但不限于：CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導(dǎo)的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、與Toll配體受體結(jié)合的激動劑或抗體以及與B7-H3特異性結(jié)合的配體。共刺激配體還包含特別是與T細胞上存在的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段以及與CD83特異性結(jié)合的配體，所述共刺激分子如但不限于，CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

“共刺激分子”指與共刺激配體特異性結(jié)合，從而通過T細胞介導(dǎo)共刺激應(yīng)答(包括但不限于增殖)的T細胞上的同源結(jié)合伴侶，例如，CD28。

本文使用的“自體同源(Autologous)”指來自同一對象的細胞。

本文使用的“同種異體(Allogeneic)”指與相比較的細胞在遺傳學上不同的相同物種的細胞。

本文使用的“同基因(Syngeneic)”指與相比較的細胞在遺傳學上相同的不同對象的細胞。

本文使用的“異基因(Xenogeneic)”指與相比較的細胞不同物種的細胞。

本文使用的術(shù)語“個體”和“對象”通常可互換使用，并且指顯現(xiàn)出可用基因療法載體、基于細胞的治療劑以及本文別處所公開的方法進行治療的癌癥、感染性疾病、免疫缺陷、炎癥性疾病或者自身免疫病癥的癥狀的任何動物。合適的對象(例如，患者)包括實驗室動物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場動物和家養(yǎng)動物或?qū)櫸?如貓或狗)。包括非人靈長類以及優(yōu)選包括人。典型的對象包括患有癌癥、感染性疾病、免疫缺陷、炎癥性疾病或自身免疫病癥的人，已被診斷患有癌癥、感染性疾病、免疫缺陷、炎癥性疾病或自身免疫病癥的人，或者處于患癌癥、感染性疾病、免疫缺陷、炎癥性疾病或自身免疫病癥風險的人。

本文使用的術(shù)語“患者”指已被診斷具有特定跡象的對象，所述特定跡象可以用基因療法載體、基于細胞的治療劑以及本文別處所公開的方法進行治療。

本文使用的“治療(treatment)”或“治療(treating)”包括對疾病或病理狀態(tài)的癥狀或病狀的任何有益或期望的效果，并且甚至可以包括被治療的疾病或病況(例如，癌癥)的一種或多種可測量標志物的最小減少。治療可以任選地包括疾病或病況的一種或多種癥狀的改善或徹底減輕，或者疾病或病況的進展延遲。“治療”不一定指示疾病或病況或者其相關(guān)癥狀的完全根除或治愈。

本文使用的“預(yù)防(prevent)”和類似的單詞如“預(yù)防(prevented)”、“預(yù)防(preventing)”等指用于預(yù)防、抑制或降低疾病或病況(例如，癌癥)發(fā)生或復(fù)發(fā)的可能性的方法。其還指延遲疾病或病況的發(fā)作或復(fù)發(fā)，或者延遲疾病或病況的癥狀的發(fā)生或復(fù)發(fā)。本文使用的“預(yù)防(prevention)”和類似的單詞還包括在疾病或病況發(fā)作或復(fù)發(fā)之前降低疾病或病況的強度、影響、癥狀和/或負擔。

本文使用的術(shù)語“數(shù)量”指遺傳修飾的治療細胞(例如，T細胞)實現(xiàn)有益或期望的預(yù)防或治療結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的“有效量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。

“預(yù)防有效量”指遺傳修飾的治療細胞有效實現(xiàn)期望的預(yù)防結(jié)果的量。通常但不必須，由于預(yù)防劑量是在疾病之前或在疾病的早期階段用于對象，所以預(yù)防有效量小于治療有效量。

遺傳修飾的治療細胞的“治療有效量”可以根據(jù)諸如以下的因素而改變：個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及T細胞在個體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力。治療有效量也是這樣的量：其中病毒或者所轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療細胞的任何毒性或有害影響被治療有益效果超過。術(shù)語“治療有效量”包括有效“治療”對象(例如，患者)的量。當指示治療量時，待施用的本發(fā)明的組合物的精確量可以由醫(yī)師考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉(zhuǎn)移的程度以及病況方面的個體差異來確定。

本文使用的術(shù)語“癌癥”通常涉及異常細胞不受控制地分裂并且可侵入鄰近的組織的一類疾病或病況。

本文使用的術(shù)語“惡性的”指這樣的癌癥，其中腫瘤細胞組呈現(xiàn)不受控制的生長(即，分裂超出正常限制)、侵襲(即，侵入并破壞相鄰的組織)和轉(zhuǎn)移(即，經(jīng)淋巴或血液擴散至身體的其它位置)中一種或多種。本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指癌癥從身體的一部分擴散至另外的部分。由擴散的細胞形成的腫瘤叫做“轉(zhuǎn)移性腫瘤”或“轉(zhuǎn)移”。轉(zhuǎn)移性腫瘤含有與原始(原發(fā))腫瘤中的細胞相同的細胞。

本文使用的術(shù)語“良性”或“非惡性的”指可以長大但不擴散至身體的其它部分的腫瘤。良性腫瘤自我限制并且通常不會侵襲或轉(zhuǎn)移。

“癌癥細胞”或“腫瘤細胞”指癌性生長物或組織的個體細胞。腫瘤通常指由細胞的異常生長形成的腫脹或損傷，其可以是良性的、惡變前的或惡性的。大多數(shù)癌癥形成腫瘤，但是一些癌癥(例如，白血病)不一定形成腫瘤。對于形成腫瘤的那些癌癥，術(shù)語癌癥(癌細胞)和腫瘤(腫瘤細胞)可互換使用。個體的腫瘤的量是“腫瘤負擔”，其可以測量為腫瘤數(shù)、腫瘤體積或腫瘤重量。

“感染性疾病”指可以在人之間或在有機體之間傳播，且由微生物物質(zhì)(microbial agent)引起的疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如肝炎、性傳播疾病(例如，衣原體、淋病)、肺結(jié)核、HIV/AIDS、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍亂和流行性感冒。

“自身免疫病”指身體對其自身組織的某些組分產(chǎn)生免疫原性(即，免疫系統(tǒng))應(yīng)答的疾病。換句話說，免疫系統(tǒng)喪失了其將身體內(nèi)的某些組織或系統(tǒng)識別為“自身”的能力，并且靶向和攻擊所述組織或系統(tǒng)，仿佛它們是外來的。自身免疫病可被分類為其中主要是一種器官受影響的自身免疫病(例如，溶血性貧血和自身免疫性甲狀腺炎(anti-immune thyroiditis))，以及其中自身免疫病的過程通過許多組織擴散的自身免疫病(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡)。例如，多發(fā)性硬化癥被認為是由T細胞攻擊圍繞腦和脊髓神經(jīng)纖維的鞘所引起的。這導(dǎo)致協(xié)調(diào)性喪失、虛弱以及視力模糊。自身免疫病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如橋本氏甲狀腺炎、格雷夫斯氏病(Grave's disease)、狼瘡、多發(fā)性硬化、風濕性關(guān)節(jié)炎、溶血性貧血、自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉、克羅恩氏病(Crohn's disease)、結(jié)腸炎、糖尿病、硬皮病、銀屑病等。

“免疫缺陷”意指免疫系統(tǒng)被疾病或化學物質(zhì)的施用損傷的患者的狀態(tài)。該病況使系統(tǒng)缺乏防御抵抗外來物質(zhì)所需的血細胞的數(shù)目和類型。免疫缺陷病況或疾病在本領(lǐng)域是已知的，并且包括，例如AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)、SCID(重癥聯(lián)合免疫缺陷病)、選擇性IgA缺乏癥、常見變異型免疫缺陷病、X連鎖無丙種球蛋白血癥、慢性肉芽腫病、高IgM綜合征以及糖尿病。

本文使用的術(shù)語“炎癥性疾病”指急性或慢性炎癥性病況，其可以由感染性或非感染性原因引起。各種感染性原因包括腦膜炎、腦炎、葡萄膜炎、結(jié)腸炎、肺結(jié)核、皮炎以及成人呼吸窘迫綜合征。非感染性原因包括創(chuàng)傷(燒傷、割傷、挫傷、擠壓傷)、自身免疫病以及器官排斥發(fā)作(organ rejection episode)。

“增強”或“促進”或者“增加”或“擴大”通常指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物產(chǎn)生、引發(fā)或引起較強的生理學應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力。除了從本領(lǐng)域的理解和本文的描述顯而易見的之外，可測量的生理學應(yīng)答可以包括T細胞的擴增、活化、增殖的增加，和/或癌細胞死亡殺傷能力的增加。“增加的”量或“增強的”量通常是“統(tǒng)計學顯著的”量，并且可以包括由媒介物或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的應(yīng)答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括在其間且在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)點，例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。

“下將(decrease)”或“降低(lower)”、或者“變少(lessen)”、或者“減少(reduce)”、或者“減輕(abate)”通常指與由媒介物或?qū)φ辗肿?組合物引起的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物產(chǎn)生、引發(fā)或引起較小生理學應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力?！皽p小”或“減少的”量通常是“統(tǒng)計學顯著的”量，并且可以包括由媒介物、對照組合物產(chǎn)生的應(yīng)答(參照應(yīng)答)，或者特定細胞譜系中的應(yīng)答的1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍(例如500倍，1000倍)(包括在其間且在1以上的所有整數(shù)和小數(shù)點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的減少。

“維持(maintain)”、或“保持(preserve)”、或“維持(maintenance)”或“無變化(no change)”、或“無明顯變化(no substantial change)”、或“無明顯減少(no substantial decrease)”通常指與由媒介物、對照分子/組合物引起的應(yīng)答，或者特定細胞譜系中的應(yīng)答相比，本文所考慮的組合物在細胞中產(chǎn)生、引發(fā)或引起較小生理學應(yīng)答(即，下游效應(yīng))的能力?？杀容^的應(yīng)答是與參照應(yīng)答沒有顯著不同或者可測量的不同的應(yīng)答。

本文使用的術(shù)語“特異性結(jié)合親和力(specific binding affinity)”或“特異性結(jié)合(specifically binds)”或“特異性結(jié)合(specifically bound)”或“特異性結(jié)合(specific binding)”或“特異性靶向(specifically targets)”描述了一種分子以高于背景結(jié)合的結(jié)合親和力與另一種分子結(jié)合。如果結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或者包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR或含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)與靶分子的結(jié)合或聯(lián)合具有例如大于或等于約10⁵M^-1的親和力或K_a(即，具體的結(jié)合相互作用的平衡締合常數(shù)，單位為1/M)，則所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶分子“特異性結(jié)合”。在某些實施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)與靶標的結(jié)合具有大于或等于約10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1的K_a?！案哂H和力”結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其單鏈融合蛋白)指K_a為至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少10¹³M^-1或更高的那些結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

可選地，親和力可以被定義為具體結(jié)合相互作用的平衡解離常數(shù)(K_d)，單位為M(例如，10^-5M至10^-13M或更低)。使用常規(guī)的技術(shù)，可以容易地測定本公開所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽和CAR蛋白的親和力，例如，通過競爭性ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)，或通過結(jié)合締合，或利用標記的配體的位移分析(displacement assay)，或者使用表面等離子共振裝置(如Biacore T100，其可獲自Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)或光學生物傳感器技術(shù)(如分別可獲自Corning和Perkin Elmer的EPIC系統(tǒng)或EnSpire)(還參見，例如，Scatchard et al.(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美國專利第5,283,173號、第5,468,614號或同等物)。

在一個實施方案中，特異性結(jié)合的親和力高于背景結(jié)合約2倍、高于背景結(jié)合約5倍、高于背景結(jié)合約10倍、高于背景結(jié)合約20倍、高于背景結(jié)合約50倍、高于背景結(jié)合約100倍或者高于背景結(jié)合約1000倍或者更多倍。

“抗原(Ag)”指可以刺激動物中抗體或T細胞應(yīng)答的產(chǎn)生的化合物、組合物或物質(zhì)，包括被注射進或吸收進動物的組合物(如包含腫瘤特異性蛋白的組合物)?？乖c特異性體液免疫或細胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，所述產(chǎn)物包括由異源抗原(如本公開的抗原)所誘導(dǎo)的產(chǎn)物?！鞍锌乖被颉澳康陌锌乖笔潜辉O(shè)計以結(jié)合本文所考慮的CAR或工程化的TCR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原。

“表位”或“抗原決定簇”指結(jié)合劑結(jié)合的抗原區(qū)域。

本文使用的“分離的肽”或“分離的多肽”等指重組肽或合成肽或者多肽分子或者天然存在的肽或多肽的體外分離物、合成物和/或純化物，其來自細胞環(huán)境以及來自與細胞的其它組分的結(jié)合物，即其不與體內(nèi)物質(zhì)明顯結(jié)合。

本文使用的“分離的多核苷酸”指重組、合成或非天然存在的多核苷酸的體外分離物、合成物和/或純化物，例如分離的互補DNA(cDNA)或者在自然中不存在且通過人為處理制備的其它多核苷酸。在具體實施方案中，分離的多核苷酸指已從天然狀態(tài)下位于其側(cè)翼的序列純化出來的重組的、合成的或非天然存在的多核苷酸，例如，已從通常與其相鄰的序列移出的DNA片段。

優(yōu)選地，使用本文所考慮的方法制備的細胞治療劑無內(nèi)毒素，并且根據(jù)cGMP實踐進行制備。本文使用的術(shù)語“無內(nèi)毒素”指含有至多痕量(即，對對象無不良的生理學影響的量)內(nèi)毒素，以及優(yōu)選不可檢測的量的內(nèi)毒素的容器和/或組合物。在一個實施方案中，術(shù)語“無內(nèi)毒素”指至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％無內(nèi)毒素的組合物。內(nèi)毒素是與某些細菌(通常是革蘭氏陰性菌)相關(guān)的毒素，盡管內(nèi)毒素可見于革蘭氏陽性菌中，如單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。最普遍的內(nèi)毒素是存在于各種革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，并且其代表了這些細菌引起疾病的能力的重要致病特征。除了其它不良的生理學影響，人體中少量的內(nèi)毒素可以產(chǎn)生發(fā)熱、血壓降低以及炎癥和凝血的激活。因此，從藥品容器中移除大部分或所有痕量內(nèi)毒素通常是可取的，因為即使很少的量也可能在人體中引起不良反應(yīng)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將內(nèi)毒素從容器中移除，例如，可以將容器在HEPA過濾的洗滌裝置中用無內(nèi)毒素的水清潔，于250℃去熱原，并且在位于100/10級潔凈室(例如，100級潔凈室，其在一立方英尺的空氣中含有不超過100個大于半微米的顆粒)內(nèi)的HEPA過濾工作站中進行清潔包裝。

本文使用的術(shù)語“現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)”指食品、藥品和醫(yī)學裝置的制備和質(zhì)量控制測試的控制以及管理。cGMP不一定依賴于取樣，而是依賴于藥物和醫(yī)學裝置制備所涉及的過程、活動和操作的每一方面的記錄。如果顯示產(chǎn)品如何制備和測試的記錄(其使得可追溯，以及在未來問題事件中從市場召回成為可能)不正確且沒有按順序，則產(chǎn)品不滿足所需的規(guī)格且被認為受污染(即，在US為摻入次級品)。此外，cGMP通常要求，所有的制備和檢測裝備均合格適用，以及根據(jù)預(yù)定的規(guī)范驗證藥物制備過程中利用的所有操作方法學和程序(例如，制備、清潔、以及分析測試)以證明它們可以進實施其所聲稱的功能。在US，短語“現(xiàn)行良好生產(chǎn)規(guī)范”出現(xiàn)于1938食品、藥品和化妝品法案(21U.S.C.§351)的501(B)。

C.T細胞制備方法

目前，既有的T細胞制備方法包括用于分離、活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增CAR T細胞的各種復(fù)雜步驟。相比之下，本發(fā)明的發(fā)明人使用小規(guī)模的研究模型來開發(fā)簡單、穩(wěn)健、表征良好、靈活、封閉系統(tǒng)的T細胞制備平臺，可以將其轉(zhuǎn)移至大規(guī)模的臨床cGMP制備過程用于工程化的CAR T細胞。

在不同實施方案中，使用封閉式處理系統(tǒng)，或者與封閉式細胞處理系統(tǒng)組合來制備細胞。封閉式細胞處理系統(tǒng)使在“封閉的”或可重封的容器內(nèi)的過程自動化，所述過程包括處理、離心、孵育、培養(yǎng)基添加、細胞選擇、細胞洗滌以及最終填裝和表面處理(finish)。封閉式細胞處理系統(tǒng)使所述過程一體化和自動化，并且重復(fù)許多定性控制的手動任務(wù)以提供一致且獨立于操作員的特質(zhì)。

與自動化的封閉式細胞處理系統(tǒng)相關(guān)的益處包括療法費用(通常為25-90％)以及需要的操作員人數(shù)(通常>70％)的顯著減少；對熟練勞動者的依賴性降低；通過更好的設(shè)施使用導(dǎo)致資金投入的明顯節(jié)約(通常為30-50％)；質(zhì)量提高和較少的質(zhì)量事件；以及更迅速地縱向擴展和橫向擴展以匹配市場需求的能力。

在不同實施方案中，用于制備治療性T細胞組合物的方法包括使用封閉系統(tǒng)方法獲得包含免疫效應(yīng)細胞和抗原遞呈細胞的細胞群。在某些實施方案中，將分離的細胞群以特定的密度進行接種以起始培養(yǎng)，以及通過使T細胞與初級配體和共刺激配體接觸來活化并刺激T細胞。在具體實施方案中，用編碼CAR或工程化的TCR的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的細胞群，并且培養(yǎng)以擴增所述T細胞。然后，可以將所制備的包含治療性T細胞的免疫效應(yīng)細胞組合物用于治療有此需要的對象或者冷凍備用。

1.T細胞的來源

在具體實施方案中，可以從許多來源獲得T細胞，其包括但不限于：外周血、外周血單核細胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在一個實施方案中，T細胞還可以獲自培養(yǎng)的T細胞系，例如Jurkat、SupT1等。在具體實施方案中，將包含T細胞的細胞群(例如，PBMC)用于本文所考慮的制備方法中。在其它實施方案中，將分離或純化的T細胞群用于本文所考慮的制備方法中。

在一個實施方案中，T細胞的來源還可以商購獲得，例如，Sanguine Biosciences。

2.獲得細胞

本發(fā)明考慮改善的T細胞組合物的制備。細胞可以是自體同源的/自體的(“自己的”)或非自體同源的(“非自己的”，例如同種異體的、同基因的或異基因的)。在一個實施方案中，細胞獲自哺乳類對象。在另一實施方案中，細胞獲自靈長類對象。在具體實施方案中，細胞獲自人類對象。

在不同實施方案中，包含T細胞的細胞群獲自個體，并且經(jīng)歷本文所考慮的制備方法。在一個實施方案中，通過血漿分離置換法(apheresis)，例如白細胞去除術(shù)(leukapheresis)，獲得來自個體循環(huán)血液的細胞。血漿分離置換產(chǎn)物可以含有淋巴細胞，所述淋巴細胞包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其它有核的白細胞、紅細胞和血小板，或者可以是包含淋巴細胞的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物，所述淋巴細胞包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞和其它有核的白細胞。在一個實施方案中，可以洗滌通過血漿分離置換法收集的細胞以移除血漿部分并將所述細胞置于合適的緩沖液或培養(yǎng)基中用于后續(xù)處理?？梢杂肞BS或者缺乏鈣、鎂以及大多數(shù)(即使不是全部)其它二價陽離子的另外合適的溶液來洗滌細胞。

