一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性cik細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫領(lǐng)域，具體涉及一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性 CIK細(xì)胞以及制備該高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來(lái)越受到重視。腫瘤免疫治療主要 包括腫瘤疫苗治療、細(xì)胞因子治療、過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤 疫苗是利用腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī) 體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和復(fù)發(fā)。用于抗腫瘤研究的細(xì)胞因子主要有干擾素 類、白細(xì)胞介素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-a、IL-2、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子為 多。過(guò)繼性細(xì)胞免疫包括淋巴細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì) 胞、DC-CIK等。單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的 安全性和有效性，如小分子表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆 抗體、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好 的療效。
[0003]目前用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的免疫活性細(xì)胞主要有腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（TIL)、 樹突狀細(xì)胞（DC)以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK)等。CIK細(xì)胞是一種殺傷力強(qiáng)的免疫 活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志為CD3+CD56+，與其他過(guò)繼性免疫治療細(xì)胞相比，具有 增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點(diǎn)。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細(xì)胞功能減 弱，因此，來(lái)源于腫瘤病人外周血制備的CIK細(xì)胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細(xì)胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞 以及制備該高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，CD3+、CD8+和 ⑶3+⑶56+細(xì)胞的比例高，并且對(duì)腫瘤治療效果優(yōu)異。
[0005] 上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞，通過(guò)如下步驟制備：（1)取 患者外周血，收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單個(gè)核細(xì)胞 部分離心，棄去上清液，獲得單個(gè)核細(xì)胞；（3)取單個(gè)核細(xì)胞按照I X 106/mL細(xì)胞，加入含 500~2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mLAphanalide K的完全培養(yǎng)基，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)； 其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10% FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；（4)步驟（3) 的細(xì)胞培養(yǎng)20~28小時(shí)后，加入50~1000ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500~2000IU/ mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為 13~21天，獲得CIK細(xì)胞。
[0007] 進(jìn)一步地，步驟（1)中所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：(a)患者外周 血中，加入1~1. 5倍體積的不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液或pH7. 2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其 中，細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI1640培養(yǎng)液和頂DM培養(yǎng)液；(b)將步驟（a)獲得的血液稀釋液 加入到淋巴細(xì)胞分離液的界面上；（c) 1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間 層，獲得單個(gè)核細(xì)胞。
[0008] 進(jìn)一步地，步驟（1)中所述收集外周血的單個(gè)核細(xì)胞部分的方法為：患者經(jīng)采用 血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟（2)中，離心的轉(zhuǎn)速為1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時(shí)間為7~ 10分鐘。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟（4)所述繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人 IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-I的 完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0011] 所述的Aphanalide K在制備高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0012] 所述的用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用。
[0013] 有益效果：
[0014] 本發(fā)明提供了一種用于腫瘤細(xì)胞免疫治療的高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞以及制備該 高細(xì)胞毒活性CIK細(xì)胞的方法，該CIK細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3 +⑶56+細(xì)胞 的比例高，并且對(duì)腫瘤治療效果優(yōu)異，可用于腫瘤的細(xì)胞免疫治療。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；
[0016] 圖2為外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)制備的CIK細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。以下實(shí)施例中，所用的原料或 試劑除特別說(shuō)明外，均為市售可得。所述患者指需要進(jìn)行CIK細(xì)胞免疫治療的患者，如癌癥 患者。另外，以下實(shí)施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10% (體積百分比）FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)液；冷凍保護(hù)劑是含10% (體積百分比）DMS0的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70% (體 積百分比）RPMI1640培養(yǎng)液和20% (體積百分比）FBS(胎牛血清）所構(gòu)成。Aphanalide K 自制，制備方法參見文南犬：Bioactive Terpenoids from the Fruits ofAphanamixis grandifolia，J. Nat. Prod.，2013, 76,1191-1195 ;經(jīng)鑒定確定為該文獻(xiàn)報(bào)道的 Aphanalide K，純度大于98 %。
[0018] 實(shí)施例1 :CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備和檢測(cè)
[0019] -、CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備
[0020] (1)取患者外周血30mL加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液（Invitrogen公司），充分 混勻。
[0021] (2)將步驟⑴獲得的倍比稀釋的外周血60mL，加入到30mL淋巴細(xì)胞分離液（上 海華精生物高科技有限公司）（比重L 077)的界面上（不要破壞界面），以2000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心20分鐘，取中間層一富含淋巴細(xì)胞的白膜層，加入完全培養(yǎng)基20mL。取少量細(xì)胞進(jìn)行 細(xì)胞計(jì)數(shù)及苔盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)染色，結(jié)果顯示，活細(xì)胞達(dá)99%。
[0022] (3)將步驟⑵獲得的含有完全培養(yǎng)基的白膜層，以1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘， 棄上清液，沉淀為單個(gè)核細(xì)胞。
[0023] (4)加入完全培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為I X 106/mL。
[0024] (5)按照 I X 106/mL 細(xì)胞，加入 γ-IFN(Peprotech 公司）和 Aphanalide K 使其濃 度分別為l〇〇〇IU/mL和100ng/mL，置37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中，開始誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0025] (6)步驟（5)的細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入500ng/mL抗人CD3單 克隆抗體（Biolegend 公司）和 1000IU/mL 重組人 IL-2(P印rotech 公司），置 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，從而獲得CIK細(xì)胞。CIK細(xì)胞鑒定方法：細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，⑶3+⑶56+雙陽(yáng)性標(biāo)志細(xì)胞數(shù)量升高，殺傷腫瘤細(xì)胞能力增強(qiáng)（非MHC限制性）。
[0026] 其中，單個(gè)核細(xì)胞中加入γ -IFN和Aphanalide K，經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后（誘導(dǎo)第1 天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活化透亮，折光性強(qiáng)。在單個(gè)核細(xì)胞中加入抗人CD3單克隆抗體和 重組人IL-2,經(jīng)培養(yǎng)24小時(shí)后（誘導(dǎo)第2天），光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞聚集，并且有很多小集 落開始形成，細(xì)胞明顯增大。
[0027] (7)誘導(dǎo)培養(yǎng)的第四天，細(xì)胞傳代。按照1份CIK細(xì)胞原液，加入3份含1000IU/ mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基。同時(shí)，取樣檢測(cè)CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)⑶3、 ⑶56、⑶4、⑶8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)CIK細(xì)胞殺傷Κ562腫瘤細(xì)胞活性。
[0028] (8)此后，每3天按照上述方法，傳代一次，并做相同的檢測(cè)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的第19天 終止培養(yǎng)。以上方法均在嚴(yán)格無(wú)菌環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。
[0029] 其中，在誘導(dǎo)第7天時(shí)，肉眼下即可觀察到白色斑點(diǎn)，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞集落 明顯增多、增大，大集落成黑團(tuán)，看不清細(xì)胞形態(tài)，周邊游離細(xì)胞飽滿折光性好，大小形態(tài)各 異。
[0030] 二、按照以上方法進(jìn)行誘導(dǎo)制備CIK細(xì)胞的相應(yīng)檢測(cè)結(jié)果
[0031] 1、檢測(cè)CIK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)
[0032] 檢測(cè)方法為：按I X IO6單個(gè)核細(xì)胞/孔，接種在24孔板內(nèi)，按照上述方法進(jìn)行誘導(dǎo) 制備CIK細(xì)胞和細(xì)胞換液，第7天開始換成25平方