一種誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞研究領(lǐng)域的細胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)，特別涉及一種誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知由神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系分化形成的神經(jīng)元是神經(jīng)生物學研究，例如神經(jīng)毒性研究和體外神經(jīng)元耐受嗎啡研究等常用的細胞模型[Constantinescu，JNeural Transm Suppl (2007) ]。SH-SY5Y是人來源的細胞系，在體外培養(yǎng)條件下可以無分化地不斷擴增。為了使SH-SY5Y細胞分化為神經(jīng)元，通常使用維甲酸(RA)進行誘導(dǎo)。然而，無論是單獨使用RA誘導(dǎo)或RA聯(lián)合其它化合物誘導(dǎo)，從SH-SY5Y細胞分化產(chǎn)生的神經(jīng)元細胞的比率都很低。單獨使用RA誘導(dǎo)只有約20%的SH-SY5Y細胞可以分化成神經(jīng)元[Preis, Cancer Res (1988) ] 0此外，單獨使用RA誘導(dǎo)需要較長的時間(平均7天)才能使SH-SY5Y細胞分化成神經(jīng)元。一些研究人員提出了一些改進方法，聯(lián)合使用一些化學品[例如除莠霉素A、12-0-十四酰佛波醇13乙酸鹽(TPA)、二丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)]或神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)可進一步提高RA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元細胞的分化比率。添加有B27 ( 一種人工合成的血清替代物)的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基可以增加RA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元的分化比率。然而在這些組合條件下，SH-SY5Y細胞的神經(jīng)元分化率以及分化時間仍不能令人滿意。此外，這些方法的成本較高。因此，有必要找到一種方法，提高SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化的分化比率，并降低其分化時間。
[0003]神經(jīng)干細胞可以從人腦組織中分離獲得，并且可以體外在補充有B27和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)以及表皮生長因子(EGF)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中長期體外擴增生長而不丟失其多向分化潛能[Sun, Molecular and Cellular Neuroscience (2008)]。研究證實神經(jīng)干細胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，如BDNF，NGF,⑶NF(神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子)，和NT-3(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3)，以及一些其它可溶性因子[Aumann，PLoS One (2013)]。因此，神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液含有神經(jīng)干細胞分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以及被降解的部分B27和分裂生長因子。有研究報道，神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液可以使人間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞樣細胞分化[Ma, Neurological Research (2011)]，表明神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液在促進其他細胞向神經(jīng)細胞分化過程中起著至關(guān)重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中從神經(jīng)母細胞瘤細胞分化形成神經(jīng)元細胞分化效率低、分化時間長的問題，本發(fā)明提供了一種分化效果大于80%、分化時間短的誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化的方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
[0006]—種誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化的方法，將神經(jīng)母細胞瘤細胞傳代培養(yǎng)，取25代和30代之間的神經(jīng)母細胞瘤細胞用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2-9天后，獲得神經(jīng)元細胞；
[0007]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液中加入維甲酸至ΙΟμΜ得到的；
[0008]所述神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液是通過以下步驟得到的:
[0009]用含有DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Β271:50、bFGF 20ng/mL, EGF 20ng/mL、肝素鈉5 μ g/mL、左旋谷氨酰胺2mM、青鏈霉素1:100的完全培養(yǎng)基在37°C，含5% CO2的加濕溫箱中培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，培養(yǎng)3天半量更換完全培養(yǎng)基，更換出來的培養(yǎng)液即為神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液。
[0010]所述的方法，神經(jīng)母細胞瘤細胞分化為神經(jīng)元細胞的比例大于80%。