一旦獲得包含T細胞的細胞群，可以測定細胞群內(nèi)的細胞數(shù)和細胞活力，可以將所述細胞群或其一部分低溫保藏，用于將來使用或分析，并且可以使用大量細胞標志物組(例如，CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19、CD28、CD45RA、CD45RO、CD61、CD62L、CD66b、CD127和HLA-DR)來表征群中的細胞，例如，PBMC。

在具體實施方案中，用于本文所考慮的制備方法中的血漿分離置換的細胞的體積為約50mL至約500mL、約50mL至約250mL、約50mL至約200mL、約100mL至約500mL、約100mL至約250mL或約100mL至約200mL，或者其間任何范圍。

在某些實施方案中，用于本文所考慮的制備方法中的血漿分離置換的細胞的體積為約25mL、約50mL、約75mL、約100mL、約125mL、約150mL、約175mL、約200mL、約225mL、約250mL、約275mL、約300mL、約325mL、約350mL、約375mL、約400mL、約425mL、約450mL、約475mL或約500mL，或者其間任何體積。

3.PBMC分離

在具體實施方案中，將PBMC群用于本文所考慮的T細胞制備方法中。在某些實施方案中，可以使用技術(shù)人員已知的任何數(shù)目的技術(shù)，如離心和沉降(例如FICOLL^TM分離、PERCOLL^TM分離)等，從收集自對象的血液或血漿分離置換部分單元獲得包含T細胞的PBMC。

在某些實施方案中，使用半自動直流離心機，例如Cobe 2991細胞處理器、Cell Saver 5等，在FICOLL^TM或PERCOLL^TM梯度中分離通過血漿分離置換法收集的PBMC。在一些實施方案中，使用逆流離心淘析裝置(例如，Terumo BCT等)，在不使用FICOLL^TM或PERCOLL^TM梯度的情況下，分離通過血漿分離置換法收集的PBMC。Cell Saver 5的使用允許PBMC原材料經(jīng)Ficoll進行的封閉系統(tǒng)處理以及最終濃縮和洗滌制備的T細胞組合物在一個裝置上進行。封閉系統(tǒng)的使用通過使cGMP加工所需的裝備最少化而簡化了制備，并且產(chǎn)生一致且可再生產(chǎn)的純的PBMC或最終的T細胞組合物。

在一個實施方案中，將PBMC使用逆流離心淘析裝置分離，并且在Cell Saver 5+或LOVO中洗滌。

在一些實施方案中，在PBMC分離之后，在活化、擴增和/或遺傳修飾之前或之后，可以使用封閉系統(tǒng)裝置和cGMP試劑(例如，CliniMACS)，將細胞毒性T淋巴細胞和輔助性T淋巴細胞分選為初始T細胞亞群、記憶T細胞亞群以及效應(yīng)T細胞亞群。

在分離之后，可以測定PBMC的細胞數(shù)和活力，可以將PBMC或其一部分低溫保藏，用于將來使用或分析，以及可以使用大量細胞標志物組(例如，CD3、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD45RA、CD45RO、CD61和CD66b)來表征PBMC。

在具體實施方案中，在分離PBMC之后，使其經(jīng)歷一個或多個洗滌步驟，例如，以移除Ficoll。在某些實施方案中，可在任何數(shù)量的本文所考慮的制備步驟之前、期間或之后，將細胞洗滌一次或多次。洗滌可以在任何合適的緩沖液或培養(yǎng)基中進行，例如，補充有HABS或HSA的CliniMACS緩沖液，PlasmaLyte，TCGM，PBS，林格氏液(Ringer’s solution)，生理鹽水，0.9％NaCl，或者不含鈣、鎂和大多數(shù)(即使不是全部)其它二價陽離子的其它合適的溶液，或者任何合適的培養(yǎng)基，或者以上的任何合適組合。在一個實施方案中，在分離PBMC之后，將它們在諸如Cobe 2991細胞處理器、Cell Saver 5、Baxter CytoMate、LOVO等的半自動直流離心機中洗滌。在另一實施方案中，在分離PBMC之后，將它們轉(zhuǎn)移至另一無菌器皿中，例如，轉(zhuǎn)移或培養(yǎng)器皿。本文使用的術(shù)語“器皿”通常涉及能夠用于培養(yǎng)、操縱、操作、儲存、分析、孵育、施用和另外建立、支持、生長、得到、處理、以及離體或體外使用細胞及其副產(chǎn)物的目的或者以其它方式用于如本文所示和所考慮的各種目的任何容器。

“轉(zhuǎn)移器皿(Transfer vessel)”通常指不可透氣的器皿。在一個實施方案中，洗滌在轉(zhuǎn)移器皿中進行，以及隨后的細胞操作在一種或多種類型的細胞培養(yǎng)器皿中進行。

細胞培養(yǎng)器皿的示例性實例包括但不限于細胞培養(yǎng)袋、生物反應(yīng)器(例如，可透氣的快速擴增瓶(G-Rex)生物反應(yīng)器(Wilson-Wolf Manufacturing)；和WAVE生物反應(yīng)器(GE Healthcare Life Sciences))、細胞或組織培養(yǎng)裝置、袋、膠囊、培養(yǎng)小瓶、設(shè)備、細胞工廠、容器、培養(yǎng)管(例如，微量離心管、EPPENDORF錐形管等)、培養(yǎng)皿(例如，皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish))、培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶、滾瓶、多孔板(例如，2孔板、4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔和384孔板)、微培養(yǎng)箱、微載體、微板塊、顯微鏡載玻片(microslide)和腔室玻片。

而在另一實施方案中，可以將PBMC在半自動直流離心機中洗滌一次或多次，以及將其轉(zhuǎn)移并在合適的器皿中洗滌一次或多次。

細胞培養(yǎng)袋的示例性實施方案包括但不限于GMP細胞擴增袋、GMP細胞分化袋、EXP-Pak^TM細胞擴增生物容器、VueLife^TM袋、KryoSure^TM袋、KryoVue^TM袋、袋、PermaLife^TM袋、X-Fold^TM袋、Si-Culture^TM袋、Origen生物醫(yī)學冷袋(cryobag)和VectraCell^TM袋。在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)袋包含下述特性中的一種或多種：透氣性(材料對氧氣、二氧化碳和氮氣具有合適的氣體轉(zhuǎn)移率)；可忽略的失水率(材料幾乎不透水)；化學和生物學惰性(材料不與器皿內(nèi)容物反應(yīng))；以及在不同的條件下保留彈性和強度(材料使得器皿能夠微波、UV照射處理、離心，或者在廣泛的溫度內(nèi)使用，例如，-100℃至+100℃)。

本文所考慮的細胞培養(yǎng)器皿的示例性體積包括但不限于約10mL、約25mL、約50mL、約75mL、約100mL、約150mL、約250mL、約500mL、約750mL、約1000mL、約1250mL、約1500mL、約1750mL、約2000mL或更大的體積，包括任何介于中間的體積。例如，介于10mL和25mL之間的體積包括11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、21mL、22mL、23mL和24mL。在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)器皿的體積為約100mL至約10L。

在洗滌所分離的細胞之后，可以測定洗滌后的細胞數(shù)和活力，可以將其低溫保藏用于將來使用或分析，和/或可以使用熒光激活細胞分選(FACS)分析，使用大量細胞標志物，例如CD3，CD4，CD8，CD27，CD28，CD45RA，CD45RO，CD62L，CD127，CD197，CD279和HLA-DR對其進行表征。

4.低溫保藏(Cryopreservation)

在具體實施方案中，使用新鮮分離的包含T細胞的細胞群實踐本文所考慮的T細胞制備方法。在其它具體實施方案中，使用低溫保藏的包含T細胞的細胞群實踐本文所考慮的方法?？梢栽诘玫交蚍蛛xPBMC后，在培養(yǎng)起始和活化之后，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后或在擴增之后或者在任何方法步驟之后，低溫保藏細胞。也可在T細胞制備方法后，低溫保藏制備的T細胞組合物。凍融循環(huán)可以通過移除非T細胞群提供更一致的T細胞組合物。

基于PBMC的分離和本文別處所述，可以將細胞群在如本文所考慮的合適的細胞培養(yǎng)器皿(參見上文)中低溫保藏。可以在合適的細胞培養(yǎng)基和/或冷凍培養(yǎng)基中冷凍細胞群，例如，50％plasmalyte和50％Cryostor 10；50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO)；Cryostor 10；含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS；或者含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白以及7.5％DMSO的培養(yǎng)基，或者含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白以及7.5％DMSO的培養(yǎng)基；或者含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合適的細胞冷凍培養(yǎng)基。然后將細胞在速率可控的冷凍儀中以每分鐘1°的速率冷凍至約-80℃至約-135℃的溫度為，并且在液氮儲存罐的蒸氣相中儲存?？梢允褂每刂评鋬龅钠渌纠苑椒?，以及于-20℃或在液氮中直接不受控制的冷凍。

在低溫保藏之后，將細胞在37℃水浴中解凍，并且在合適的細胞培養(yǎng)基或緩沖液(例如，TCGM)中洗滌。隨后，可以將解凍的細胞用于本文所考慮的制備方法或者用于向?qū)ο笫┯谩？梢匀绫疚膭e處所考慮的進行洗滌步驟。

在某些實施方案中，將包含T細胞的細胞群從個體分離，并且進行活化和刺激以在體外增殖，而無需進一步離體或體外操作。然后可將這樣的細胞直接重新施用至所述個體。在其它實施方案中，將包含T細胞的細胞群分離之后，在進行遺傳修飾以表達工程化的TCR或CAR之前，首先活化并刺激細胞以在體外增殖。在這方面，可以在進行遺傳修飾(即，進行轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染以表達本文所考慮的工程化的TCR或CAR)之前和/或之后培養(yǎng)所述T細胞。

5.培養(yǎng)起始和活化

為了獲得足夠治療劑量的T細胞組合物，用于制備T細胞的既有方法通常進行一輪或多輪的刺激、活化和/或擴增，從而引入了更多污染機會，增加了制備方法的費用和時間，并且通常導(dǎo)致差的細胞療法產(chǎn)物。

本文所考慮的T細胞制備方法包括簡單且穩(wěn)健的培養(yǎng)起始和活化步驟，所述步驟有助于得到為優(yōu)良治療產(chǎn)物的T細胞組合物。在一個實施方案中，培養(yǎng)起始和活化包括在細胞培養(yǎng)器皿(例如，細胞培養(yǎng)袋、GREX生物反應(yīng)器、WAVE生物反應(yīng)器等)中接種細胞群，并且通過初級和共刺激T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化T細胞。還可以在一種或多種另外的生長因子或細胞因子(例如，IL-2、IL7和/或IL-15，或者其任何合適的組合)存在的情況下培養(yǎng)細胞組合物。

在具體實施方案中，培養(yǎng)起始包括將包含T細胞的細胞群(例如，PBMC)以期望的密度(例如，1-5x10⁶個細胞/mL)接種于細胞培養(yǎng)器皿中的合適的細胞培養(yǎng)基中，所述細胞培養(yǎng)基含有一種或多種細胞因子、初級刺激配體和共刺激配體。在另一實施方案中，可以隨后將細胞因子、刺激和共刺激配體添加至含PBMC的細胞培養(yǎng)基中。

在一個實施方案中，如本文別處所考慮的，細胞培養(yǎng)器皿是細胞培養(yǎng)袋，其包括但不限于GMP細胞擴增袋、GMP細胞分化袋、EXP-Pak^TM細胞擴增生物容器、VueLife^TM袋、KryoSure^TM袋、KryoVue^TM袋、袋、PermaLife^TM袋、X-FOLD^TM袋、Si-Culture^TM袋和VectraCell^TM袋。

在具體實施方案中，使細胞培養(yǎng)容器接種總共約1x10⁹個細胞、約5x10⁸個細胞、約1x10⁸個細胞、約5x10⁷個細胞、約1x10⁷個細胞、約5x10⁶個細胞或約1x10⁶個細胞，或者其間任何數(shù)量的細胞。在具體實施方案中，細胞是PBMC，并且接種總共約1x10⁸個細胞。

在某些實施方案中，將細胞群(例如，PBMC)以以下密度接種于細胞培養(yǎng)器皿中：約1x10⁷個細胞/mL、約9x10⁶個細胞/mL、約8x10⁶個細胞/mL、約7x10⁶個細胞/mL、約6x10⁶個細胞/mL、約5x10⁶個細胞/mL、約4x10⁶個細胞/mL、約3x10⁶個細胞/mL、約2x10⁶個細胞/mL、約1x10⁶個細胞/mL、約9x10⁵個細胞/mL、約8x10⁵個細胞/mL、約7x10⁵個細胞/mL、約6x10⁵個細胞/mL、約5x10⁵個細胞/mL、約4x10⁵個細胞/mL、約3x10⁵個細胞/mL、約2x10⁵個細胞/mL或約1x10⁵個細胞/mL，或者其間任何密度的細胞。在具體實施方案中，以約1x10⁶個細胞/mL的密度接種PBMC。

在具體實施方案中，將細胞接種在包含合適的細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)器皿中。合適的細胞培養(yǎng)基的示例性實例包括但不限于：T細胞生長培養(yǎng)基(TCGM；補充有2mM GlutaMAX^TM-I、10mM HEPES和5％人AB血清的X-VIVO^TM15)，CTS^TMOpTmizer^TMT細胞擴增SFM(Life Technologies)，CTS^TMAIM培養(yǎng)基(Life Technologies)，RPMI 1640，Clicks，DMEM，MEM，a-MEM，F(xiàn)-12，X-Vivo 15(Lonza)，無血清培養(yǎng)基(CellGenix)，以及含有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素的X-Vivo 20(Lonza)，所述X-Vivo 20不含血清或者補充有適量的血清(或血漿)，或者補充有一組確定的激素，和/或足夠用于T細胞生長和擴增的量的細胞因子。在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基是TCGM。

本文所考慮的細胞培養(yǎng)基還可以包含一種或多種因子，所述因子包括但不限于血清(例如，胎牛血清或人血清)、白細胞介素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α。

在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基可以包含一種或多種細胞因子，例如如IL-2、IL-7和/或IL-15，或者其任何合適的組合。各細胞因子的合適濃度或者細胞因子總濃度的示例性實例包括約25IU/mL、約50IU/mL、約75IU/mL、約100IU/mL、約125IU/mL、約150IU/mL、約175IU/mL、約200IU/mL、約250IU/mL、約300IU/mL、約350IU/mL、約400IU/mL、約450IU/mL或約500IU/mL，或者其間任何量的細胞因子。在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含各自或者總共為約100IU/mL的IL-2、IL-1和/或IL-15，或者其任意組合。

在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含各自或者總共為約250IU/mL的IL-2、IL-1和/或IL-15，或者其任意組合。

在具體實施方案中，使PBMC或分離的T細胞與一種或多種刺激劑和共刺激劑(如抗CD3和抗CD28抗體)以及一種或多種細胞因子(如IL-2、IL-7和/或IL-15)接觸.

可以通過經(jīng)T細胞TCR/CD3復(fù)合物或者經(jīng)CD2表面蛋白的刺激提供初級刺激信號，以及通過經(jīng)輔助分子(如CD28或4-1BBL)提供次級共刺激信號來實現(xiàn)T細胞的活化。

可以通過使T細胞與合適的CD3結(jié)合劑(例如，CD3配體或抗CD3單克隆抗體)接觸來刺激TCR/CD3復(fù)合物。CD3抗體的示例性實例包括但不限于，OKT3、G19-4、BC3和64.1。還可以使用與上述抗體中任一種的相同表位結(jié)合的其它抗體。可以通過如本文別處所公開的標準技術(shù)制備并鑒定另外的抗體或者抗體組合。在一個實施方案中，抗CD3抗體是OKT3。

在另外的實施方案中，可將CD2結(jié)合劑用于向T細胞提供初級刺激信號。CD2結(jié)合劑的示例性實例包括但不限于，CD2配體和抗CD2抗體，例如與T11.1或T11.2抗體組合的T11.3抗體(Meuer,S.C.等人，(1984)Cell 36:897-906)，以及與9-1抗體組合的9.6抗體(其與TI 1.1識別相同的表位)(Yang,S.Y.等人，(1986)J.Immunol.137:1097-1100)。

除了通過TCR/CD3復(fù)合物，或者經(jīng)CD2提供的初級刺激信號之外，誘導(dǎo)T細胞應(yīng)答需要次級共刺激信號。在具體實施方案中，可將CD28結(jié)合劑用于提供共刺激信號。合適的共刺激配體包括但不限于：CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L 1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可誘導(dǎo)的共刺激配體(ICOS-L)、細胞間粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、ILT3、ILT4、結(jié)合Toll配體受體的激動劑或抗體以及與B7-H3特異性結(jié)合的配體。

在具體實施方案中，共刺激配體包括與T細胞上存在的共刺激分子特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括但不限于：CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、1COS、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83特異性結(jié)合的配體。

CD28結(jié)合劑的示例性實例包括但不限于：天然CD28配體，例如CD28的天然配體(例如，B7蛋白家族的成員，如B7-1(CD80)和B7-2(CD86))；以及能夠交聯(lián)CD28分子的抗CD28單克隆抗體或其片段，例如單克隆抗體9.3、B-T3、XR-CD28、KOLT-2、15E8、248.23.2和EX5.3D10。在一個實施方案中，抗CD28抗體是15E8。

在一個實施方案中，提供初級刺激信號的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)與共刺激分子在同一表面偶聯(lián)。

在某些實施方案中，提供刺激和共刺激信號的結(jié)合劑位于細胞表面。這可以通過用編碼結(jié)合劑的核酸以適于其在細胞表面表達的形式轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞或者可選地通過將結(jié)合劑與細胞表面偶聯(lián)來實現(xiàn)。

在另一實施方案中，提供初級刺激信號的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子展示于抗原遞呈細胞上。

在一個實施方案中，提供初級刺激信號的分子(例如通過TCR/CD3復(fù)合物或CD2提供刺激的分子)和共刺激分子存在于不同的表面上。

在某一實施方案中，提供刺激和共刺激信號的結(jié)合劑之一是可溶的(以溶液的形式提供)，以及其它試劑存在于一個或多個表面上。

在具體實施方案中，提供刺激和共刺激信號的結(jié)合劑均以可溶的形式提供(以溶液的形式提供)。

在不同實施方案中，本文所考慮的用于制備T細胞的方法包括通過使T細胞與可溶的抗CD3和抗CD28抗體接觸而活化T細胞。

在具體實施方案中，用于活化T細胞的細胞培養(yǎng)基包含以下濃度的抗CD3抗體或CD3結(jié)合劑：約10ng/mL、約20ng/mL、約30ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL或約200ng/mL或者任意介于中間的濃度。

在某些實施方案中，用于活化T細胞的細胞培養(yǎng)基包含以下濃度的抗CD28抗體或CD28結(jié)合劑：約10ng/mL、約20ng/mL、約30ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、約100ng/mL或約200ng/mL或者任意介于中間的濃度。

在不同實施方案中，用于活化T細胞的細胞培養(yǎng)基包含約50ng/mL的抗CD3抗體和50ng/mL的抗CD28抗體。

將接種在細胞培養(yǎng)器皿中的細胞群活化至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少9小時、至少10小時、至少11小時、至少12小時、至少13小時、至少14小時、至少15小時、至少16小時、至少17小時、至少18小時、至少19小時、至少20小時、至少21小時、至少22小時、至少23小時或至少24小時或者任意介于中間的時長。

在某些實施方案中，得到、分離并洗滌細胞，起始細胞培養(yǎng)，并且在約18小時至約36小時的時期內(nèi)或在約24小時的時期內(nèi)或者其間任何時長內(nèi)活化全部T細胞。

