專利名稱：A－nk細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)腫瘤生物治療學(xué)方法技術(shù)背景A-NK細(xì)胞(adherent natural killer cell)又稱A-LAK(adherent Lymphokin Activitate killer cell)細(xì)胞，基于其體外增殖和抗腫瘤能力強(qiáng)，對正常細(xì)胞無殺傷作用等優(yōu)點，成為近年來腫瘤過繼免疫療法的研究熱點之一。在臨床應(yīng)用中，目前常用于細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基，因含有人AB血清，雖經(jīng)各種病毒的檢測，但仍有可能傳播其他疾病，安全性低，并且存在批間差異，不宜質(zhì)控，價格也很昂貴。近幾年面世的無血清培養(yǎng)基則可達(dá)到生物潔凈要求，成分明確，質(zhì)量穩(wěn)定，便于質(zhì)控，克服了添加人AB血清的缺點，對于免疫治療的推廣應(yīng)用有重要意義。本發(fā)明力求找到一種新的方法，即不減少A-NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，又能增加其臨床應(yīng)用的安全性。
以往A-NK細(xì)胞的分離方法是首先需要通過常規(guī)的實驗方法獲得外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，然后過尼龍毛柱以去除單核細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用負(fù)免疫選擇技術(shù)純化出NK細(xì)胞，即加CD3、CD5、CD19和CD14單克隆抗體包被的磁珠，用磁板吸附結(jié)合于磁珠的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，未吸附細(xì)胞即為純化的NK細(xì)胞。將純化的NK細(xì)胞與22nM(6000IU/ml)IL-2培養(yǎng)獲得粘附在瓶壁的A-NK細(xì)胞。此方法耗資、耗力、耗時，容易污染，不利于臨床治療的開展。
長久以來科學(xué)家們一直認(rèn)為，只有IL-2能誘導(dǎo)產(chǎn)生A-NK細(xì)胞并增強(qiáng)或維持細(xì)胞的增殖能力和殺傷活性。但近年來，由于多種細(xì)胞因子的產(chǎn)品問世以及它的多種免疫生物學(xué)活性，它們在腫瘤免疫學(xué)方面的功能正受到愈來愈多的重視與關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和缺陷，提供一種A-NK細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，達(dá)到省力、省時，減少費用，減少污染，利于臨床治療的開展。
在臨床試驗中，為進(jìn)一步簡便、快速、大量的制備A-NK細(xì)胞，需要在方法上進(jìn)行改進(jìn)。常規(guī)分離制備A-NK用尼龍毛法去除單核巨噬細(xì)胞，以避免其對A-NK的增殖和細(xì)胞毒的抑制作用。本發(fā)明的基本設(shè)計是用苯丙氨酸甲酯(PME)可有效去除單核巨噬細(xì)胞而不改變淋巴細(xì)胞的表型和細(xì)胞毒性.具體方法是取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，吸取中界面層的單個核細(xì)胞用PBS洗滌三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室溫處理40分鐘(5×106/ml)，以去除B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，將PME處理過的已去除單核巨噬細(xì)胞的PBMC調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml置于完全培養(yǎng)液中，與22nM(6000IU/ml)IL-2共同培養(yǎng)4-5小時后，收集粘附于塑料培養(yǎng)瓶表面的細(xì)胞(即A-NK細(xì)胞)進(jìn)行臨床治療，將收集細(xì)胞的時間從傳統(tǒng)的24-48小時縮小到3-5小時。這樣可以縮短激活A(yù)-NK細(xì)胞的時間，從而減少臨床病人等待輸液的時間。是一種簡便、快速的制備A-NK的方法。
由于完全培養(yǎng)基中添加血清存在安全性低、不易質(zhì)控等缺點，無血清培養(yǎng)基則可達(dá)到生物潔凈要求，成分明確，質(zhì)量穩(wěn)定，便于質(zhì)控，得到越來越廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明比較了無血清培養(yǎng)基(AIMV)與完全培養(yǎng)基(RPMI-1640培養(yǎng)液，10％人AB血清)對A-NK/IL-2的支持作用。我們的研究結(jié)果表明，無血清培養(yǎng)基可替代含血清的完全培養(yǎng)基，二者所得培養(yǎng)物的數(shù)目和功能相當(dāng)。發(fā)展無血清培養(yǎng)基用于A-NK細(xì)胞的臨床生物治療，即不減少A-NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，又能增加其臨床應(yīng)用的安全性。