[0011]所述的方法，神經(jīng)母細胞瘤細胞傳代培養(yǎng)的方法為在含有15%的胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、以及1:100的青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37°C，含5%CO2的加濕溫箱。
[0012]所述的方法，優(yōu)選神經(jīng)母細胞瘤細胞用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3-7天。
[0013]所述的方法，優(yōu)選神經(jīng)母細胞瘤細胞為SH-SY5Y細胞系。
[0014]所述的方法，優(yōu)選神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液的制備過程中更換出來的培養(yǎng)液用0.22 μπι孔徑的濾膜過濾，然后以1000RPM離心10分鐘并在顯微鏡下觀察確保沒有細胞污染。
[0015]所述的方法，優(yōu)選1-2天更換一次誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0016]本發(fā)明的有益效果:
[0017](I)使用神經(jīng)干細胞的條件培養(yǎng)液作為RA的組合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的分化效率大大提高，在誘導(dǎo)第3天神經(jīng)元比例高于80%，第7天達到91%,細胞的成熟度和這些神經(jīng)元細胞的神經(jīng)突觸生長也有所改善；
[0018](2)使用神經(jīng)干細胞的條件培養(yǎng)液可以抑制RA處理的SH-SY5Y細胞中的細胞凋亡。
【附圖說明】
[0019]圖1:神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液對維甲酸引起的細胞凋亡的保護作用圖，
[0020]圖2:神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化后的免疫熒光染色圖，
[0021]圖3:神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞向神經(jīng)元分化后的Western印跡檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明:
[0023]實施例1
[0024](I)神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液的制備
[0025]人神經(jīng)干細胞從Lonza公司購得，在T-75培養(yǎng)瓶中用15暈升完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基含有DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen)，人重組表皮生長因子(EGF，20ng/mL)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，20ng/mL) (R&D)，B27 (血清替代物，1:50，Invitrogen)，肝素(5 μ g/mL，Sigma)，左旋谷氨酰胺2mM，以及青鏈霉素(I:100, Invitrogen) 0在37°C，含5% CO2的加濕溫箱中孵育，每3天將培養(yǎng)基的百分之五十更換為新的完全培養(yǎng)基。神經(jīng)球生長到直徑約Imm大小時，在顯微鏡下切割傳代。每次更換培養(yǎng)基時，更換下來的舊培養(yǎng)液即為神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液。收集條件培養(yǎng)液并用0.22 μπι孔徑的濾膜(Millipore)過濾，然后以1000RPM離心10分鐘并在顯微鏡下觀察確保沒有細胞污染。根據(jù)需要量通過增加神經(jīng)干細胞的傳代次數(shù)來增加神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液的體積，傳代次數(shù)的不同，導(dǎo)致的最終得到的神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液成分的不同，對本技術(shù)方案不會產(chǎn)生影響，在此實施例中，根據(jù)需要量，更換了 3-8次培養(yǎng)基。
[0026](2)誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞向神經(jīng)元分化
[0027]將購自Sigma公司的SH-SY5Y細胞在DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包含15%的胎牛血清，2mM的谷氨酰胺，以及青鏈霉素的混合物(1:100, Invitrogen)。培養(yǎng)環(huán)境為37°C，含5 % CO2的加濕溫箱，用于實驗的SH-SY5Y細胞培養(yǎng)傳代到25代和30代之間。此操作中使用的培養(yǎng)液可以為本領(lǐng)域中任何可以達到SH-SY5Y細胞培養(yǎng)目的的培養(yǎng)液，在此只是列舉了能夠?qū)崿F(xiàn)的其中一種，但并不僅僅限于此列舉的培養(yǎng)液。
[0028]將I X 15數(shù)量的細胞接種于涂覆有聚賴氨酸的蓋玻片(直徑1mm)上，用I毫升培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于細胞免疫熒光染色鑒定。
[0029]將2X 16數(shù)量的細胞接種到10厘米直徑的培養(yǎng)皿中，用10毫升培養(yǎng)基培養(yǎng)，用于Western印跡分析和細胞活性檢測。
[0030]誘導(dǎo)培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞總共分為四組，
[0031]A組:SH-SY5Y細胞在含有3%胎牛血清和10 μ M的維甲酸(Sigma)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)3天；
[0032]B組:SH-SY5Y細胞在含有3%胎牛血清和10 μ M的維甲酸(Sigma)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)7天；
[0033]C組:SH_SY5Y細胞在含有10 μΜ維甲酸(Sigma)的神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天；
[0034]D組:SH_SY5Y細胞在含有10