6.轉(zhuǎn)導(dǎo)

本文所考慮的T細胞制備方法包括對免疫效應(yīng)細胞和/或T細胞進行修飾以表達工程化的T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。在具體實施方案中，將包含T細胞的細胞群活化、修飾以表達工程化的TCR或CAR，以及然后進行培養(yǎng)以擴增。所述步驟可以發(fā)生于同一細胞培養(yǎng)器皿或不同的器皿中?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”指使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，通過病毒感染的手段，向免疫效應(yīng)細胞(包括T細胞)遞送基因或其它核苷酸序列(例如，工程化的TCR或CAR)。在一個實施方案中，通過感染和原病毒整合將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞。在某些實施方案中，如果靶細胞(例如，PBMC或T細胞)包含使用病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過感染被遞送至細胞的基因或其它多核苷酸序列，則其是“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”。在具體實施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在其細胞基因組中包含通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體遞送的一種或多種基因或者其它多核苷酸序列。

可以使用常規(guī)的技術(shù)產(chǎn)生感染性病毒顆粒和病毒儲液。制備病毒儲液的方法是本領(lǐng)域已知的，并且由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113闡述?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)產(chǎn)生滴度為每毫升數(shù)百萬轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU/mL)的重組病毒。在超速離心后，可以獲得約10⁸TU/mL、10⁹TU/mL、10¹⁰TU/mL、10¹¹TU/mL或10¹²TU/mL或者任意介于中間的滴度的濃縮儲液。

可以根據(jù)病毒滴度(TU/mL)遞送病毒，所述病毒滴度可以例如通過使用可商購獲得的p24滴度分析(其為針對p24病毒殼蛋白的ELISA)測定。下述公式可以用于計算pg/mL的p24：每物理顆粒(PP)的慢病毒存在大約2000個p24分子：(2x10³)x(每PP 24x10³Da的p24)，48x10⁶/Avogadro＝(48x10⁶)I(6x10²³)＝每PP 8x10^-17g p24，每1x10^-16g p24大約1PP，每pg p24為1x10⁴PP。合理良好包裝的VSV-G假型慢病毒載體的感染指數(shù)范圍為每1000物理顆粒(PP)1個TU至每100PP 1個TU(或更低)。因此，所述范圍為大約10至100TU/pg p24。通過該轉(zhuǎn)化獲得TU/mL。

還可以通過分析轉(zhuǎn)導(dǎo)的人骨肉瘤(HOS)細胞測定感染滴度(Kutner等人,2009,Nature Protocols 4:495-505)。簡言之，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的HOS細胞在補充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)7天，之后通過DNeasy(Qiagen,Venlo Netherlands,Cat#69506)提取基因組DNA，并且通過定量PCR(qPCR)進行評價。qPCR方案的引物/探針集通過測定慢病毒psi-gag區(qū)拷貝數(shù)/內(nèi)源人RNaseP拷貝數(shù)來測量轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的載體拷貝數(shù)(VCN)。通過對單個原病毒插入進行測序來評估原病毒的整合。

在一個實施方案中，使用HOS細胞系分析來測定病毒滴度。

在具體實施方案中，在大約活化時、活化后約1小時、活化后約2小時、活化后約3小時、活化后約4小時、活化后約5小時、活化后約6小時、活化后約7小時、活化后約8小時、活化后約9小時、活化后約10小時、活化后約11小時、活化后約12小時、活化后約13小時、活化后約14小時、活化后約15小時、活化后約16小時、活化后約17小時、活化后約18小時、活化后約19小時、活化后約20小時、活化后約21小時、活化后約22小時、活化后約23小時、活化后約24小時、活化后約25小時、活化后約26小時、活化后約27小時、活化后約28小時、活化后約29小時或者活化后約30小時或者活化后任意介于中間的時長，在細胞培養(yǎng)器皿中轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的細胞群。

在一個實施方案中，在活化后約20至約24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞群。

本文所考慮的制備方法包括：在細胞培養(yǎng)器皿中，用約1x10⁸至約1x10¹⁰TU/10⁸個PBMC、約5x10⁸至約5x10⁹TU/10⁸個PBMC、約1x10⁹至約5x10⁹TU/10⁸個PBMC、約1x10⁹至約4x10⁹TU/10⁸個PBMC、約1x10⁹至約3x10⁹TU/10⁸個PBMC、約1x10⁹至約2x10⁹TU/10⁸個PBMC或者其間任何TU的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的PBMC。

在一個實施方案中，本文所考慮的制備方法包括：在細胞培養(yǎng)器皿中，用約1x10⁸TU/10⁸個PBMC、約5x10⁸TU/10⁸個PBMC、約6x10⁸TU/10⁸個PBMC、約7x10⁸TU/10⁸個PBMC、約8x10⁸TU/10⁸個PBMC、約9x10⁸TU/10⁸個PBMC、約1x10⁹TU/10⁸個PBMC、約2x10⁹TU/10⁸個PBMC、約3x10⁹TU/10⁸個PBMC、約4x10⁹TU/10⁸個PBMC、約5x10⁹TU/10⁸個PBMC、約6x10⁹TU/10⁸個PBMC、約7x10⁹TU/10⁸個PBMC、約8x10⁹TU/10⁸個PBMC、約9x10⁹TU/10⁸個PBMC或約1x10¹⁰TU/10⁸個PBMC或者任意介于中間的TU的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的PBMC。

在具體實施方案中，用約1x10⁷至約2x10⁹TU/10⁸個PBMC的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。

在一個實施方案中，本文所考慮的制備方法包括：在細胞培養(yǎng)器皿中，以約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100或者任意介于中間的整數(shù)的MOI，用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含活化的T細胞的PBMC。在一個實施方案中，以約20的MOI用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PBMC。

在某些實施方案中，可以將載體在細胞培養(yǎng)基中稀釋多至細胞培養(yǎng)體積的約10％、細胞培養(yǎng)體積的約15％、細胞培養(yǎng)體積的約16％、細胞培養(yǎng)體積的約17％、細胞培養(yǎng)體積的約18％、細胞培養(yǎng)體積的約19％、細胞培養(yǎng)體積的約20％、細胞培養(yǎng)體積的約21％、細胞培養(yǎng)體積的約22％、細胞培養(yǎng)體積的約23％、細胞培養(yǎng)體積的約24％、細胞培養(yǎng)體積的約25％、細胞培養(yǎng)體積的約30％、細胞培養(yǎng)體積的約35％、細胞培養(yǎng)體積的約40％、細胞培養(yǎng)體積的約45％或細胞培養(yǎng)體積的約50％或者其間任何百分數(shù)。

在具體實施方案中，將載體在細胞培養(yǎng)基(例如，TCGM)中稀釋多至細胞培養(yǎng)體積的約20％。

將接種在細胞培養(yǎng)器皿中的細胞群轉(zhuǎn)導(dǎo)約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約54小時或約60小時或者任意介于中間的時長。

在具體實施方案中，將細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)約48小時。

在細胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，可以使它們經(jīng)歷如本文所考慮的一個或多個洗滌步驟，并且隨后接種于合適的細胞培養(yǎng)器皿中，用于擴增。

7.擴增

本文所考慮的T細胞制備平臺可以包括一輪或多輪T細胞擴增。在具體實施方案中，將已活化和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的包含T細胞的細胞群接種在包含適于擴增的細胞培養(yǎng)基的合適的細胞培養(yǎng)器皿中。在具體實施方案中，將細胞接種進生物反應(yīng)器中并且進行周期性地獲得，而無需重新接種。

在某些實施方案中，將細胞以一定的密度重新接種以維持細胞的對數(shù)期生長。

在具體實施方案中，將細胞以以下密度接種在細胞培養(yǎng)物中：約0.1x10⁶至約1x10⁷個細胞/mL、約0.1x10⁶至約0.9x10⁶個細胞/mL、約0.1x10⁶至約0.8x10⁶個細胞/mL、約0.1x10⁶至約0.7x10⁶個細胞/mL、約0.1x10⁶至約0.6x10⁶個細胞/mL、約0.1x10⁶至約0.5x10⁶個細胞/mL、約0.2x10⁶至約0.5x10⁶個細胞/mL或約0.3x10⁶至約0.5x10⁶個細胞/mL或者任何介于中間的細胞密度，只要所述細胞維持在對數(shù)期生長。

在某些實施方案中，將細胞以以下的密度接種在細胞培養(yǎng)物中：約0.1x10⁶個細胞/mL、約0.2x10⁶個細胞/mL、約0.3x10⁶個細胞/mL、約0.4x10⁶個細胞/mL、約0.5x10⁶個細胞/mL、約0.6x10⁶個細胞/mL、約0.7x10⁶個細胞/mL、約0.8x10⁶個細胞/mL、約0.9x10⁶個細胞/mL或約1x10⁷個細胞/mL或者任何介于中間的細胞密度，只要所述細胞維持在對數(shù)期生長。

在一些實施方案中，將細胞以以下的密度接種進生物反應(yīng)器(例如，WAVE生物反應(yīng)器)：約0.1x10⁶個細胞/mL、約0.5x10⁶個細胞/mL、約1x10⁶個細胞/mL、約2x10⁶個細胞/mL、約3x10⁶個細胞/mL、約4x10⁶個細胞/mL、約5x10⁶個細胞/mL、約6x10⁶個細胞/mL、約7x10⁶個細胞/mL、約8x10⁶個細胞/mL、約9x10⁶個細胞/mL或約1x10⁷個細胞/mL或者任何介于中間的細胞密度，只要所述細胞維持在對數(shù)期生長。

在具體實施方案中，將細胞接種在包含用于T細胞擴增的合適的細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)器皿中。用于T細胞擴增的合適的細胞培養(yǎng)基的示例性實例包括但不限于：T細胞生長培養(yǎng)基(TCGM)、CTS^TMOpTmizer^TMT細胞擴增SFM(Life Technologies)、CTS^TMAIM 培養(yǎng)基(Life Technologies)、RPMI 1640、Clicks、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15(Lonza)和X-Vivo 20(Lonza)和/或足夠用于T細胞的生長和擴增的另外的激素、生長因子或細胞因子。在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基是TCGM。在某些實施方案中，細胞培養(yǎng)基還包含一種或多種因子，所述因子包括但不限于血清(例如，胎牛血清或人血清)、白細胞介素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、IL-21、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或者以上的任何組合。

在一個實施方案中，細胞培養(yǎng)基可以包含一種或多種細胞因子，例如如IL-2、IL-7和/或IL-15，或者其任何合適的組合。各細胞因子的合適濃度或細胞因子的總濃度的示例性實例包括約25IU/mL、約50IU/mL、約75IU/mL、約100IU/mL、約125IU/mL、約150IU/mL、約175IU/mL、約200IU/mL、約250IU/mL、約300IU/mL、約350IU/mL、約400IU/mL、約450IU/mL或約500IU/mL或者其間任何細胞因子量。在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含各自或者總共為約100IU/mL的IL-2、IL-1和/或IL-15，或者其任意組合。

在具體實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含各自或者總共為約250IU/mL的IL-2、IL-1和/或IL-15，或者其任意組合。

在具體實施方案中，本文所考慮的T細胞制備方法包括將T細胞擴增約3天至約14天、約3天至約13天、約3天至約12天、約3天至約11天、約3天至約10天、約3天至約9天、約3天至約8天或約3天至約7天或約5天至約8天或者任何介于中間的天數(shù)。在某些實施方案中，本文所考慮的T細胞制備方法包括將T細胞擴增約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天或者約12天。對于整個擴增期，可以在相同的器皿和/或相同類型的器皿中進行擴增，或者對于擴增期，可以在不同的器皿和/或不同類型的器皿中進行擴增。

在一個實施方案中，在細胞培養(yǎng)袋中進行T細胞的擴增，持續(xù)約5天至約8天。

在一個實施方案中，在細胞培養(yǎng)袋中進行T細胞的擴增，持續(xù)約5天至約8天，然后在生物反應(yīng)器中繼續(xù)擴增，所述生物反應(yīng)器包括但不限于WAVE或G-REX生物反應(yīng)器。在具體實施方案中，可以在生物反應(yīng)器中繼續(xù)擴增，持續(xù)約1天、約2天、約3天、約4天或約5天或者更多天。

在另一實施方案中，在生物反應(yīng)器中進行T細胞的擴增，持續(xù)約5天至約8天，所述生物反應(yīng)器包括但不限于WAVE生物反應(yīng)器或G-REX生物反應(yīng)器。

WAVE生物反應(yīng)器允許不同的搖動速率以及各種不同的搖動角度。示例性的搖動速率包括但不限于每分鐘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次搖動。在某些實施方案中，本發(fā)明的刺激和擴增方法提供設(shè)置為1.5°、2°、2.5°、3°、3.5°、4°、4.5°、5°、5.5°、6°、6.5°、7°、7.5°、8°、8.5°或9.0°的搖動平臺角度。

在一個實施方案中，WAVE生物反應(yīng)器的體積是2500mL，搖動速率是約6rpm或約7rpm，角度是約7至約8。

在一個實施方案中，最初在GREX生物反應(yīng)器中將細胞接種在約100mL中，以及在第3天、第4天和第5天將約200mL新鮮生長培養(yǎng)基添加至培養(yǎng)物。在某些實施方案中，將另外的培養(yǎng)基添加至GREX生物反應(yīng)器以在第7天使培養(yǎng)體積達到約1L。

每日或者在任意天數(shù)檢查細胞數(shù)和活力，可以將細胞或一部分細胞低溫保藏，和/或可以通過FACS分析對細胞的標志物的表達進行表征，所述標志物例如CD3、CD4、CD8、CD28、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD27、CD197和HLA-DR轉(zhuǎn)基因。

在一個實施方案中，與開始的T細胞群相比，進行本文所考慮的制備方法的T細胞群擴增至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍或者更多倍。

8.制備的T細胞組合物的回收

在具體實施方案中，本文所考慮的用于制備T細胞的方法包括回收制備的T細胞組合物的步驟，其包括使用半自動直流離心機，例如，Cobe 2991細胞處理器、Cell Saver 5、Baxter CytoMate、LOVO等得到并洗滌擴增的細胞。

在獲得擴增的細胞之前，可以取等份的獲得前的樣本以確立細胞數(shù)、活性、細胞特性(例如，F(xiàn)ACS分析)、純度和/或細胞的其它一般發(fā)行標準(release criteria)。此外，可以取等份的獲得后樣本以確立細胞數(shù)和/或活力。

然后將回收的T細胞組合物轉(zhuǎn)移至一個或多個IV袋或其它合適的器皿，例如GMP細胞擴增袋、GMP細胞分化袋、EXP-Pak^TM細胞擴增生物容器、VueLife^TM袋、KryoSure^TM袋、KryoVue^TM袋、袋、PermaLife^TM袋、X-FOLD^TM袋、Si-Culture^TM袋、Origen生物醫(yī)學冷袋和VectraCell^TM袋，并且如前面和本文別處所討論的在速率可控的冷凍儀中低溫保藏，直到準備使用細胞。在具體實施方案中，將細胞冷凍于50％plasmalyte和50％Cryostor 10；50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO)；或Cryostor 10中。

將含有治療性T細胞組合物的袋(10至250mL容量)在監(jiān)測為-80℃至-135℃的血庫條件下儲存。將輸液袋儲存于冷凍庫中直到需要。

D.工程化的T細胞受體和嵌合抗原受體

所考慮的T細胞制備方法對于擴增被修飾以以可靠且可復(fù)制的方式表達高親和力的T細胞受體(工程化的TCR)或嵌合抗原受體(CAR)的T細胞特別有用。在一個實施方案中，對T細胞進行遺傳修飾以表達一種或多種工程化的TCR或CAR。如本文所使用的，本文考慮的被修飾以表達工程化的TCR或CAR的T細胞可被稱作“抗原-特異性重定向T細胞”。

1.工程化的TCR

天然存在的T細胞受體包含兩個亞基，α-亞基和β-亞基，其各自是在各T細胞基因組中通過重組事件產(chǎn)生的獨特蛋白?？梢葬槍CR對特定靶抗原的選擇性篩選TCR文庫。以該方式，可以對對靶抗原具有高親合力和反應(yīng)性的天然TCR進行選擇，對其進行克隆，以及隨后將其引入T細胞群用于過繼免疫療法。

在一個實施方案中，通過引入編碼具有形成TCR的能力的TCR亞基的多核苷酸對T細胞進行修飾，所述TCR賦予T細胞對表達靶抗原的腫瘤細胞的特異性。在具體實施方案中，與天然存在的亞基相比，亞基具有一個或多個氨基酸的置換、缺失、插入或修飾，只要所述亞基保留形成TCR的能力，其賦予以上轉(zhuǎn)染的T細胞靶向靶細胞，并且參與免疫相關(guān)細胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。工程化的TCR優(yōu)選地還以高親合力結(jié)合展示相關(guān)腫瘤相關(guān)肽的靶細胞，并且任選地介導(dǎo)對在體內(nèi)遞呈相關(guān)肽的靶細胞進行有效殺傷。

編碼工程化的TCR的核酸優(yōu)選地分離自它們在T細胞(天然存在)染色體中的天然環(huán)境，并且可被并入如本文別處所描述的合適的載體中?？蓪⒑怂岷陀行О龊怂岬妮d體轉(zhuǎn)入細胞，所述細胞優(yōu)選為T細胞。然后修飾的T細胞能夠表達由轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸所編碼的TCR的兩條鏈。在優(yōu)選實施方案中，工程化的TCR是外源TCR，因為其被引入通常不表達所述特定TCR的T細胞。工程化的TCR的基本方面是其對通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)或類似的免疫組分呈遞的腫瘤抗原具有高親合力。與工程化的TCR相比，CAR被工程化以以MHC獨立的方式結(jié)合靶抗原。

由本發(fā)明的核酸所編碼的蛋白可以與連接至本發(fā)明的TCR的α-鏈或β-鏈的氨基末端或羧基末端部分的其它多肽一起表達，只要所連接的其它多肽不干擾α-鏈或β-鏈形成功能性T細胞受體以及MHC依賴性抗原識別的能力。

被本文所考慮的工程化的TCR識別的抗原包括但不限于癌癥抗原，包括血液癌和實體瘤上的抗原。示例性的抗原包括但不限于α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2。

2.嵌合抗原受體(CAR)

本文所考慮的T細胞制備方法包括對T細胞進行修飾以表達如本文所考慮的一種或多種CAR。在不同實施方案中，本發(fā)明提供用載體進行遺傳工程化的T細胞，所述載體被設(shè)計以表達將細胞毒性重定向至腫瘤細胞的CAR。CAR是這樣的分子：其將基于抗體的對靶抗原(例如，腫瘤抗原)的特異性與T細胞受體活化胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生呈現(xiàn)特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白。本文使用的術(shù)語“嵌合”描述了其由來自不同來源的不同蛋白或DNA的部分組成。

本文所考慮的CAR包含胞外結(jié)構(gòu)域(也被稱作結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域與特定的靶抗原結(jié)合。CAR的主要特性是它們使免疫效應(yīng)細胞特異性重定向的能力，從而引發(fā)增殖、細胞因子的產(chǎn)生、吞噬作用或者能夠以獨立于主要組織相容性(MHC)的方式介導(dǎo)表達靶抗原的細胞的細胞死亡的分子的產(chǎn)生，利用單克隆抗體、可溶性配體或細胞特異性共受體的細胞特異性靶向的能力。