白細(xì)胞介素2(IL-2)是A-NK細(xì)胞活化和維持其細(xì)胞活性必不可少的細(xì)胞因子，但臨床治療時大量IL-2進(jìn)入體內(nèi)會引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、食欲不振、休克、毛細(xì)血管滲漏綜合癥等毒、副作用，因此適當(dāng)減少IL-2使用劑量，保持免疫細(xì)胞應(yīng)有活性一直是亟待解決的課題。
我們探討了IL-12對于A-NK/IL-2治療的輔助作用，力求找到一種新的方法。結(jié)果證明，IL-12同樣也能刺激A-NK細(xì)胞大量增殖，并能增強(qiáng)它的殺瘤能力，而且我們聯(lián)合應(yīng)用IL-12激活A(yù)-NK細(xì)胞，還可同時降低IL-2和IL-12的使用劑量，從而減少兩者的毒、副作用。
A-NK細(xì)胞殺傷腫瘤的形態(tài)學(xué)特征掃描和透射電鏡下均可見A-NK細(xì)胞在靶細(xì)胞表面及周圍形成花環(huán)，部分細(xì)胞變形，形成的突起或微絨毛伸向靶細(xì)胞，呈點狀或斑狀接觸。透射電鏡下可見腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)溶解壞死(necrosis)和凋零壞死(apoptosis)。部分靶細(xì)胞內(nèi)漿網(wǎng)腫脹，線粒體內(nèi)外膜分離，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡變性，核染色質(zhì)破碎，核膜、質(zhì)膜斷裂，最終細(xì)胞崩解，為典型的溶解壞死征象。而另一些腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、偏移，形成致密的月牙槽形狀聚集在核膜內(nèi)側(cè)面，基質(zhì)水腫變性，胞膜腫脹呈泡狀結(jié)構(gòu)，核膜、質(zhì)膜完整，可見典型的凋零小體。提示A-NK細(xì)胞進(jìn)入動物或人體內(nèi)，通過移行聚集在癌腫部位，與腫瘤細(xì)胞建立直接接觸，從而發(fā)揮它的細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞。A-NK細(xì)胞還能順利地通過血管內(nèi)皮基底膜，浸潤到實體瘤組織內(nèi)部的能力也強(qiáng)于其它免疫細(xì)胞。


圖1是A-NK細(xì)胞伸出粗長的偽足，細(xì)胞表面不光滑，有質(zhì)膜皺襞。(掃描電鏡、透射電鏡)圖2是A-NK細(xì)胞與K562腫瘤細(xì)胞(呈圓形)緊密相貼，靶細(xì)胞膜腫脹，呈泡狀。(掃描電鏡、透射電鏡)圖3是A-NK細(xì)胞伸出長偽足和突起，插向Anip973腫瘤細(xì)胞(呈梭形)，并與之緊緊相連。(掃描電鏡、透射電鏡)圖4是A-NK細(xì)胞向靶細(xì)胞聚集、粘附、形成花環(huán)，以突起或偽足與靶細(xì)胞微絨毛呈點狀或斑狀接觸，靶細(xì)胞出現(xiàn)溶解壞死征象，細(xì)胞內(nèi)空泡變性，線粒體嵴變性。(掃描電鏡、透射電鏡)圖5是A-NK細(xì)胞圍繞靶細(xì)胞，靶細(xì)胞核染色質(zhì)破碎，核膜質(zhì)膜破裂，最終細(xì)胞溶解壞死(掃描電鏡、透射電鏡)。
圖6是A-NK細(xì)胞以胞體與靶細(xì)胞形成大面積對合，兩者相對處膜呈波浪狀，其間有許多點狀接觸。靶細(xì)胞呈溶解壞死征象，細(xì)胞內(nèi)漿網(wǎng)腫脹，線粒體內(nèi)外膜分離，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡變性。(掃描電鏡、透射電鏡)圖7是呈現(xiàn)溶解壞死征象的腫瘤細(xì)胞，可見細(xì)胞內(nèi)漿網(wǎng)腫脹，線粒體內(nèi)外膜分離，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡變性，核染色質(zhì)破碎。(掃描電鏡、透射電鏡)圖8是呈現(xiàn)凋亡早期征象的腫瘤細(xì)胞，可見核染色質(zhì)固縮、偏移，形成致密的月牙槽形狀聚集在核膜內(nèi)側(cè)面，基質(zhì)水腫變性，但核膜質(zhì)膜完整。(掃描電鏡、透射電鏡)圖9是單獨應(yīng)用IL-2培養(yǎng)72小時A-NK細(xì)胞增殖狀態(tài)。(倒置顯微鏡)圖10是聯(lián)合應(yīng)用IL-2和IL-12培養(yǎng)72小時A-NK細(xì)胞增殖狀態(tài)。(倒置顯微鏡)具體實施方式