在具體實施方案中，CAR包含特異性結(jié)合靶抗原的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括但不限于抗體或其抗原結(jié)合片段、束縛配體或者共受體的胞外結(jié)構(gòu)域，所述靶抗原是腫瘤相關(guān)抗原(TAA)或腫瘤特異性抗原(TSA)。在某些實施方案中，TAA或TSA在血癌細胞上表達。在另一實施方案中，TAA或TSA在實體瘤細胞上表達。在具體實施方案中，實體瘤是膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、除非小細胞肺癌之外的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌、脾臟癌、皮膚癌、除膠質(zhì)母細胞瘤之外的腦癌、腎癌、甲狀腺癌等。

在具體實施方案中，TAA或TSA選自：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM和VEGFR2。

a.結(jié)合結(jié)構(gòu)域

在具體實施方案中，本文所考慮的CAR包含與在腫瘤細胞上表達的靶標多肽(例如，靶抗原)特異性結(jié)合的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文使用的術(shù)語“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)構(gòu)域”、“胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗原-特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”和“胞外抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域”可互換使用，并且提供具有與目的靶抗原特異性結(jié)合的能力的CAR。結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包含具有特異性識別并結(jié)合生物分子(例如，細胞表面受體或腫瘤蛋白、脂質(zhì)、多糖或者其它細胞表面靶標分子或其組分)的能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含任何天然存在的、合成的、半合成的或者重組產(chǎn)生的目的生物分子的結(jié)合伴侶。

在具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體或其抗原結(jié)合片段?！翱贵w”指這樣的結(jié)合劑：其為至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽，所述免疫球蛋白可變區(qū)特異性識別并結(jié)合靶抗原(如肽、脂質(zhì)、多糖或含有抗原決定簇的核酸(如通過免疫細胞所識別的那些))的表位。抗體包括其抗原結(jié)合片段。該術(shù)語還包括遺傳工程化的形式，如嵌合抗體(例如，人源化的鼠抗體)、異源綴合抗體(heteroconjugate antibody)(如，雙特異抗體)及其抗原結(jié)合片段。還參見，Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,第三版.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。

在具體實施方案中，靶抗原是以下的表位：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽。

輕鏈和重鏈可變區(qū)含有被三個高變區(qū)間隔的“框架”區(qū)，也被稱為“互補決定區(qū)”或“CDR”。通過常規(guī)方法，如通過根據(jù)Kabat等(Wu,TT和Kabat,E.A.,J Exp Med.132(2):211-50,(1970)；Borden,P.和Kabat E.A.,PNAS,84:2440-2443(1987)；(參見,Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services,1991,在此將其通過引用并入)所述的序列，或者通過根據(jù)Chothia等人(Choithia,C.和Lesk,A.M.,J Mol.Biol.,196(4):901-917(1987),Choithia,C.等人,Nature,342:877-883(1989))所述的結(jié)構(gòu)來限定或鑒定CDR。

不同輕鏈或重鏈的框架區(qū)的序列在物種(如人)內(nèi)相對保守?？贵w的框架區(qū)(其為組成的輕鏈或重鏈的組合框架區(qū))用于在三維空間中定位和對齊CDR。CDR主要負責與抗原表位結(jié)合。各鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-末端開始順序編號，并且通常還通過特定CDR所位于的鏈進行鑒定。因此，位于抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域上的CDR被稱作CDRH1、CDRH2和CDRH3，而位于抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR被稱作CDRL1、CDRL2和CDRL3。具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同的組合位點)的抗體具有不同的CDR。盡管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內(nèi)只有有限數(shù)量的氨基酸位點直接參與抗原結(jié)合。CDR內(nèi)的這些位點被稱為特異性決定殘基(SDR)。

提及“V_H”或“VH”，指免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)，包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的重鏈可變區(qū)。提及“V_L”或“VL”，指免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，其包括抗體、Fv、scFv、dsFv、Fab或如本文所公開的其它抗體片段的輕鏈可變區(qū)。

“單克隆抗體”是由B淋巴細胞的單一克隆或者由轉(zhuǎn)染有單一抗體的輕鏈或重鏈基因的細胞所產(chǎn)生的抗體。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過從骨髓瘤細胞與免疫脾細胞的融合體制備雜交抗體形成細胞來產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體。

“嵌合抗體”具有來自來自一個物種(如人)的框架殘基和來自另外物種(如小鼠)的CDR(其通常賦予抗原結(jié)合)。在具體的優(yōu)選實施方案中，本文所考慮的CAR包含抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域為嵌合抗體或其抗原結(jié)合片段。

在某些優(yōu)選實施方案中，抗體是與腫瘤細胞上的表面蛋白特異性結(jié)合的人源化抗體(如人源化單克隆抗體)?！叭嗽椿笨贵w是包含人框架區(qū)和來自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一種或多種CDR的免疫球蛋白?？梢酝ㄟ^遺傳工程的方法構(gòu)建人源化抗體(參見例如，美國專利第5,585,089號)。

在具體實施方案中，CAR的胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體或其抗原結(jié)合片段，包括但不限于駱駝Ig(駱駝科抗體(VHH))、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)’2片段、F(ab)’3片段、Fv、單鏈Fv抗體(“scFv”)、雙-scFv、(scFv)2、微型抗體(minibody)、雙功能抗體(diabody)、三功能抗體(triabody)、四功能抗體(tetrabody)、二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(“dsFv”)和單域抗體(sdAb，納米抗體)。

本文使用的“駱駝Ig”或“駱駝科VHH”指重鏈抗體的最小已知抗原結(jié)合單元(Koch-Nolte等人,FASEB J.,21:3490-3498(2007))?！爸劓溈贵w”或“駱駝科抗體”指含有兩個VH結(jié)構(gòu)域且無輕鏈的抗體(Riechmann L.等人,J.Immunol.Methods 231:25–38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利第6,005,079號)。

“免疫球蛋白新抗原受體”的“IgNAR”指來自鯊魚免疫庫的抗體類，其由一個可變的新抗原受體(VNAR)結(jié)構(gòu)域和五個恒定的新抗原受體(CNAR)結(jié)構(gòu)域的同源二聚體組成。

抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(叫做“Fab”片段)和剩余的“Fc”片段，所述兩個相同的抗原結(jié)合片段各自具有單一抗原結(jié)合位點，“Fc”片段的名字反映了其容易結(jié)晶的能力。Fab片段含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且還含有輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加了幾個殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH是本文對恒定結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基具有游離的硫醇基的Fab′的命名。F(ab’)2抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對，所述Fab’片段對在其間具有鉸鏈半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)體也是已知的。

“Fv”是最小的抗體片段，其含有完整的抗原結(jié)合位點。在單鏈Fv(scFv)種類中，一個重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以通過柔性肽接頭共價連接，使得輕鏈或重鏈可以以與雙鏈Fv種類中的類似的“二聚”結(jié)構(gòu)的形式結(jié)合。

術(shù)語“雙功能抗體(diabody)”指具有兩個抗原結(jié)合位點的抗體片段，所述片段在同一多肽鏈中(VH-VL)包含與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不能使同一鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，強迫所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙特異抗體可以是二價的或雙特異性的。雙功能抗體更充分地描述于例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗體和四功能抗體也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)。

“單結(jié)構(gòu)域抗體”或“sdAb”或“納米抗體”指由抗體重鏈的可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)或抗體輕鏈的可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)組成的抗體片段(Holt,L.等人，Trends in Biotechnology,21(11):484-490)。

“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個多肽鏈上且處于任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)。通常，scFv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，所述接頭使scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。對于scFv的綜述，參見，例如，Pluckthün,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York,1994),pp.269-315。

在某些實施方案中，scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽。

b.接頭

在某些實施方案中，本文所考慮的CAR可以在各個結(jié)構(gòu)域之間，(例如在V_H和V_L結(jié)構(gòu)域之間)包含接頭殘基，添加所述接頭殘基為了所述分子的適當?shù)拈g距和構(gòu)象。本文所考慮的CAR可以包含1、2、3、4或5個或者更多個接頭。在具體實施方案中，接頭的長度是約1至約25個氨基酸、約5至約20個氨基酸或約10至約20個氨基酸或者任意介于中間長度的氨基酸。在一些實施方案中，接頭的長度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或者更多個氨基酸。

接頭的示例性實例包括甘氨酸聚合物(G)_n；甘氨酸-絲氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少為1、2、3、4或5的整數(shù)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；以及本領(lǐng)域已知的其它柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物相對非結(jié)構(gòu)化，并且因此可以作為融合蛋白(如本文所描述的CAR)的結(jié)構(gòu)域之間的中性系鏈(neutral tether)。甘氨酸甚至比丙氨酸顯著更大程度地接近phi-psi空間，并且比具有更長側(cè)鏈的殘基受到更少的限制(參見Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。普通技術(shù)人員將理解，在具體實施方案中，CAR的設(shè)計可以包含全部或部分柔性的接頭，使得接頭可以包含柔性接頭以及賦予較小柔性結(jié)構(gòu)的一個或多個部分以提供期望的CAR結(jié)構(gòu)。

其它示例性接頭包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO：1)；TGEKP(SEQ ID NO：2)(參見，例如，Liu等人,PNAS5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO：3)(Pomerantz等人.1995,同上)；(GGGGS)_n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO：4)(Kim等人,PNAS 93,1156-1160(1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：5)(Chaudhary等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：6)(Bird等人,1988,Science242:423-426)，GGRRGGGS(SEQ ID NO：7)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：8)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：9)；LRQKd(GGGS)₂ERP(SEQ ID NO：10)?？蛇x地，使用能夠模擬DNA-結(jié)合位點和肽自身的計算機程序(Desjarlais&Berg,PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS91:11099-11103(1994))或者通過噬菌體展示方法可以理性地設(shè)計柔性接頭。

在具體實施方案中，CAR包含還含有可變區(qū)連接序列的scFV。“可變區(qū)連接序列”是將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接的氨基酸序列，并且提供與兩個亞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用兼容的間隔功能，以使所得到的多肽對與包含相同輕鏈或重鏈可變區(qū)的抗體相同的靶分子維持特異性結(jié)合親和性。在一個實施方案中，可變區(qū)連接序列的長度是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或更多個氨基酸。在具體實施方案中，可變區(qū)連接序列包含甘氨酸-絲氨酸聚合物(G_1-5S_1-5)_n，其中n是至少為1、2、3、4或5的整數(shù)。在另一實施方案中，可變區(qū)連接序列包含(G₄S)₃氨基酸接頭。

c.間隔結(jié)構(gòu)域

在具體實施方案中，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個或多個“間隔結(jié)構(gòu)域”，所述“間隔結(jié)構(gòu)域”指這樣的區(qū)域：其使抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域遠離效應(yīng)細胞的表面，使能夠進行適當?shù)募毎?細胞接觸、抗原結(jié)合和活化(Patel等人,GeneTherapy,1999；6:412-419)。間隔結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。在某些實施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于，一個或多個重鏈恒定區(qū)，例如，CH2和CH3。間隔結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。

在一個實施方案中，間隔結(jié)構(gòu)域包含IgG1的CH2和CH3。

d.鉸鏈結(jié)構(gòu)域

通常，CAR的結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后是一個或多個“鉸鏈結(jié)構(gòu)域”，其在將抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域定位于遠離效應(yīng)細胞表面以能夠進行適當?shù)募毎?細胞接觸、抗原結(jié)合和活化方面發(fā)揮作用。CAR通常在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)之間包含一個或多個鉸鏈結(jié)構(gòu)域。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。鉸鏈結(jié)構(gòu)域可以包含天然存在的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)或改變的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。

適合用于本文所描述的CAR的示例性鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括源自1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28和CD7)胞外區(qū)的鉸鏈區(qū)，其可以是來自這些分子的野生型鉸鏈區(qū)，或者可以是改變了的鉸鏈區(qū)。在另一實施方案中，鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含CD8α鉸鏈區(qū)。

e.跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域

“跨膜結(jié)構(gòu)域”是CAR的一部分，其使胞外結(jié)合部分和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域融合，并且使CAR錨定至免疫效應(yīng)細胞的質(zhì)膜上。TM結(jié)構(gòu)域可以源自天然的、合成的、半合成的或重組來源。

示例性的TM結(jié)構(gòu)域可以源自(即，至少包括以下的跨膜區(qū))：T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。

在一個實施方案中，本文所考慮的CAR包含源自CD8α的TM結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本文所考慮的CAR包含源自CD8α的TM結(jié)構(gòu)域和優(yōu)選長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸的短的寡肽或多肽接頭，所述接頭連接CAR的TM結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。甘氨酸-絲氨酸接頭提供特別合適的接頭。

f.胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

在具體實施方案中，本文所考慮的CAR包含胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?！鞍麅?nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指CAR的一部分，其參與將有效的CAR結(jié)合靶抗原的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)進免疫效應(yīng)細胞的內(nèi)部，以引發(fā)效應(yīng)細胞的功能，例如活化、細胞因子的產(chǎn)生、增殖和細胞毒性活性，包括將細胞毒性因子釋放至CAR結(jié)合的靶細胞或者用與胞外CAR結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原引發(fā)的其它細胞應(yīng)答。

術(shù)語“效應(yīng)功能”指細胞的特化功能。T細胞的效應(yīng)功能，例如，可以是細胞溶解活性或者輔助或者包括細胞因子的分泌在內(nèi)的活性。因此，術(shù)語“胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號并引導(dǎo)細胞實施特化功能的蛋白部分。雖然通常可以采用整個胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但是在許多情況下，不必使用整個結(jié)構(gòu)域。就使用胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，此類截短部分可以用于代替整個結(jié)構(gòu)域，只要其能轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號。術(shù)語胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域意指包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

已知，單獨通過TCR產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細胞，并且還需要次級信號或共刺激信號。因此，T細胞活化可以說成是由兩種不同類型的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)：初級信號結(jié)構(gòu)域，其通過TCR(例如，TCR/CD3復(fù)合物)起始抗原依賴的初級活化；和共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其以抗原非依賴性方式起作用以提供次級或共刺激信號。在優(yōu)選實施方案中，本文所考慮的CAR包含含有一個或多個“共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”和“初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以刺激的方式或抑制的方式調(diào)控TCR復(fù)合物的初級活化。以刺激方式起作用的初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含被稱為免疫受體酪氨酸激活基序或ITAM的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基序。

在本發(fā)明中特別有用的含有ITAM的初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的示例性實例包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在具體的優(yōu)選實施方案中，CAR包含CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及一個或多個共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。胞內(nèi)初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以以任意順序串聯(lián)連接至跨膜結(jié)構(gòu)域的羧基末端。

本文所考慮的CAR包含一個或多個共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以增強表達CAR受體的T細胞的效力和擴增。本文使用的術(shù)語“共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“共刺激結(jié)構(gòu)域”指共刺激分子的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

此類共刺激分子的示例性實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD30、CD40、PD-1、ICOS(CD278)、CTLA4、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、TRIM、LCK3、SLAM、DAP10、LAG3、HVEM和NKD2C以及CD83。在一個實施方案中，CAR包含選自CD28、CD137和CD134的一個或多個共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

在一個實施方案中，CAR包含scFv、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽；以及所述一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自：CD28、CD54、CD134、CD137、CD152、CD273、CD274和CD278。

在另一實施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自IgG1鉸鏈/CH2/CH3和CD8α，以及CD8α；所述跨膜結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽；所述一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

而在另一實施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域和一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；所述scFv還含有接頭，其結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域選自：IgG1鉸鏈/CH2/CH3和CD8α，以及CD8α；所述跨膜結(jié)構(gòu)域包含TM結(jié)構(gòu)域和短的寡肽或多肽接頭，所述TM結(jié)構(gòu)域源自選自CD8α，CD4、CD45、PD1和CD152的多肽，所述短的寡肽或多肽接頭將TM結(jié)構(gòu)域與CAR的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接，其長度優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸；以及所述一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

在具體實施方案中，CAR包含scFv，鉸鏈結(jié)構(gòu)域，CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域、一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ初級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；所述scFv結(jié)合α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或VEGFR2多肽；所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域包含CD8α多肽；所述CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域包含約3個氨基酸的多肽接頭；所述一個或多個胞內(nèi)共刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自CD28、CD134和CD137。

E.多肽

本發(fā)明部分考慮工程化的TCR和CAR多肽及其片段，包含所述工程化的TCR和CAR多肽及其片段的細胞和組合物，以及表達多肽的載體?！岸嚯摹?、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”可互換使用，并且指重組的、合成的或非天然的氨基酸聚合物。多肽不限于特定的長度，例如，它們可以包含全長蛋白序列或者全長蛋白的片段，并且可以包括多肽的翻譯后修飾物(例如，糖基化物、乙?；?、磷酸化物等)以及天然存在和非天然存在的本領(lǐng)域已知的其它修飾物。在不同實施方案中，本文所考慮的多肽在蛋白的N端包含信號(或前導(dǎo))序列，其共翻譯或翻譯后地引導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。用于本公開中的合適信號序列的示例性實例包括但不限于IgG1重鏈信號多肽、CD8α信號多肽或人GM-CSF受體α信號多肽?？梢允褂枚喾N熟知的重組和/或合成技術(shù)中的任何技術(shù)來制備多肽。具體地，本文所考慮的多肽包含本公開的CAR，或者本文所考慮的多肽的一個或多個氨基酸缺失、添加和/或置換的序列。

多肽包括“多肽變體”。多肽變體與天然存在多肽的不同之處可以在于一處或多處置換、缺失、添加和/或插入。此類變體可以是天然存在的或者例如通過對上述多肽序列中的一種或多種進行修飾而合成產(chǎn)生的。例如，在具體實施方案中，可以期望通過引入一處或多處置換、缺失、添加和/或插入來改善工程化的TCR或CAR的結(jié)合親和力和/或其它生物學特性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包括與其具有至少約65％、70％、75％、85％、90％、95％、98％或99％的氨基酸同一性的多肽。

多肽包括“多肽片段”。多肽片段指天然存在的或重組產(chǎn)生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或內(nèi)部的缺失或置換的多肽，其是單體或多體。在某些實施方案中，多肽片段可以包含至少5個至約500個氨基酸長度的氨基酸鏈。將理解，在某些實施方案中，片段的長度為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450個氨基酸。

多肽還可以框內(nèi)融合或者與接頭或其它序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多His)，或者以增強多肽與固體支持物的結(jié)合。

如上所注意到的，可以以多種方式改變本文所考慮的多肽，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。此類操作的方法在本領(lǐng)域通常是已知的。例如，可以通過DNA的突變制備參照多肽的氨基酸序列變體。用于突變發(fā)生和核苷酸序列改變的方法在本領(lǐng)域眾所周知。參見，例如，Kunkel(1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:488-492)、Kunkel等(1987,Methods in Enzymol,154:367-382)、美國專利第4,873,192號、Watson,J.D.等(《基因的分子生物學》(Molecular Biology of the Gene))，第四版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及其中所引用的參考文獻。關(guān)于不影響目的蛋白的生物學活性的適當氨基酸置換的指導(dǎo)可見于Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模式。

在某些實施方案中，變體將包含保守性置換?！氨Ｊ匦灾脫Q”是這樣的置換，其中氨基酸被置換為具有類似特性的另一氨基酸，使得肽化學領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期所述多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水(hydropathic)性質(zhì)基本上未改變?？梢詫Ρ景l(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)進行修飾，并仍然獲得編碼具有期望特性的變體或衍生多肽的功能分子。

多肽變體還包括糖基化形式、與其它分子的聚集綴合物，以及具有不相關(guān)的化學部分(例如，聚乙二醇化的分子)的共價綴合物。如本領(lǐng)域所知，可以通過將官能團與存在于氨基酸鏈的基團或位于N-末端或C-末端的殘基連接來制備共價變體。變體還包括等位變體、物種變體和突變蛋白(mutein)。不影響蛋白功能活性的區(qū)域的截短或缺失也是變體。

在一個實施方案中，當期望表達兩種或更多種多肽時，可以通過如本文別處所討論的IRES序列隔開編碼所述多肽的多核苷酸序列。在另一實施方案中，兩種或更多種多肽可以表達為包含一個或多個自切割多肽序列的融合蛋白。

本發(fā)明的多肽包括融合多肽。在優(yōu)選實施方案中，提供融合多肽和編碼融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白指包含至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個或更多個多肽區(qū)段的多肽。融合多肽通常是C-末端連接至N-末端，但是它們也可以是C-末端連接至C-末端、N-末端連接至N-末端、或者N-末端連接至C-末端。融合蛋白的多肽可以是任意順序或指定的順序。融合多肽或融合蛋白還可以包括保守修飾的變體、多態(tài)變體、等位基因、突變體、子序列以及種間同系物，只要保留融合多肽的期望轉(zhuǎn)錄活性?？梢酝ㄟ^化學合成方法或者通過兩個部分之間化學鍵合來產(chǎn)生融合多肽，或者通?？梢允褂闷渌鼧藴始夹g(shù)來制備融合多肽。將包含融合多肽的連接的DNA序列與如本文別處所討論的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件可操作地連接。

在一個實施方案中，融合伴侶包含有助于以比天然重組蛋白更高的產(chǎn)率表達蛋白的序列(表達增強子)?？梢赃x擇其它融合伴侶，以增加蛋白的溶解性或者使蛋白能夠靶向期望的胞內(nèi)區(qū)室或者促進融合蛋白通過細胞膜的轉(zhuǎn)運。

融合多肽還可以在本文所描述的各多肽結(jié)構(gòu)域之間包含多肽切割信號。此外，多肽位點可以位于任何接頭肽序列。示例性的多肽切割信號包括多肽切割識別位點，如蛋白酶切割位點、核酸酶切割位點(例如，罕見限制性酶識別位點、自切割核酶識別位點)和自切割病毒寡肽(參見deFelipe和Ryan,2004.Traffic,5(8)；616-26)。

合適的蛋白酶切割位點和自切割肽是對技術(shù)人員來說是已知的(參見，例如，Ryan等人,1997.J.Gener.Virol.78,699-722；Scymczak等人(2004)Nature Biotech.5,589-594)。示例性蛋白酶切割位點包括但不限于以下的切割位點：馬鈴薯Y病毒NIa蛋白酶(例如、煙草蝕紋病毒蛋白酶)、馬鈴薯Y病毒HC蛋白酶、馬鈴薯Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus RNA-2-編碼的蛋白酶、口蹄疫病毒L蛋白酶、腸病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、小RNA病毒(picorna)3C蛋白酶、豇豆花葉病毒24K蛋白酶、線蟲傳多面體病毒24K蛋白酶、RTSV(水稻東格魯球狀病毒)3C-樣蛋白酶、PYVF(歐防風黃點病毒)3C-樣蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和腸激酶。由于其高的切割嚴格性，在一個實施方案中，優(yōu)選TEV(煙草蝕紋病毒)蛋白酶切割位點，例如，EXXYXQ(G/S)(SEQ ID NO：11)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO：12)和ENLYFQS(SEQ ID NO：13)，其中X代表任何氨基酸(TEV切割發(fā)生在Q和G或者Q和S之間)。

在具體實施方案中，自切割肽包括獲自以下的那些多肽序列：馬鈴薯Y病毒和心病毒2A肽、FMDV(口蹄疫疾病病毒)、馬鼻炎病毒A、明脈扁刺蛾β四體病毒和豬捷申病毒。

在某些實施方案中，自切割多肽位點包含2A或2A-樣位點、序列或結(jié)構(gòu)域(Donnelly等人,2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。

F.多核苷酸

在具體實施方案中，提供編碼本文所考慮的一種或多種工程化的TCR或CAR多肽的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸”指信使RNA(mRNA)、RNA、基因組RNA(gRNA)、正鏈RNA(RNA(+))、負鏈RNA(RNA(-))、基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)、重組DNA、合成的DNA或非天然存在的DNA。多核苷酸包括單鏈和雙鏈多核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包括與本文所描述的任何參照序列(參見，例如，序列表)具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的多核苷酸或變體，通常，其中所述變體維持參照序列的至少一種生物學活性。在不同的示例性實施方案中，本發(fā)明部分考慮包含多核苷酸的表達載體、病毒載體、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和組合物，以及包含所述包含多核苷酸的表達載體、病毒載體、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和組合物的細胞。

在具體實施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽的至少約5、10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、500、1000、1250、1500、1750或2000個或者更多個連續(xù)氨基酸殘基，以及所有中間長度的連續(xù)氨基酸殘基的多核苷酸。將容易理解，本背景中的“中間長度”意指引用的數(shù)值之間的任意長度，如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。

本文使用的術(shù)語“多核苷酸變體”和“變體”等，指與參照多核苷酸序列呈現(xiàn)基本的序列同一性的多核苷酸，或者在其后所定義的嚴格條件下與參照序列雜合的多核苷酸。這些術(shù)語包括與參照多核苷酸相比，添加或缺失了一個或多個核苷酸，或者用不同核苷酸替代一個或多個核苷酸的多核苷酸。在這點上，在本領(lǐng)域眾所周知的是，可以對參照多核苷酸進行某些改變，包括突變、添加、缺失和置換，以使改變的多核苷酸保留參照多核苷酸的生物學功能或活性。

本文使用的敘述“序列同一性”或者例如，包含“與…50％相同的序列”，指在比較窗口中以逐個核苷酸或逐個氨基酸為基礎(chǔ)的序列相同的程度。因此，可以通過以下步驟計算“序列同一性百分比”：對比較窗口中兩個最佳對齊的序列進行比較，確定兩個序列中均存在的相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位點數(shù)以得到匹配位點的數(shù)目，將匹配的位點數(shù)除以比較窗口中的總位點數(shù)(即，窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列同一性百分比。包括與本文所描述的任何參照序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽變體維持參照多肽的至少一種生物學活性。

用于描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括“參照序列”、“比較窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同”?！皡⒄招蛄小钡拈L度為至少12個，但經(jīng)常為15至18個，以及通常至少25個單體單元，所述單體單元包括核苷酸和氨基酸殘基。因為兩個多核苷酸可以各自包含(1)兩個多核苷酸之間類似的序列(即，僅完整多核苷酸序列的一部分)和(2)兩個多核苷酸之間不同的序列，所以通常通過比較“比較窗口”中的兩個多核苷酸的序列來進行兩個(或者更多個)多核苷酸之間的序列比較，從而鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。“比較窗口”指至少6個連續(xù)位點，通常約50至約100個，更通常約100至約150個連續(xù)位點的概念上的區(qū)段，其中在將兩個序列最佳對齊后，將序列與相同連續(xù)位點數(shù)的參照序列進行比較。為了兩個序列的最佳比對，比較窗口可以包含與參照序列(其不包含添加或缺失)相比約20％或更少的添加或缺失(即，空位)?？梢酝ㄟ^算法的計算機化實施(威斯康星遺傳學軟件包版本7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通過檢驗和由所選擇的各種方法中的任一種所產(chǎn)生的最佳對齊(即，在比較窗口中產(chǎn)生最高百分比同源性)，進行對齊比較窗口的序列的最佳比對。還可以參考如例如由Altschul等人,1997,Nucl.Acids Res.25:3389所公開的BLAST程序家族。序列分析的詳細討論可見于Ausubel等人編著的《最新分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology)(John Wiley&Sons Inc,1994-1998,第15章)第19.3單元。

本發(fā)明的多核苷酸(不考慮編碼序列本身的長度)可以與本文別處所公開的或者本領(lǐng)域已知的其它DNA序列組合，使得它們的總長度可以大大改變，所述其它DNA序列如啟動子和/或增強子，非翻譯區(qū)(UTR)，Kozak序列，聚腺苷酸化信號，另外的限制性酶位點，多克隆位點，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，重組酶識別位點(例如LoxP，F(xiàn)RT和Att位點)，終止密碼子，轉(zhuǎn)錄終止信號以及編碼自切割多肽、表位標簽的多核苷酸。因此考慮，可以采用幾乎任意長度的多核苷酸片段，其中總長度優(yōu)選受制備的容易性和在預(yù)期的重組DNA方案中的用途的限制。

可以使用本領(lǐng)域已知且可用的各種很好建立的技術(shù)中的任一種制備、操作和/或表達多核苷酸。為了表達期望的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列插入適當?shù)妮d體中。載體的實例是質(zhì)粒、自主復(fù)制序列和轉(zhuǎn)座元件。另外的示例性載體包括但不限于，質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、人工染色體(如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC))、細菌噬菌體(如λ噬菌體或M13噬菌體)以及動物病毒。可用作載體的動物病毒類的實例包括但不限于：逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(例如、單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒和乳頭多瘤空泡病毒(例如，SV40)。表達載體的實例是用于在哺乳動物細胞中表達的pClneo載體(Promega)；用于在哺乳動物細胞中進行慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在具體實施方案中，可以將本文所公開的嵌合蛋白的編碼序列連接進此類表達載體中，以用于嵌合蛋白在哺乳動物細胞中的表達。

存在于表達載體中的“控制元件”或“調(diào)控序列”是載體的那些非翻譯區(qū)-復(fù)制起點、選擇盒、啟動子、增強子、翻譯起始信號(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)內(nèi)含子、聚腺苷酸化序列、5’和3’非翻譯區(qū)-其與宿主細胞蛋白相互作用以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件在強度和特異性方面可以不同。根據(jù)所利用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括普遍存在的啟動子和可誘導(dǎo)的啟動子。

在具體實施方案中，用于實踐本發(fā)明的載體(包括但不限于表達載體和病毒載體)將包含外源、內(nèi)源或異源控制序列，如啟動子和/或增強子?！皟?nèi)源”控制序列是與基因組中指定的基因天然連接的序列?！巴庠础笨刂菩蛄惺峭ㄟ^遺傳操作的方法(即，分子生物學技術(shù))與基因并列放置，以使所述基因的轉(zhuǎn)錄由連接的增強子/啟動子引導(dǎo)的序列?！爱愒础笨刂菩蛄惺莵碜耘c進行遺傳操作的細胞不同物種的外源序列。

本文使用的術(shù)語“啟動子”指RNA聚合酶所結(jié)合的多核苷酸(DNA或RNA)的識別位點。RNA聚合酶起始并轉(zhuǎn)錄與啟動子可操作地連接的多核苷酸。在具體實施方案中，在哺乳動物細胞中起作用的啟動子包含位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游大約25至30個堿基處的富含AT的區(qū)域和/或存在于轉(zhuǎn)錄開始上游70至80個堿基處的另一序列，CNCAAT區(qū)域，其中N可以是任意核苷酸。

術(shù)語“增強子”指這樣的DNA區(qū)段：其含有能夠提供增強的轉(zhuǎn)錄且在某些情況下可以獨立于其與另外的控制序列相對的方向而起作用的序列。增強子可以與啟動子和/或其它增強子元件合作地或疊加地起作用。術(shù)語“啟動子/增強子”指含有能夠提供啟動子和增強子功能的序列的DNA區(qū)段。

術(shù)語“可操作地連接”指并列，其中所描述的組分處于允許其以它們預(yù)期的方式起作用的關(guān)系中。在一個實施方案中，該術(shù)語指核酸表達控制序列(如啟動子和/或增強子)和第二多核苷酸序列(例如，目的多核苷酸)之間的功能性連接，其中表達控制序列引導(dǎo)與第二序列對應(yīng)的核酸的轉(zhuǎn)錄。

本文使用的術(shù)語“組成型表達控制序列”指連續(xù)地或連續(xù)不斷地允許可操作地連接的序列轉(zhuǎn)錄的啟動子、增強子或啟動子/增強子。組成型表達控制序列可以分別是允許在多種細胞和組織類型中表達的“普遍存在的”啟動子、增強子或者啟動子/增強子，或者是允許在受限制的多種細胞和組織類型中表達的“細胞特異性”、“細胞類型特異性”、“細胞譜系特異性”或“組織特異性”的啟動子、增強子或者啟動子/增強子。

適合用于本發(fā)明的具體實施方案中的示例性的普遍存在的表達控制序列包括但不限于：巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子，病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR啟動子，Rous肉瘤病毒(RSV)LTR，單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動子，來自牛痘病毒的H5、P7.5和P11啟動子，延伸因子1-α(EF1a)啟動子，早期生長應(yīng)答因子1(EGR1)，鐵蛋白H(FerH)，鐵蛋白L(FerL)，甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，真核翻譯起始因子4A1(EIF4A1)，熱休克70kDa蛋白5(HSPA5)，熱休克蛋白90kDaβ成員1(HSP90B1)，熱休克蛋白70kDa(HSP70)，β-驅(qū)動蛋白(β-KIN)，人ROSA 26基因座(Irions等人,Nature Biotechnology 25,1477-1482(2007))，泛素C啟動子(UBC)，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子，巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子，β-肌動蛋白啟動子以及骨髓增殖肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)增強子、負控制區(qū)缺失的dl587rev引物-結(jié)合位點取代的(MND)啟動子(Challita等人,J Virol.69(2):748-55(1995))。

在具體實施方案中，可以期望由在T細胞中提供穩(wěn)定且長期表達的啟動子表達包含工程化的TCR或CAR的多核苷酸，并且表達水平足以使T細胞重定向至表達靶抗原的細胞。在優(yōu)選實施方案中，啟動子是EF1α啟動子或MND啟動子。

本文使用的“條件性表達”可以指任何類型的條件性表達，包括但不限于可誘導(dǎo)的表達；可阻遏的表達；在具有特定生理學、生物學或疾病狀態(tài)等的細胞或組織中的表達。該定義并非意圖排除細胞類型或組織的特異性表達。本發(fā)明的某些實施方案提供目的多核苷酸的條件性表達，例如通過使細胞、組織、有機體等經(jīng)歷引起多核苷酸表達或者引起由目的多核苷酸編碼的多核苷酸的表達增加或減少的處理或條件來控制表達。

誘導(dǎo)型啟動子/系統(tǒng)的示例性實例包括但不限于，類固醇誘導(dǎo)型啟動子(如用于編碼糖皮質(zhì)激素或雌激素受體的基因的啟動子(可通過用對應(yīng)的激素處理來誘導(dǎo)))、金屬硫蛋白啟動子(metallothionine promoter)(可通過用各種重金屬處理來誘導(dǎo))、MX-1啟動子(可通過干擾素誘導(dǎo))、“GeneSwitch”米非司酮調(diào)控系統(tǒng)(Sirin等人,2003,Gene,323:67)、cumate誘導(dǎo)型基因開關(guān)(WO 2002/088346)、四環(huán)素依賴性調(diào)控系統(tǒng)等。

也可以通過使用位點特異性DNA重組酶實現(xiàn)條件性表達。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，載體包含至少一個(通常兩個)位點用于通過位點特異性重組酶介導(dǎo)重組。本文使用的術(shù)語“重組酶”或“位點特異性重組酶”包括參與重組反應(yīng)的分割的或整合的蛋白、酶、輔因子或相關(guān)蛋白，所述重組反應(yīng)涉及一個或多個(例如，2個，3個、4個、5個、7個、10個、12個、15個、20個、30個、50個等)重組位點，其可以是野生型蛋白(參見Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993))，或者其突變體、衍生物(例如，含有重組蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和變體。適合用于本發(fā)明具體實施方案中的重組酶的示例性實例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解離酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1以及ParA。

G.病毒載體

在具體實施方案中，用編碼本文所考慮的工程化的TCR或CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，慢病毒載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)包含T細胞的細胞群(例如，PBMC)或純化的T細胞群。轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞引發(fā)穩(wěn)定、長期且持久的T-細胞應(yīng)答。

本文使用的術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”指將其基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為線性雙鏈DNA拷貝并使其基因組DNA隨后共價整合進宿主基因組的RNA病毒。適合用于具體實施方案中的示例性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend鼠白血病病毒、鼠干細胞病毒(MSCV)和Rous肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。

本文使用的術(shù)語“慢病毒”指復(fù)雜逆轉(zhuǎn)錄病毒組(或?qū)?。示例性慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；維斯納-梅迪病毒(visna-maedi virus)(VMV)病毒；山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)；馬傳染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一個實施方案中，優(yōu)選基于HIV的載體骨架(即，HIV順式作用序列元件)。

術(shù)語“載體”在本文用來指能夠轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)運另外的核酸分子的核酸分子。轉(zhuǎn)移的核酸通常被連接至例如插進載體核酸分子。載體可以包含引導(dǎo)在細胞中的自主復(fù)制的序列，或者可以包含足以允許整合進宿主細胞DNA的序列。有用的載體包括，例如，質(zhì)粒(例如，DNA質(zhì)粒或RNA質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)座子、粘粒、細菌人工染色體和病毒載體。有用的病毒載體包括，例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。

如對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，術(shù)語“病毒載體”廣泛用于指包含通常促進核酸分子的轉(zhuǎn)移或整合進細胞基因組的病毒來源的核酸元件的核酸分子(例如，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒)或者指介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)移的病毒顆粒。病毒顆粒通常包含各種病毒組分，并且有時還包含除核酸之外的宿主細胞組分。

術(shù)語病毒載體可以指能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移進細胞的病毒或病毒顆粒，或者指轉(zhuǎn)移的核酸本身。病毒載體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒含有主要源自病毒的結(jié)構(gòu)和/或功能性遺傳元件。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指含有主要源自逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)和功能性遺傳元件或其部分的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“慢病毒載體”指含有主要源自慢病毒的結(jié)構(gòu)和功能性遺傳元件或者其部分(包括LTR)的病毒載體或質(zhì)粒。術(shù)語“雜合載體”指含有逆轉(zhuǎn)錄病毒例如慢病毒序列和非慢病毒序列的載體、LTR或其它核酸。在一個實施方案中，雜合載體指包含用于逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、整合和/或包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒)序列的載體或轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。

在具體實施方案中，術(shù)語“慢病毒載體”、“慢病毒表達載體”可以用來指慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和/或感染性慢病毒顆粒。當在本文提及諸如克隆位點、啟動子、調(diào)控元件、異源核酸等的元件時，應(yīng)理解，這些元件的序列以RNA形式存在于本發(fā)明的慢病毒顆粒中，以及以DNA形式存在于本發(fā)明的DNA質(zhì)粒中。

在原病毒的各端是叫做“長末端重復(fù)序列”或“LTR”的結(jié)構(gòu)。術(shù)語“長末端重復(fù)序列(LTR)”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA端的堿基對結(jié)構(gòu)域，在其天然序列背景中，所述堿基對結(jié)構(gòu)域是直接的重復(fù)并且含有U3、R和U5區(qū)域。LTR通常對逆轉(zhuǎn)錄病毒基因的表達(例如，基因轉(zhuǎn)錄本的促進、起始和聚腺苷酸化)以及病毒復(fù)制提供基本功能。LTR含有眾多調(diào)控信號，包括轉(zhuǎn)錄控制元件、聚腺苷酸化信號以及用于病毒基因組的復(fù)制和整合所需的序列。將病毒LTR分為叫做U3、R和U5的三個區(qū)域。U3區(qū)含有增強子和啟動子元件。U5區(qū)是引物結(jié)合位點和R區(qū)之間的序列，并且含有聚腺苷酸化序列。R(重復(fù))區(qū)的側(cè)翼是U3和U5區(qū)。LTR由U3、R和U5區(qū)構(gòu)成，并且出現(xiàn)在病毒基因組的5’端和3’端。鄰近5’LTR的是用于基因組反轉(zhuǎn)錄所需的序列(tRNA引物結(jié)合位點)以及用于病毒RNA有效包裝成顆粒所需的序列(Psi位點)。