一、主要試劑和培養(yǎng)液1、重組人白細(xì)胞介素2(recombined human interleukin-2，rhIL-2)南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品(10萬IU/2ml)2、重組人白細(xì)胞介素12(IL-12)3、淋巴細(xì)胞分離液Sigma公司產(chǎn)品4、苯丙胺酸甲酯(phenylalanine methyl ester，PME)Sigma公司產(chǎn)品5 MTT(methyl thiazolyldipheny telrazolium bromide)Sigma公司產(chǎn)品6、完全培養(yǎng)液(CM)采用RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，其組成為90％RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco產(chǎn)品)，10％人AB血清(哈爾濱紅十字中心血站提供，用于人A-NK細(xì)胞培養(yǎng))或10％滅活的胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng))，2mM谷氨酰胺，10mMHEPES，100u/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素。
7、無血清培養(yǎng)液(AIMV)Gibco公司產(chǎn)品培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2飽和濕化空氣的培養(yǎng)箱中建立培養(yǎng)。所用培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均為美國Costar產(chǎn)品。酶標(biāo)儀為BioRAU，450型，美國制造。
二、腫瘤細(xì)胞1、人肺腺癌細(xì)胞Anip973，NK非敏感細(xì)胞系。
2、人紅白血病細(xì)胞K562，NK敏感細(xì)胞系。
三.人外周血單個核細(xì)胞的制備取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，吸取中界面層的單個核細(xì)胞用PBS洗滌三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室溫處理40分鐘(5×106/ml)，以去除B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，再用PBS洗滌三次備用。
四.A-NK細(xì)胞的誘導(dǎo)用PME處理后的人外周血單個核細(xì)胞分別重懸于以下培養(yǎng)液中實驗一；甲組RPMI-1640培養(yǎng)液，10％人AB血清，IL-2(6000IU/ml)；乙組RPMI-1640培養(yǎng)液，10％人AB血清，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)。
實驗二A組AIMV，IL-2(6000IU/ml)；B組AIMV，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)；C組RPMI-1640培養(yǎng)液，10％人AB血清，IL-2(6000IU/ml)；D組RPMI-1640培養(yǎng)液，10％人AB血清，IL-2(1000IU/ml)，IL-12(5ng/ml)。
分別調(diào)成細(xì)胞濃度為5×106/ml置于塑料培養(yǎng)瓶中，于37℃，5％CO2飽和濕化空氣的培養(yǎng)箱中水平培養(yǎng)4-5小時，移去含未粘附塑料表面的細(xì)胞懸液(此即NA-NK細(xì)胞)，收集粘附于塑料表面的細(xì)胞(即A-NK細(xì)胞)，分別重懸于各自含50％自體條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，調(diào)成細(xì)胞濃度為2×106/ml。A-NK細(xì)胞的四個實驗組按要求分別補(bǔ)加各組培養(yǎng)液成分。NA-NK細(xì)胞只保留兩組，即E組AIMV+IL-2(1000IU/ml)和F組RPMI-1640培養(yǎng)液+10％人AB血清+IL-2(1000IU/ml)。繼續(xù)培養(yǎng)，每3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液和IL-2或IL-12，細(xì)胞濃度和細(xì)胞因子終濃度不變。
五、細(xì)胞增殖活性的測定采用改進(jìn)的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法。于培養(yǎng)的第1，4，7，10和第14天分別取細(xì)胞，充分洗滌，以1×106/ml濃度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10分鐘后在酶標(biāo)儀上570nm處測定吸光度(OD值)，取3孔均值，OD值高則增殖快。