本文使用的術(shù)語“包裝信號”或“包裝序列”指位于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組內(nèi)的序列，其是將病毒RNA插入病毒衣殼或顆粒所必需的，參見例如，Clever等人,1995.J.of Virology,Vol.69,No.4；pp.2101–2109。數(shù)種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體利用病毒基因組衣殼化所需的最小包裝信號(也被稱作psi[Ψ]序列)。因此，本文使用的術(shù)語“包裝序列”、“包裝信號”、“psi”和符號“Ψ”被用來提及病毒顆粒形成期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA鏈衣殼化所需的非編碼序列。

在不同實施方案中，載體包含修飾的5’LTR和/或3’LTR。所述LTR的任一者或二者可以包含一種或多種修飾，包括但不限于，一處或多處缺失、插入或置換。通常對3’LTR進行修飾以通過使病毒復(fù)制缺陷，來改善慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性。本文使用的術(shù)語“復(fù)制缺陷”指不能夠完全有效復(fù)制以致于不能產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，復(fù)制缺陷型慢病毒子代)的病毒。術(shù)語“可復(fù)制(replication-competent)”指能夠復(fù)制以致于病毒的病毒復(fù)制能夠產(chǎn)生感染性病毒顆粒(例如，可復(fù)制的慢病毒子代)的野生型病毒或突變病毒。

“自失活”(SIN)載體指復(fù)制缺陷型載體，例如被稱作U3區(qū)的右側(cè)(3’)LTR增強子-啟動子區(qū)被修飾(例如，通過缺失或置換)以阻止除第一輪病毒復(fù)制之外的病毒轉(zhuǎn)錄的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體。這是因為，在病毒復(fù)制期間右側(cè)(3’)LTR U3區(qū)被用作左側(cè)(5’)LTR U3區(qū)的模板，因此在無U3增強子-啟動子的情況下不能形成病毒轉(zhuǎn)錄本。在本發(fā)明的又一實施方案中，對3’LTR進行修飾以使U5區(qū)被例如理想的聚(A)序列替換。應(yīng)當注意到，本發(fā)明也包括對LTR的修飾，如對3’LTR、5’LTR或者3’和5’LTR二者的修飾。

通過用異源啟動子替換5’LTR的U3區(qū)以在病毒顆粒產(chǎn)生期間驅(qū)動病毒基因組的轉(zhuǎn)錄來增強另外的安全性?？梢允褂玫漠愒磫幼拥膶嵗ǎ绮《驹澈锊《?0(SV40)(例如，早期或晚期)、巨細胞病毒(CMV)(例如，立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、Rous肉瘤病毒(RSV)和單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動子。典型的啟動子能夠以Tat獨立型方式驅(qū)動高水平的轉(zhuǎn)錄。該替換降低了重組以產(chǎn)生可復(fù)制的病毒的可能性，因為在病毒產(chǎn)生系統(tǒng)中不存在完整的U3序列。在某些實施方案中，異源啟動子在控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄方式方面具有另外的優(yōu)勢。例如，異源啟動子可以是可誘導(dǎo)的，使得僅當誘導(dǎo)因子存在時，發(fā)生病毒基因組的全部或部分轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)因子包括但不限于，一種或多種化合物或者培養(yǎng)宿主細胞的生理條件，如溫度或pH。

在一些實施方案中，病毒載體包含TAR元件。術(shù)語“TAR”指位于慢病毒(例如，HIV)LTR的R區(qū)的“反式激活反應(yīng)因子”遺傳元件。該元件與慢病毒反式激活因子(tat)遺傳元件相互作用以增強病毒復(fù)制。然而，在5’LTR的U3區(qū)被異源啟動子替換的實施方案中，該元件不是必需的。

“R區(qū)”指逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR內(nèi)的區(qū)域，其開始于加帽基團起點處(即，轉(zhuǎn)錄的起點)并結(jié)束于緊接PolyA序列段(tract)的起點之前。R區(qū)也被限定為側(cè)翼為U3和U5區(qū)。在反轉(zhuǎn)錄期間，R區(qū)在允許初期DNA從基因組的一端轉(zhuǎn)移至另一端中發(fā)揮作用。

本文使用的術(shù)語“FLAP元件”指這樣的核酸，其序列包含逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，HIV-1或HIV-2)的中央聚嘌呤序列段和中央終止序列(cPPT和CTS)。合適的FLAP元件描述于美國專利第6,682,907號和Zennou等人,2000,Cell,101:173。在HIV-1反轉(zhuǎn)錄期間，位于中央聚嘌呤序列段(cPPT)的正鏈DNA的中央起始和在中央終止序列(CTS)處的中央終止導(dǎo)致三鏈DNA結(jié)構(gòu)：HIV-1中央DNA瓣(DNA flap)的形成。雖然不希望被任何理論束縛，DNA瓣可以作為慢病毒基因組核輸入的順式作用決定子發(fā)揮作用和/或可以增加病毒的滴度。在具體實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體骨架在載體中目的異源基因的上游或下游包含一個或多個FLAP元件。例如，在具體實施方案中，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒包含F(xiàn)LAP元件。在一個實施方案中，本發(fā)明的載體包含分離自HIV-1的FLAP元件。

在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)移載體包含一個或多個輸出元件。術(shù)語“輸出元件”指順式作用轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，其調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄物從細胞的核至細胞胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運。RNA輸出元件的實例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)rev應(yīng)答元件(RRE)(參見例如，Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053；和Cullen等人,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)。通常，RNA輸出元件置于基因的3’UTR內(nèi)，并且可以作為一個或多個拷貝插入。

在具體實施方案中，通過將轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件、高效的聚腺苷酸化位點以及任選地轉(zhuǎn)錄終止信號引入載體來增加病毒載體中異源序列的表達。各種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可以在蛋白水平增加異源核酸的表達，例如，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(HPRE)(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864)等(Liu等人,1995,Genes Dev.,9:1766)。在具體實施方案中，本發(fā)明的載體包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。

在具體實施方案中，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含諸如WPRE或HPRE的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，因為在一些情況下，這些元件增加了細胞轉(zhuǎn)化的風險和/或不會大幅度或顯著增加mRNA轉(zhuǎn)錄本的量或者增加mRNA的穩(wěn)定性。因此，在一些實施方案中，作為添加的安全度量，本發(fā)明的載體缺乏或者不包含WPRE或HPRE。

引導(dǎo)異源核酸轉(zhuǎn)錄本的有效終止和聚腺苷酸化的元件增加了異源基因的表達。轉(zhuǎn)錄終止信號通常存在于聚腺苷酸化信號的下游。在具體實施方案中，載體在編碼待表達多肽的多核苷酸的3’處包含聚腺苷酸化序列。本文使用的術(shù)語“polyA位點”或“polyA序列”表示通過RNA聚合酶II引導(dǎo)初期RNA轉(zhuǎn)錄本終止和聚腺苷酸化的DNA序列。通過將polyA尾巴添加至編碼序列的3’端，聚腺苷酸化序列可以促進mRNA的穩(wěn)定性，并且因此有助于翻譯效率的提高。重組轉(zhuǎn)錄本的高效聚腺苷酸化是所希望的，因為缺乏polyA尾巴的轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定且被快速降解?？梢杂糜诒景l(fā)明的載體中的polyA信號的示例性實例包括理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)、牛生長激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)或者本領(lǐng)域已知的其它合適的異源或內(nèi)源polyA序列。

在不同實施方案中，本發(fā)明的載體包含與編碼工程化的TCR或CAR多肽的多核苷酸可操作地連接的啟動子。載體可以含有一個或多個LTR，其中任一LTR包含一種或多種修飾，如一個或多個核苷酸置換、添加或缺失。載體還可以包含增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的多種輔助元件之一(例如，cPPT/FLAP)、病毒包裝信號(例如，Psi(Ψ)包裝信號、RRE)和/或增加治療性基因表達的其它元件(例如，poly(A)序列)，并且可以任選地包含WPRE或HPRE。技術(shù)人員將理解，許多其它不同的實施方案可以改變自本發(fā)明的既有實施方案。

“宿主細胞”包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸在體內(nèi)、離體或者在體外轉(zhuǎn)染、感染或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。宿主細胞可以包括包裝細胞、生產(chǎn)細胞和用病毒載體感染的細胞。在具體實施方案中，向需要治療的對象施用用本發(fā)明的病毒載體感染的宿主細胞。在某些實施方案中，術(shù)語“靶細胞”可與宿主細胞互換使用，并且指期望的細胞類型的轉(zhuǎn)染的、感染的或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。在優(yōu)選實施方案中，靶細胞是T細胞。

大規(guī)模病毒顆粒的產(chǎn)生通常是達到合理的病毒滴度所必需的。通過將轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染至包含病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的包裝細胞系中而產(chǎn)生病毒顆粒，所述病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或者其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。

本文使用的術(shù)語“包裝載體”指缺乏包裝信號，并包含編碼一種、兩種、三種、四種或者更多種病毒結(jié)構(gòu)基因和/或輔助基因的多核苷酸的表達載體或病毒載體。通常，包裝載體包含于包裝細胞中，并經(jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染被引入細胞。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知?？山?jīng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染將本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒轉(zhuǎn)移載體引入包裝細胞系，以產(chǎn)生生產(chǎn)細胞或細胞系?？梢酝ㄟ^標準方法將本發(fā)明的包裝載體引入人細胞或細胞系，所述標準方法包括，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。在一些實施方案中，將包裝載體與顯性選擇標志物基因一同引入細胞，隨后在合適的藥物存在的情況下進行選擇，并分離克隆，所述顯性選擇標記物如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素(blastocidin)、zeocin、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA?？梢岳缤ㄟ^IRES或自切割病毒肽將選擇標志物基因與由包裝載體編碼的基因物理連接。

病毒包膜蛋白(env)決定了最終可被由細胞系產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞的范圍。在慢病毒如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情況下，env蛋白包括gp41和gp120。優(yōu)選地，由本發(fā)明的包裝細胞表達的病毒env蛋白在與病毒gag和pol基因不同的載體上編碼，正如之前所描述的。

可用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的env基因的示例性實例包括但不限于：MLV包膜，10A1包膜，BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉病毒、仙臺病毒、FPV(雞瘟病毒)和流感病毒的包膜。類似地，可以使用編碼來自RNA病毒(例如，小RNA病毒科、杯狀病毒科(Coronaviridae)、星狀病毒科、披膜病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、副粘液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科、布尼亞病毒科、沙粒病毒科、呼腸孤病毒科、雙RNA病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒家族)包膜以及來自DNA病毒(嗜肝DNA病毒科、圓環(huán)病毒科、小DNA病毒科、乳頭多瘤空泡病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科(Poxyiridae)以及虹彩病毒科的家族)包膜的基因。代表性的實例包括：FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病毒、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10以及EIAV。

在其它實施方案中，用于假型包裝(pseudotyping)本發(fā)明的病毒的包膜蛋白包括但不限于任何下述病毒：A型流感病毒(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感病毒))、B型流感病毒、C型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克病毒組的任何病毒、腸道腺病毒、細小病毒、登革熱病毒、猴痘病毒、單股負鏈病毒、狂犬病毒屬(如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文黑基病毒、歐洲蝙蝠病毒1型&2型以及澳大利亞蝙蝠病毒)、暫時熱病毒屬、水泡病毒屬、水泡性口炎病毒(VSV)、皰疹病毒(如單純皰疹病毒類型1和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人皰疹病毒(HHV)、人皰疹病毒6型和8型)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乳頭狀瘤病毒、鼠γ皰疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞相關(guān)出血熱病毒(Sabia-associated hemorrhagic fever virus)、委內(nèi)瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬丘波病毒)、淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、引起腎綜合征出血熱的病毒、裂谷熱病毒)、絲狀病毒科(線狀病毒)(包括埃博拉出血熱病毒和馬爾堡出血熱病毒)、黃病毒科(包括卡薩諾爾森林病病毒、鄂木斯克出血熱病毒、引起蜱傳腦炎的病毒)和副粘液病毒科(如亨德拉病毒和立百病毒)、大天花和小天花(天花)、甲病毒(如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒)、SARS相關(guān)的冠狀病毒(SARS-CoV)、西尼羅病毒、引起任何腦炎的病毒。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G糖蛋白假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細胞。

本文使用的術(shù)語“假型(pseudotype)”或“假型包裝(pseudotyping)”指病毒包膜蛋白已被具有更優(yōu)特征的其它病毒的包膜蛋白替代的病毒。例如，可用水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白對HIV進行假型，這允許HIV感染更廣范圍的細胞，因為HIV包膜蛋白(由env基因編碼)通常使病毒靶向CD4+遞呈細胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用VSV-G對慢病毒包膜蛋白進行假型。在一個實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生用VSV-G包膜糖蛋白進行假型包裝的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)的包裝細胞。

本文使用的術(shù)語“包裝細胞系”用于指這樣的細胞系：其不包含包裝信號，但是穩(wěn)定或者瞬時表達病毒顆粒正確包裝所必需的病毒結(jié)構(gòu)蛋白和復(fù)制酶(例如gag、pol和env)?？蓪⑷魏魏线m的細胞系用于制備本發(fā)明的包裝細胞。通常，細胞為哺乳動物細胞。在具體實施方案中，用于產(chǎn)生包裝細胞系的細胞是人細胞?？梢允褂玫暮线m的細胞系包括，例如，CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞以及211A細胞。在優(yōu)選實施方案中，包裝細胞為293細胞、293T細胞或者A549細胞。

本文使用的術(shù)語“生產(chǎn)細胞系”指能夠產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的細胞系，包括包裝細胞系和包含包裝信號的轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建體。感染性病毒顆粒和病毒儲液的產(chǎn)生可以利用常規(guī)技術(shù)進行。制備病毒儲液的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113闡明?？梢岳贸Ｒ?guī)技術(shù)從包裝細胞中收集感染性病毒顆粒。例如，如本領(lǐng)域所知的，可以通過細胞裂解或者收集細胞培養(yǎng)物的上清液來收集感染性顆粒。任選地，如果需要，可將收集的病毒顆粒進行純化。合適的純化技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。

使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，通過病毒感染而非通過轉(zhuǎn)染遞送基因或其它多核苷酸序列被稱為“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在一個實施方案中，通過感染和原病毒整合將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進細胞。在某些實施方案中，如果靶細胞(例如T細胞)包含使用病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過感染遞送至細胞的基因或其它多核苷酸序列，則其被“轉(zhuǎn)導(dǎo)”。在具體實施方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在其細胞基因組中包含通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體遞送的一種或多種基因或者其它多核苷酸序列。

在具體實施方案中，向?qū)ο笫┯糜帽磉_一種或多種多肽的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細胞，以治療和/或預(yù)防B細胞惡性腫瘤。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案可被使用的涉及病毒載體在基因療法中的應(yīng)用的其它方法可見于，例如Kay,M.A.(1997)Chest 111(6Supp.):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等人(1999)Liver 19:265-74；Oka,K.等人(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.and Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；以及Lee,H.C.等人(2000)Nature 408:483-8。

H.組合物和制劑

本文所考慮的組合物可以包含如本文所考慮的一種或多種多肽、多核苷酸、包含一種或多種多肽、多核苷酸的載體以及T細胞組合物。組合物包括但不限于藥物組合物。“藥物組合物”指在藥學可接受的或生理學可接受的溶液中配制的組合物，其用于向細胞或動物單獨施用或者與一種或多種其它治療形式組合施用。也將理解，如果需要，可將本發(fā)明的組合物也與其它物質(zhì)組合施用，所述其它物質(zhì)如例如細胞因子、生長因子、激素、小分子、化學治療劑、前藥、藥物、抗體或其它各種藥學活性劑。對于也可包含于組合物中的其它組分幾乎無限制，條件是另外的組分未不利地影響組合物提供預(yù)期治療的能力。

短語“藥學可接受的”在本文用來指這樣的化合物、材料、組合物和/或劑型：在合理的醫(yī)學判斷的范圍內(nèi)，其適于與人和動物的組織接觸使用而無過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或者其它問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風險比相對應(yīng)。

如本文所使用的，“藥學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限于已經(jīng)美國食品和藥品管理局批準為可接受用于人或家養(yǎng)動物的任何佐劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、等張劑、溶劑、表面活性劑或者乳化劑。示例性的藥學可接受的載體包括但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物和植物油脂、石蠟、硅酮、膨潤土、硅酸、氧化鋅；油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，如丙二醇；多元醇，如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等張鹽水；林格氏液；乙醇；磷酸鹽緩沖液；以及藥學制劑中采用的任何其它相容的物質(zhì)。

在具體實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一定量的由本文所考慮的方法制備的修飾的T細胞。通常規(guī)定，包含由本文所考慮的方法制備的T細胞的藥物組合物可以以10²至10¹⁰個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選10⁵至10⁶個細胞/kg體重的劑量，包括那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值的劑量施用。細胞數(shù)將取決于組合物預(yù)期的最終用途以及其內(nèi)將包括的細胞類型。對于本文提供的用途，細胞通常是升或更少的體積，可以是500mL或更少，甚至是250mL或100mL或者更少。因此期望的細胞的密度通常大于10⁶個細胞/ml，以及通常大于10⁷個細胞/ml，通常為10⁸個細胞/ml或更大?？梢詫⑴R床相關(guān)數(shù)目的免疫細胞分配成多次輸注，所述多次輸注累積等于或超過10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²個細胞。所述細胞相對于經(jīng)歷療法的患者可以是同種異體的、同基因的、異基因的或自體同源的。若需要，治療還可以包括施用如本文所描述的有絲分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、細胞因子和/或趨化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增強輸注的T細胞的移植和功能。

通常，包含如本文所述活化或擴增的細胞的組合物可以用于治療和預(yù)防在免疫受損的個體中發(fā)生的疾病。具體而言，將包含通過本文所考慮的方法制備的修飾T細胞的組合物用于癌癥的治療。本發(fā)明的修飾的T細胞可以單獨施用，或者可以作為與載體、稀釋劑、賦形劑和/或與其它組分(如IL-2、IL-7和/或IL-15)或其它細胞因子或細胞群組合的藥物組合物施用。在具體實施方案中，本文所考慮的藥物組合物包含一定量的與一種或多種藥學或生理學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合的遺傳修飾的T細胞。

包含本文所考慮的修飾的T細胞的藥物組合物還可以包含緩沖劑，如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；以及防腐劑。優(yōu)選地，將本發(fā)明的組合物配制為腸胃外施用，例如血管內(nèi)(靜脈內(nèi)或動脈內(nèi))施用、腹膜內(nèi)施用或肌肉內(nèi)施用。

在一個實施方案中，靜脈內(nèi)施用組合物。

液體藥物組合物，無論其為溶液、懸液或其它類似形式，均可以包含下述中的一種或多種：DMSO，無菌稀釋劑，如用于注射的水、鹽溶液(優(yōu)選生理鹽水)、林格氏液、等張氯化鈉、固定油(如可作為溶劑或懸浮介質(zhì)的合成的單酸甘油酯或甘油二酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張度的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。

在具體實施方案中，將細胞冷凍于不溶的低溫介質(zhì)，50％plasmalyte和50％Cryostor 10；50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO)或Cryostor 10中。

可以將腸胃外制備物包封在玻璃或塑料袋、安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選是無菌的。

在具體實施方案中，本文所考慮的組合物包含單獨地或與一種或多種治療劑組合的有效量的擴增的修飾的T細胞組合物。因此，T細胞組合物可以單獨施用或者與其它已知的癌癥療法組合施用，所述其它已知的癌癥療法如放療、化療、移植、免疫療法、激素療法、光動力療法等。還可將組合物與抗生素組合施用。在本領(lǐng)域，可以接受此類治療劑作為如本文所述的具體疾病狀態(tài)(如具體的癌癥)的標準療法。考慮的示例性的治療劑包括細胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、治療性抗體或者其它活性劑和輔助劑。

在某些實施方案中，可將包含本文所考慮的T細胞的組合物與任何數(shù)目的化療劑聯(lián)合施用?；焺┑氖纠詫嵗ǎ簾N化劑，如噻替哌和環(huán)磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烴基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮雜環(huán)丙烷(aziridine)，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和trimethylolomelamine resume；氮芥類(nitrogen mustards),如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼氮芥、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司??；抗生素，如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、安曲霉素、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c(cactinomycin)、卡奇霉素、carabicin、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、放線菌素d(dactinomycin)、柔紅霉素、地拖比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲佐菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，如二甲葉酸、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素，如卡普睪酮、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺類，如氨魯米特、米托坦、曲洛斯坦；葉酸補充物，如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依達曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；硝氨丙吖啶；噴司他??；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸；2-ethylhydrazide；丙卡巴肼；雷佐生(razoxane)；西左喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2、2’,2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫衫烷，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)和多西紫衫醇(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer、Antony、France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；視黃酸衍生物，如Targretin^TM(蓓薩羅丁)、Panretin^TM(阿利維a酸)；ONTAK^TM(地尼白介素-2(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱；以及上述任一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包含調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥物，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑類、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮和托瑞米芬(法樂通)；以及抗雄激素，如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及以上任一種的藥學可接受的鹽、酸或衍生物。

可將多種其它治療劑與本文所述的組合物聯(lián)合使用。在一個實施方案中，將包含T細胞的組合物與抗炎劑一同施用?？寡讋┗蚩寡姿幇ǖ幌抻冢侯惞檀己吞瞧べ|(zhì)激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)；非甾類抗炎藥(NSAID)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、來氟米特、抗TNF藥物、環(huán)磷酰胺以及麥考酚酯。

其它示例性NSAID選自布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑(如(羅非昔布)和(塞來考昔))以及唾液酸化劑(sialylate)。示例性的鎮(zhèn)痛藥選自醋氨酚、羥考酮、曲馬朵(tramadol)或鹽酸丙氧吩(proporxyphene hydrochloride)。示例性的糖皮質(zhì)激素選自：可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、潑尼松龍或者潑尼松。示例性的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括針對細胞表面標志物(例如，CD4、CD5等)的分子，細胞因子抑制劑如TNF拮抗劑(例如依那西普阿達木單抗和英夫利昔單抗)，趨化因子抑制劑和粘附分子抑制劑。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑包括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性的DMARD包括咪唑硫嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、Gold(口服(金諾芬)和肌肉內(nèi)施用)以及米諾環(huán)素。

適于與本文所考慮的CAR修飾的T細胞組合的治療性抗體的示例性實例包括但不限于：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗、阿麥妥昔(amatuximab)、anatumomab、阿西莫單抗、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗、貝伐單抗、比伐單抗(bivatuzumab)、blinatumomab、本妥昔單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他土珠、西妥木單抗(cixutumumab)、clivatuzumab、可那木單抗(conatumumab)、達雷木單抗(daratumumab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、杜昔妥單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達妥珠單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠(etaracizumab)、farietuzumab、ficlatuzumab、figitumumab、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達妥昔單抗(indatuximab)、奧英妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、lorvotuzumab、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉圖珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、moxetumomab、納那妥單抗(narnatumab)、那妥莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、諾非單抗(nofetumomab)、ocaratuzumab、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉珠單抗(olaratumab)、奧納珠單抗(onartuzumab)、oportuzumab、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、巴薩妥珠單抗(parsatuzumab)、帕曲土單抗(patritumab)、pemtumomab、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷得妥單抗(radretumab)、rilotumumab、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、simtuzumab、索利托單抗(solitomab)、他珠單抗(tacatuzumab)、taplitumomab、替妥莫單抗(tenatumomab)、替妥木單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西莫白介素單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、CC49以及3F8。

在某些實施方案中，將本文所述的組合物與細胞因子聯(lián)合施用。本文使用的“細胞因子”意為這樣的蛋白的通用術(shù)語：其由一種細胞群釋放，作為細胞間的介質(zhì)作用于另一細胞。此類細胞因子的實例為淋巴因子、單核因子、趨化因子(如RANTES、MIP1a)和常規(guī)的多肽類激素。所述細胞因子包括：生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原(prorelaxin)；糖蛋白類激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝細胞生長因子(hepatic growth factor)；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和-β；繆勒管抑制物質(zhì)；鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，如NGF-β；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；紅細胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干擾素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21；腫瘤壞死因子如TNFα或TNF-β；以及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。本文使用的術(shù)語細胞因子包括來自天然來源或者來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白，以及天然序列的細胞因子的生物活性等同物。

I.靶細胞和抗原

本發(fā)明部分考慮重定向至靶細胞(例如，腫瘤細胞或癌細胞)并包含工程化T細胞受體或CAR的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞的細胞制備平臺，所述工程化T細胞受體或CAR具有與細胞上的靶抗原結(jié)合的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。癌細胞也可通過血液和淋巴系統(tǒng)擴散至身體的其它部分。存在幾種主要類型的癌癥。惡性上皮腫瘤(Carcinoma)是開始于皮膚或者襯于或覆蓋內(nèi)臟器官的組織的癌癥。肉瘤是開始于骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管或者其它結(jié)締組織或支持性組織的癌癥。白血病是開始于造血組織(如骨髓)，并引起大量異常的血細胞產(chǎn)生并進入血液的癌癥。淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤是開始于免疫系統(tǒng)的細胞的癌癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥是開始于腦和脊髓的組織的癌癥。

在一個實施方案中，靶細胞表達在其它正常(期望的)細胞表面未大量存在的抗原，例如靶抗原。在一個實施方案中，靶細胞為胰腺實質(zhì)細胞、胰管細胞、肝細胞(hepatic cell)、心肌細胞、骨骼肌細胞、成骨細胞、骨骼肌成肌細胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細胞、色素細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、脂肪細胞(fat cell)、骨細胞、軟骨細胞、胰島細胞、CNS細胞、PNS細胞、肝細胞(liver cell)、脂肪細胞(adipose cell)、腎細胞、肺細胞、皮膚細胞、卵巢細胞、卵泡細胞、上皮細胞、免疫細胞或者內(nèi)皮細胞。

在某些實施方案中，靶細胞是下述組織的一部分：胰腺組織、神經(jīng)組織、心臟組織、骨髓、肌肉組織、骨組織、皮膚組織、肝組織、毛囊、血管組織、脂肪組織、肺組織以及腎組織。

在具體實施方案中，靶細胞是腫瘤細胞。在另一具體實施方案中，靶細胞是癌細胞，如患有癌癥的患者中的細胞?？捎帽竟_的方法殺死的示例性的細胞包括下述腫瘤的細胞：液體瘤，如白血病，包括急性白血病(如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病以及成髓細胞白血病、早幼粒細胞白血病、粒單核細胞白血病、單核細胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(如慢性髓細胞(粒細胞)白血病和慢性淋巴細胞白血病)；真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈疾病)。

在另一實施方案中，細胞為實體瘤細胞，所述實體瘤如肉瘤和惡性上皮腫瘤(carcinomas)、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌(例如胰腺、結(jié)腸、卵巢、肺、乳腺、胃、前列腺、宮頸或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌(papillary adenocarcinomas)、髓樣癌、支氣管原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸瘤、膀胱癌、CNS腫瘤(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤)。

在一個實施方案中，癌癥選自：如權(quán)利要求所述的方法1，其中所述癌癥選自：維爾姆斯瘤、尤文肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、黑素瘤、皮膚癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、肺癌、膽管癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺髓樣癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌。

在一個實施方案中，靶細胞為肝臟、胰腺、肺、乳腺、膀胱、腦、骨、甲狀腺、腎、皮膚和造血系統(tǒng)的惡性細胞。在另一實施方案中，靶細胞為肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、甲狀腺癌、腎癌、皮膚癌或者血液癌癥(hematological cancer)中的細胞。

在一個實施方案中，靶抗原為下述的表位：α葉酸受體、5T4、α_vβ₆整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包括ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎兒型AchR、FRα、GD2、GD3、’磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、λ、Lewis-Y、κ、間皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配體、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、生存素、TAG72、TEM或者VEGFR2。

J.治療方法

通過本文所考慮的方法制備的修飾的T細胞提供改善的過繼免疫療法，用于治療多種病況，所述病況包括但不限于癌癥、感染性疾病、自身免疫病、炎癥性疾病和免疫缺陷。在具體實施方案中，通過用本文所考慮的工程化的TCR或CAR遺傳修飾初始T細胞，使初始T細胞的特異性重定向至腫瘤細胞或癌癥細胞。

在一個實施方案中，本發(fā)明包括一種類型的細胞療法，其中對T細胞進行修飾，以表達靶向表達靶抗原的癌細胞的工程化的TCR或CAR，以及將修飾的T細胞輸注進需要的接受者中。輸注的細胞能夠殺死接受者中的腫瘤細胞。與抗體療法不同，工程化的TCR或CAR修飾的T細胞能夠在體內(nèi)復(fù)制，從而有助于可以導(dǎo)致持續(xù)的癌癥治療的長期持續(xù)性。

在一個實施方案中，本發(fā)明的工程化的TCR和CAR T細胞可以經(jīng)歷穩(wěn)健的體內(nèi)T細胞擴增，并且能夠堅持延長的時間。在另一實施方案中，本發(fā)明的工程化的TCR或CAR T細胞發(fā)展為能夠再活化以抑制任何其它腫瘤的形成或生長的特異性記憶T細胞。

在具體實施方案中，將包含用載體進行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞的組合物用于實體瘤或?qū)嶓w癌的治療，所述載體包含與編碼CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述實體瘤或?qū)嶓w癌包括但不限于：肝癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腦癌、骨癌、甲狀腺癌、腎癌或者皮膚癌。

在具體實施方案中，將包含用載體進行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞的組合物用于多種癌癥包括但不限于胰腺癌、膀胱癌和肺癌的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述工程化的TCR或CAR包含與PSCA或MUC1的表位結(jié)合的抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在具體實施方案中，將包含用載體進行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞的組合物用于液體瘤的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述液體瘤包括但不限于白血病，包括急性白血病(例如ALL、AML以及成髓細胞白血病、早幼粒細胞白血病、粒單核細胞白血病、單核細胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(例如CLL、SLL、CML、HCL)；真性紅細胞增多癥、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性巨球蛋白血癥以及重鏈疾病。

在具體實施方案中，將包含用載體進行遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞的組合物用于B細胞惡性腫瘤的治療，所述載體包含與編碼工程化的TCR或CAR的多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述B細胞惡性腫瘤包括但不限于多發(fā)性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)。

多發(fā)性骨髓瘤是B細胞的成熟漿細胞的惡性腫瘤，其形態(tài)學特征為這些類型的細胞的單克隆的致瘤性轉(zhuǎn)化。這些漿細胞在BM中增殖，并且可能侵襲鄰近的骨，以及有時侵襲血液。多發(fā)性骨髓瘤的變體形式包括：明顯的多發(fā)性骨髓瘤、冒煙型多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞白血病、非分泌型骨髓瘤、IgD骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、骨孤立性漿細胞瘤和髓外漿細胞瘤(參見，例如Braunwald等人(eds),Harrison’s Principles of Internal Medicine，第15版(McGraw-Hill 2001))。

非霍奇金淋巴瘤包含一大組淋巴細胞(白細胞)癌。非霍奇金淋巴瘤可以發(fā)生于任何年齡，并且通常具有淋巴結(jié)大于正常淋巴結(jié)、發(fā)熱和體重減輕的特點。存在多種不同類型的非霍奇金淋巴瘤。例如，非霍奇金淋巴瘤可以分為侵略型(生長快速)和惰性型(生長緩慢)。盡管非霍奇金淋巴瘤可以來源于B細胞和T細胞，但是本文使用的術(shù)語“非霍奇金淋巴瘤”與“B細胞非霍奇金淋巴瘤”可互換使用。B細胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)包括：伯基特淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞淋巴瘤以及套細胞淋巴瘤。發(fā)生于骨髓或干細胞移植之后的淋巴瘤通常為B細胞非霍奇金淋巴瘤。

慢性淋巴細胞白血病(CLL)為引起未成熟的白細胞(稱為B淋巴細胞或B細胞)緩慢增加的惰性(生長緩慢)癌癥。癌細胞經(jīng)血液和骨髓擴散，并且也可影響淋巴結(jié)和其它器官，如肝臟和脾臟。CLL最終引起骨髓衰竭。有時，在疾病晚期，該疾病被稱為小淋巴細胞淋巴瘤。

在具體實施方案中，提供方法，所述方法包括將治療有效量的本文所考慮的修飾的T細胞或者包含本文所考慮的修飾的T細胞的組合物，單獨或者與一種或多種治療劑組合施用于需要的患者。在某些實施方案中，將本發(fā)明的細胞用于治療處于發(fā)展為癌癥的風險的患者。因此，本發(fā)明提供治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括向需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的修飾的T細胞。

在一個實施方案中，治療需要的對象中的癌癥的方法包括施用有效量(例如治療有效量)的組合物，所述組合物包含本文所考慮的遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞。施用的量和頻率將由諸如患者的情況以及患者疾病的類型和嚴重性的因素決定，盡管適當?shù)膭┝靠捎膳R床試驗確定。

在一個實施方案中，向?qū)ο笫┯玫慕M合物中的修飾的T細胞的數(shù)量為至少0.1x107個修飾的T細胞/m2、至少0.5x107個修飾的T細胞/m2、至少1x107個修飾的T細胞/m2、至少5x107個修飾的T細胞/m2、至少0.1x108個修飾的T細胞/m2、至少0.5x108個修飾的T細胞/m2、至少1x108個修飾的T細胞/m2、至少5x108個修飾的T細胞/m2或者至少1x109個修飾的T細胞/m2或者任意中間數(shù)目的修飾的T細胞。

向?qū)ο笫┯玫男揎椀腡細胞數(shù)通常只是向?qū)ο笫┯玫目偧毎麛?shù)的子集。在具體實施方案中，向?qū)ο笫┯弥辽?.1x107個總T細胞、至少0.5x107個總T細胞、至少1x107個總T細胞、至少5x107個總T細胞、至少0.1x108個總T細胞、至少0.5x108個總T細胞、至少1x108個總T細胞、至少5x108個總T細胞、至少0.1x109個總T細胞、至少0.5x109個總T細胞、至少1x109個總T細胞、至少5x109個總T細胞或者至少0.1x1010個總T細胞或者任意中間數(shù)目的T細胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可能需要多次施用本發(fā)明的組合物以實現(xiàn)期望的療法。例如可以在1周、2周、3周、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、1年、2年、5年、10年或更長時間的時間跨度內(nèi)施用組合物1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或者更多次。

在某些實施方案中，下述是可取的：向?qū)ο笫┯没罨腡細胞，然后隨后再次抽血(或者實施血漿分離置換法)，根據(jù)本發(fā)明活化由此得到的T細胞，以及使患者再輸注這些活化并擴增的T細胞?？梢悦扛魩字芏啻螌嵤┰撨^程。在某些實施方案中，可以使來自10cc至400cc血液抽取物的T細胞活化。在某些實施方案中，使來自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、100cc、150cc、200cc、250cc、300cc、350cc或者400cc或者更多血液抽取物的T細胞活化。未受理論束縛，可將該多次抽血/多次再輸注方案用于選出某些T細胞群。

可以以任何方便的方式進行本文所考慮的組合物的施用，包括通過氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或者移植的方式。在優(yōu)選實施方案中，腸胃外施用組合物。本文使用的短語“腸胃外施用(parenteral administration)”和“腸胃外施用(administered parenterally)”指不同于腸內(nèi)和局部施用之外的施用模式，通常通過注射施用，并且包括但不限于：血管內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、囊內(nèi)注射、眶內(nèi)注射、瘤內(nèi)注射、心臟內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)氣管注射、皮下注射、表皮下注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射、囊下注射、蛛網(wǎng)膜下注射、脊柱內(nèi)注射和胸骨內(nèi)注射以及輸注。在一個實施方案中，通過直接注射至腫瘤、淋巴結(jié)或者感染部位將本文所考慮的組合物施用于對象。

在一個實施方案中，向需要的對象施用有效量的組合物，以增加對象中針對癌癥的細胞免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以包括由能夠殺死感染的細胞的細胞毒性T細胞介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)性T細胞以及輔助性T細胞的應(yīng)答。也可誘導(dǎo)主要由能夠活化B細胞從而導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生的輔助性T細胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答?？蓪⒍喾N技術(shù)用于分析由本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型，其在本領(lǐng)域被充分描述：例如，由John E.Coligan,Ada M.Kruisbeek,David H.Margulies,Ethan M.Shevach,Warren Strober編輯的Current Protocols in Immunology，(2001)John Wiley&Sons,NY,N.Y。

在T細胞介導(dǎo)的死亡的情況下，CAR配體的結(jié)合起始CAR至T細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致多種T細胞信號通路的活化，所述信號通路誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生或者釋放能夠通過多種機制誘導(dǎo)靶細胞凋亡的蛋白。這些T細胞介導(dǎo)的機制包括(但不限于)胞內(nèi)細胞毒性顆粒由T細胞至靶細胞的轉(zhuǎn)移、T細胞分泌能夠直接誘導(dǎo)(或者經(jīng)其它殺傷效應(yīng)細胞的募集間接誘導(dǎo))靶細胞死亡的促炎性細胞因子以及T細胞表面上的死亡受體配體(例如FasL)的上調(diào)，所述死亡受體配體在與靶細胞上的其同源死亡受體(例如Fas)結(jié)合之后誘導(dǎo)靶細胞的凋亡。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供治療確診患有癌癥的對象的方法，所述方法包括從所述對象中移出免疫效應(yīng)細胞，用包含編碼如本文所考慮的工程化的TCR或CAR的核酸的載體對所述免疫效應(yīng)細胞進行遺傳修飾，從而產(chǎn)生修飾的免疫效應(yīng)細胞群，以及將所述修飾的免疫效應(yīng)細胞群施用于所述對象。在優(yōu)選實施方案中，免疫效應(yīng)細胞包含T細胞。

在某些實施方案中，本發(fā)明還提供刺激免疫效應(yīng)細胞介導(dǎo)的針對對象中的靶細胞群的免疫調(diào)節(jié)物應(yīng)答(immune modulator response)的方法，所述方法包括向?qū)ο笫┯帽磉_核酸構(gòu)建體的免疫效應(yīng)細胞群的步驟，所述核酸構(gòu)建體編碼工程化的TCR或CAR分子。

施用本文所述的細胞組合物的方法包括有效導(dǎo)致再引入離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞或者再引入遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞祖細胞的任何方法，所述離體遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞在對象中直接表達工程化的TCR或CAR，所述遺傳修飾的免疫效應(yīng)細胞祖細胞在被引入對象時分化為表達工程化的TCR或CAR的成熟的免疫效應(yīng)細胞。一種方法包括用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血T細胞，并使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞返回至所述對象。

將本說明書中引用的所有出版物、專利申請和授權(quán)專利通過引用并入本文，如同明確且單獨地指示將各單獨的出版物、專利申請或者授權(quán)專利通過引用并入。

盡管出于清楚理解的目的，通過示例和實例的方式一定程度上詳細地描述了上述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在不脫離所附的權(quán)利要求的精神或范圍的情況下，可對本發(fā)明作出某些改變和修改，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。僅通過示例性的方式且不通過限制性的方式提供下述實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地識別可被改變或修改以得到基本相類似的結(jié)果的多個非關(guān)鍵參數(shù)。