六、體外細(xì)胞毒作用的檢測采用MTT法進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定。將靶細(xì)胞Anip973和K562腫瘤細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌三次，用1×104/ml腫瘤細(xì)胞懸液100μl/孔加入96孔平底培養(yǎng)板中，按100∶1的效靶比例每孔再加入100μl濃度為1×106/ml的效應(yīng)細(xì)胞(A-NK或NA-NK)，設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共同孵育孔(E+T)，效應(yīng)細(xì)胞對照孔(E)和靶細(xì)胞對照孔(T)，每組設(shè)3個復(fù)孔。37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，每孔加MTT(5mg/ml)20μl，37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4小時，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亞砜(DMSO)輕輕振蕩10分鐘后在酶標(biāo)儀上570nm處測定吸光度(OD值)，取三孔均值，公式如下細(xì)胞殺傷活性(％)＝[1-(ODE+T-ODE)/ODT]×100
權(quán)利要求
一種A-NK細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)過程中在A-NK細(xì)胞分離方法的改進(jìn)中用苯丙氨酸甲酯(PME)可有效去除單核巨噬細(xì)胞而不改變淋巴細(xì)胞的表型和細(xì)胞毒性。具體方法是取健康人外周血，肝素抗凝，用PBS二倍稀釋后，用人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘，吸取中界面層的單個核細(xì)胞用PBS洗滌三次。然后，置于塑料管中用PME(5mmol/L)室溫處理40分鐘(5×106/ml)，以去除B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，將PME處理過的已去除單核巨噬細(xì)胞的PBMC調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml置于完全培養(yǎng)液中，與22nM(6000IU/ml)IL-2共同培養(yǎng)4-5小時后，收集粘附于塑料培養(yǎng)瓶表面的細(xì)胞(即A-NK細(xì)胞)進(jìn)行臨床治療，將收集細(xì)胞的時間從傳統(tǒng)的24-48小時縮小到3-5小時；在A-NK細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)中，無血清培養(yǎng)基可替代含血清的完全培養(yǎng)基，二者所得培養(yǎng)物的數(shù)目和功能相當(dāng)。發(fā)展無血清培養(yǎng)基用于A-NK細(xì)胞的臨床生物治療，即不減少A-NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，又能增加其臨床應(yīng)用的安全性；IL-4可聯(lián)合IL-2對A-NK細(xì)胞的生長有較強(qiáng)的刺激或成熟作用；IL-2和IL-12聯(lián)合應(yīng)用可提高活化免疫細(xì)胞的殺傷活性。
全文摘要
A－NK細(xì)胞分離培養(yǎng)方法是一種醫(yī)學(xué)腫瘤生物治療學(xué)的方法。用如下方法對A－NK細(xì)胞分離培養(yǎng)進(jìn)行了改進(jìn)。用苯丙氨酸甲酯(PME)去除單核巨噬細(xì)胞而不改變淋巴細(xì)胞的表型和細(xì)胞毒性；在A－NK細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)中，無血清培養(yǎng)基可替代含血清的完全培養(yǎng)基，二者所得培養(yǎng)物的數(shù)目和功能相當(dāng)，發(fā)展無血清培養(yǎng)基用于A－NK細(xì)胞的臨床生物治療，即不減少A－NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，又能增加其臨床應(yīng)用的安全性；IL－4可聯(lián)合IL－2對A－NK細(xì)胞的生長有較強(qiáng)的刺激或成熟作用；IL－2和IL－12聯(lián)合應(yīng)用可提高活化免疫細(xì)胞的殺傷活性。
文檔編號C12N5/08GK1706938SQ20041004361
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者王志華 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤病防治研究所