實施例

利用用嵌合抗原受體(CAR)工程化的自體同源T細胞進行的過繼性細胞療法(ACT)仍受到缺乏簡單且穩(wěn)健的制備方法的挑戰(zhàn)。由于活細胞培養(yǎng)的固有復(fù)雜性和患者之間的變化性，發(fā)展高效、可重復(fù)且可擴展的方法是重要的。而且，發(fā)展ACT的封閉系統(tǒng)處理在將ACT轉(zhuǎn)化為用于大量患者的標準治療中是重要的。

目前，既有的T細胞制備方法包括用于分離、活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增CAR T細胞的多個復(fù)雜步驟。相比之下，本發(fā)明的發(fā)明人使用小規(guī)模研究模型來發(fā)展簡單、穩(wěn)健、性質(zhì)良好、靈活、封閉系統(tǒng)的T細胞制備平臺，所述T細胞制備平臺被轉(zhuǎn)變?yōu)橛糜诠こ袒腃AR T細胞的大規(guī)模臨床cGMP制備方法。

所述制備在10天內(nèi)一致地實現(xiàn)平均值為6.75(+/-1.5)的群體倍增水平。平均轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是65.3％(+/-12.4％)。培養(yǎng)物的純度一致為>98％CD3細胞。表型上，T細胞表達與動物模型和臨床研究中的腫瘤消退相關(guān)的表面標志物。此外，工程化的CAR T細胞在體外和體內(nèi)均呈現(xiàn)對表達抗原靶標的細胞毒性。

實施例1

小規(guī)模制備平臺

建立了新的小規(guī)模制備平臺，其簡單、可靠且可復(fù)制。該制備平臺比既有方法簡單、更穩(wěn)健，且在CAR T細胞的活化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴增方面實施最少操作。此外，通過本文所考慮的方法制備的CAR T細胞產(chǎn)生可與通過既有方法產(chǎn)生的工程化的CAR T細胞治療劑相比較(即使不優(yōu)于)的CAR T細胞治療劑。

1.獲得PBMC

PBMC被用作用于小規(guī)模研究制備平臺的T細胞來源?？梢岳肍ICOLL^TM梯度和洗滌來人工分離來自全血抽取物的PBMC。在該實驗中，使用冷凍的PBMC。將PBMC的冷凍小瓶于37℃水浴中解凍。一旦解凍，將PBMC轉(zhuǎn)移至含有～20-30mL溫的TCGM培養(yǎng)基的50mL錐形管中，然后于175x g離心10分鐘。移除上清液，并且將細胞團在含250IU/mL IL-2的小體積TCGM中重懸。經(jīng)multisizer或血細胞計數(shù)器對等份的重懸細胞進行計數(shù)，并且測定活細胞數(shù)。

2.培養(yǎng)起始和活化

在第0天(D0)，將PBMC以1x10⁶個細胞/mL接種于T25培養(yǎng)瓶中總體積為10mL的TCGM(含有250IU/mL IL-2)中。通過向培養(yǎng)物添加5μL 100ng/μL的抗CD3抗體和5μL 100ng/μL的抗CD28抗體來活化T細胞。一旦建立PBMC培養(yǎng)物，就將它們在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中平躺孵育直到第1天(D1)，隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，或者如果隨后不對細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)的話，則直到第3天(D3)。

3.轉(zhuǎn)導(dǎo)

測定CAR T慢病毒載體的滴度。以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC(在D0接種的PBMC數(shù))對細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將病毒在TCGM+IL-2中稀釋至2mL體積或者培養(yǎng)體積的20％v/v。用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞，持續(xù)約48小時，直到第3天(D3)。

數(shù)次實驗確定，在活化細胞之后約20至24小時轉(zhuǎn)導(dǎo)最高效。在D0、D1和D2，用表達GFP的慢病毒以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，通過FACS分析分離表達GFP的細胞，以便測定被轉(zhuǎn)導(dǎo)的各種類型T細胞的百分數(shù)和轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的載體拷貝數(shù)(VCN)?；赥細胞標志物的表達，分析表達GFP的細胞。當在活化后20至24小時(D1)轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞時，鑒定更多表達GFP和T細胞標志物CD3、CD8或CD4的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。圖1。此外，VCN在活化后20至24小時(D1)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中較高(圖1)。

另外的實驗確定，使用可溶的CD3和CD28配體活化的T細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可與通過其它方法活化的T細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相比較。使用下述活化PBMC：(i)濃度為1μg/mL的板結(jié)合抗CD3和抗CD28抗體，持續(xù)20-24小時；(ii)濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體，持續(xù)20-24小時；以及使用珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體活化來自與PBMC同一來源的富集的淋巴細胞，使用1個T細胞比3個珠的比例的CD3/CD28免疫磁珠(Dynabead)，持續(xù)20-24小時?；罨?，用表達抗CD19的慢病毒以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC對細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。與其它方法相比，當用可溶的抗CD3和抗CD28抗體活化細胞時，鑒定更多表達抗CD19CAR和T細胞標志物CD3、CD8或CD4的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。圖2。此外，VCN在用可溶的抗CD3和抗CD28抗體活化的細胞中也較高(圖2)。

實驗還確定了，在細胞培養(yǎng)袋中的活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)可與在瓶中的轉(zhuǎn)導(dǎo)相比較。在D0，使用濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體活化PBMC，持續(xù)20-24小時。在活化之后，在D1，用表達κ_LC的慢病毒以3x10⁸TU/10⁶個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。當在細胞培養(yǎng)袋或瓶中活化和轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞時，表達κ_LC和T細胞標志物CD3、CD8或CD4的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的數(shù)目可比較(圖3)。

4.擴增

還測定了通過不同的方法活化的PBMC中的T細胞擴增。使用下述活化PBMC：(i)濃度為1μg/mL的板結(jié)合抗CD3和抗CD28，持續(xù)20-24小時；(ii)濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體，持續(xù)20-24小時；以及(iii)珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體，以3:1的珠:T細胞比例使用免疫磁珠，持續(xù)20-24小時。在活化之后，用表達抗CD19CAR的慢病毒以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。將活化且轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞培養(yǎng)擴增多至10天。通過三種方法活化的PBMC中的細胞擴增在擴增培養(yǎng)期期間是可比較的(圖4)。

經(jīng)歷本文所考慮的T細胞制備方法的來自多個供體的PBMC顯示可復(fù)制且穩(wěn)健的擴增、CAR細胞表面表達以及VCN。使用濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體將PBMC活化20-24小時。用表達抗CD19CAR的慢病毒以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的細胞。培養(yǎng)10天的來自多個供體的活化且轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞彼此之間以及與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照(UTD)之間顯示可比較的生長速率。圖5。圖5還顯示了在第10天，各擴增培養(yǎng)物中存在的淋巴細胞數(shù)。FACS分析確定，抗CD19的表達在產(chǎn)生自不同患者的細胞產(chǎn)物中是可比較的，標記的平均值為約61％，以及范圍為29％至80％(n＝5)。圖6。qPCR還表明，細胞產(chǎn)物中的VCN是可比較的(圖6)。

5.抗原特異性腫瘤清除

通過用可溶抗體活化的T細胞進行的抗原特異性腫瘤清除與使用其它方法活化的T細胞一樣好，或者優(yōu)于使用其它方法活化的T細胞。使用下述活化PBMC：(i)濃度為1μg/mL的板結(jié)合抗CD3和抗CD28抗體，持續(xù)20-24小時；(ii)濃度為50ng/mL的可溶的抗CD3和抗CD28抗體，持續(xù)20-24小時；以及(iii)珠結(jié)合的抗CD3和抗CD28抗體，以3:1的珠：T細胞比例使用免疫磁珠，持續(xù)20-24小時。在活化之后，用表達抗CD19CAR的慢病毒以1-2x10⁸TU/10⁶個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞。將活化且轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞培養(yǎng)擴增多至10天。將治療性的抗CD19CAR T細胞與表達CD19的Daudi細胞或不表達CD19的K562細胞共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)10天之后，使用可溶抗體活化的抗CD19CAR T細胞殺死Daudi細胞，與使用其它方法活化的抗CD19CAR T細胞一樣好，或者優(yōu)于使用其它方法活化的抗CD19CAR T細胞(圖7和圖8)。

6.小規(guī)模制備平臺

總體而言，小規(guī)模制備平臺用來發(fā)展10天的T細胞擴增方法：在D0，將PBMC以1x10⁶個細胞/mL的密度接種，并且使用50ng/mL抗CD3和抗CD28抗體活化約24小時；在D1，將活化的PBMC用2x10⁸TU/10⁶個細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)約24小時至48小時；在D3至D9，擴增轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞并重新接種以維持對數(shù)期的生長。該T細胞制備方法通常導(dǎo)致T細胞擴增100-600倍，這取決于供體。

前述實驗鑒定了用于將小規(guī)模研究方法轉(zhuǎn)為大規(guī)模臨床cGMP制備方法的重要元素。所述元素顯示于表1中。

表1.

7.平臺穩(wěn)健性

通過設(shè)計、制備并評價多種慢病毒CAR構(gòu)建體證明制備平臺的穩(wěn)健性。構(gòu)建體在使用的啟動子、scFV、+/-接頭、鉸鏈、跨膜區(qū)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域方面不同。(圖16)

如別處所描述的，在HEK 293T細胞中產(chǎn)生編碼CAR的慢病毒載體(LV)的上清液(例如，Naldini等人,1996；Dull等人,1998以及Zufferey等人,1998)。使293細胞瞬時轉(zhuǎn)染4種質(zhì)粒：編碼HIV gag-pol的質(zhì)粒、編碼VSV-G包膜蛋白的質(zhì)粒、編碼HIV rev蛋白的質(zhì)粒以及編碼CAR的慢病毒轉(zhuǎn)移載體，例如圖16。

如以上實施例1所述制備CAR T細胞。如通過群體倍增所測定的，各種CAR T細胞產(chǎn)物顯示可比較的生長速率(圖17A)；qPCR顯示，VCN在不同CAR T細胞中是可比較的，其中每個細胞大約1至4個拷貝(圖17B)；以及通過FACS顯示不同CAR構(gòu)建體的可比較的細胞表面表達；百分比標記范圍為約40％至60％，這取決于構(gòu)建體(圖17C)。

8.功能性CART藥品的產(chǎn)生

如以上實施例1所述制備表達抗BCMA的CAR T細胞。這些CAR T細胞顯示抗原特異性腫瘤清除。將表達抗BCMA的CAR T細胞與K562細胞或者被修飾以表達BCMA的K562細胞共培養(yǎng)4小時。用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記表達抗原的腫瘤細胞，并且通過FACS測量熒光。表達抗BCMA的CAR T細胞殺死表達BCMA的K562細胞(圖18A)并釋放IFN-γ(圖18B)(n＝3)。

實施例2

小規(guī)模研究平臺轉(zhuǎn)化為大規(guī)模臨床cGMP藥物制備平臺

小規(guī)模研究方法允許對CAR構(gòu)建體進行更高通量評價，以確保數(shù)據(jù)可與大規(guī)模cGMP藥物制備平臺相比較。該實施例提供來自利用大規(guī)模臨床cGMP藥物制備平臺進行的示例性實驗的數(shù)據(jù)。

1.小規(guī)模和大規(guī)模制備之間的比較

圖9顯示了小規(guī)模研究T細胞制備平臺和按比例增加的臨床cGMP藥物制備平臺的流程圖比較。使用實施例1中概述的程序制備CAR T細胞。對于大規(guī)模制備，例如圖10-12，如下所述制備CAR T細胞：

獲得.使用Spectra血漿分離置換法系統(tǒng)或等同物，通過白細胞去除術(shù)獲得細胞。用于制備方法的白細胞去除術(shù)產(chǎn)物的開始體積是約100mL至約200mL。對等份細胞進行計數(shù)，測定活力，低溫保藏，以及使用FACS分析對PBMC進行表征。

分離.在Cell5+自體血回收系統(tǒng)(Haemonetics)上，使用封閉系統(tǒng)FICOLL^TM梯度來分離PBMC。FICOLL^TM后，將棕黃層用CliniMACS緩沖液w/2％HABS洗滌，然后重懸于含250IU IU/mL IL-2的TCGM中。進行洗滌前和洗滌后的細胞計數(shù)，活力、以及PBMC的FACS分析。

低溫保藏.大規(guī)模制備方法的具體實施方案包括在分離之后以及在任何進一步的下游制備之前，低溫保藏PBMC。將PBMC在TCFM中低溫保藏，并在速率可控的冷凍儀中以每分鐘1°的速率在約-80℃至約-135℃溫度下的速率可控的冷凍儀中冷凍，并在液氮儲存罐的汽相中保藏。

第0天：培養(yǎng)起始/活化–袋，新鮮細胞.將在含250IU/mL IL-2的TCGM中的1x10⁸個PBMC以1x10⁶PBMC/mL的密度接種進100mLGMP細胞分化袋中。通過向培養(yǎng)物中添加50ng/mL抗CD3抗體和50ng/mL抗CD28抗體活化PBMC，并培養(yǎng)約24小時。

第0天：培養(yǎng)起始/活化–袋，冷凍細胞.大規(guī)模制備方法的具體實施方案包括使用冷凍的PBMC。將冷凍的PBMC在37℃水浴中解凍，并在含250IU/mL IL-2的TCGM中洗滌。將在含250IU/mL IL-2的TCGM中的1x10⁸個解凍的PBMC接種進100mLGMP細胞分化袋中。通過向培養(yǎng)物中添加50ng/mL抗CD3抗體和50ng/mL抗CD28抗體活化解凍的PBMC，并培養(yǎng)約24小時。

第0天：培養(yǎng)起始/活化–GREX生物反應(yīng)器.大規(guī)模制備方法的具體實施方案包括在GREX生物反應(yīng)器中制備T細胞。將在含250IU/mL IL-2的TCGM中的1x10⁸個PBMC接種進GREX-100的100mL TCGM中。通過向培養(yǎng)物中添加50ng/mL抗CD3抗體和50ng/mL抗CD28抗體活化PBMC，并培養(yǎng)約24小時。

第1天：轉(zhuǎn)導(dǎo).用1-2x10⁹TU的慢病毒/10⁸個PBMC轉(zhuǎn)導(dǎo)活化的細胞。將慢病毒在TCGM中稀釋至培養(yǎng)體積的20％。例如如果培養(yǎng)體積是100mL TCGM，則將病毒在TCGM中稀釋以使添加至培養(yǎng)物的最大體積為20mL。將細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)約48小時。

第3天至第10天：擴增.將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在含250IU/mL IL-2的TCGM中擴增5至8天。在一天或多天擴增中的每一天，任選地取等份的細胞，并且對細胞進行計數(shù)，測定活力，低溫保藏，以及使用FACS分析對PBMC進行表征。如果需要，將培養(yǎng)物以0.3x10⁶個PBMC/mL至0.5x10⁶個PBMC/mL的密度重新接種，以維持細胞在對數(shù)期的生長。對于基于細胞培養(yǎng)袋的制備，在第7天，任選地將細胞轉(zhuǎn)移至WAVE生物反應(yīng)器，直到第10天，以允許進一步擴增。在一個實施方案中，在第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天和/或第9天和/或第10天，進行細胞計數(shù)。在一個實施方案中，如果細胞在第7天不能達到靶擴增水平，則可以將它們轉(zhuǎn)移至WAVE生物反應(yīng)器，其中以2L/天灌注培養(yǎng)基，持續(xù)第8天和第9天以允許擴增增加。

對于基于GREX的制備，使細胞在GREX生物反應(yīng)器中持續(xù)培養(yǎng)整個擴增期。

第10天：回收和低溫保藏.在Cell5+自體血回收系統(tǒng)上回收并洗滌擴增的細胞。將細胞用2L 0.9％NaCl洗滌，然后用PlasmaLyte進行最后的洗滌。在回收前和回收后，進行細胞計數(shù)，活力以及FACS分析，以測定CAR T細胞的純度和同一性。任選地將回收的細胞在50％plasmalyte和50％Cryostor 10；50/40/10(XVIVO/HABS/DMSO)；或Cryostor 10中低溫保藏，以及在速率可控的冷凍儀中以每分鐘1°的速率在約-80℃至約-135℃的速率可控的冷凍儀中冷凍，并在液氮儲存罐的汽相中保藏。

2.小規(guī)模和大規(guī)模制備方法的最終細胞產(chǎn)物的細胞表型之間是可比較的

使用實施例1中所描述的小規(guī)模方法和實施例2中所描述的大規(guī)模方法制備CAR T細胞(以上)。將最終細胞產(chǎn)物進行針對CD4、CD8、CAR T構(gòu)建體、CD56和CD62L細胞表面標志物的表達的FACS分析，以測定最終產(chǎn)物的細胞組合物中的任何差異。在研究平臺和臨床規(guī)模平臺之間最終CAR T產(chǎn)物的表型中未觀察到顯著差異。對于兩個平臺之間的所有表面標志物，p≥0.20(n＝3)(圖13)。

3.PBMC分離&T細胞獲得的簡化細胞處理

本文所考慮的制備方法的主要優(yōu)點之一是實施封閉系統(tǒng)處理步驟。通過白細胞去除術(shù)獲得PBMC，以及使用Cell5+自體血回收系統(tǒng)(Haemonetics)對其進行分離和洗滌。Cell5+還用于回收和洗滌最終制備的CAR T細胞產(chǎn)物。

經(jīng)過多次實驗(n＝18)對最終的PBMC和CAR T產(chǎn)物進行表征，以證明原材料和最終產(chǎn)物的細胞組合物顯著一致的純度。圖14.封閉系統(tǒng)方法的利用簡化了制備并且使cGMP處理所需的設(shè)備最少。

4.制備方法的靈活性

為了解決患者之間的變化性，并確?？梢詫崿F(xiàn)所需劑量水平的CAR T細胞產(chǎn)物，將用于CAR T細胞擴增的多個設(shè)備進行比較以顯示由所考慮的制備方法提供的靈活性。如以上所述實施小規(guī)模(T25瓶)和大規(guī)模(GREX100、靜態(tài)細胞培養(yǎng)袋和WAVE生物反應(yīng)器)制備方法。由不同的制備方法制備的細胞在10天的培養(yǎng)期內(nèi)顯示出可比較的生長速率和擴增的細胞數(shù)。圖15A.FACS分析顯示CD3⁺/CAR+細胞的數(shù)量在制備方法之間是一致的。圖15B.此外，CD3⁺/CAR+細胞的VCN在所測試的各種制備方法中是可比較的。圖15B.這些結(jié)果表明，所考慮的T細胞制備方法是靈活的并且產(chǎn)生可比較的最終細胞產(chǎn)物。

一般而言，在下述權(quán)利要求中，所使用的術(shù)語不應(yīng)當被解釋為將權(quán)利要求限制于本說明書和權(quán)利要求中公開的具體實施方案，而應(yīng)當被解釋為包括所有可能的實施方案以及此類權(quán)利要求授予的等同物的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開的限制。

序列表

<110> 藍鳥生物公司

<120> 制備的改善方法

<130> BLBD-028/01WO

<150> US 61/984,558

<151> 2014-04-25

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 1

Asp Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 2

Thr Gly Glu Lys Pro

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 3

Gly Gly Arg Arg

1

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 5

Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 6

Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser

1 5 10 15

Leu Asp

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 7

Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 8

Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 9

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 柔性肽接頭

<400> 10

Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa is Gly or Ser

<400> 11

Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<400> 12

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽切割序列

<400> 13

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser

1 5