專利名稱：分離細(xì)胞的方法及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取和鑒別細(xì)胞——具體是胎兒細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞——的非-侵入性的方法。本發(fā)明包括使用所述細(xì)胞鑒別染色體異常和突變的的方法，特別是通過進(jìn)行染色體和單基因病的基因診斷用于產(chǎn)前診斷。本發(fā)明還包括證實(shí)細(xì)胞胎兒起源的方法。
引言大約0.5％的夫妻冒很大的風(fēng)險(xiǎn)懷上患有遺傳疾病的胎兒。這種遺傳疾病包括囊性纖維化、亨庭頓病、β地中海貧血和肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良。例如，在澳大利亞，人群中每25人中就有1人是囊性纖維化突變的攜帶者，因此最近已開始進(jìn)行新生兒囊性纖維化的篩選以監(jiān)控所有剛出生的孩子。
除了單基因病，染色體異常是自然流產(chǎn)和新生兒中最常見的遺傳疾病。涉及染色體21、18、13、X和Y的三體性是具有最常見的染色體21三體性或唐氏綜合癥的最大的類群，大約在每700個(gè)新生兒中就有一個(gè)發(fā)生。染色體13和18的三體性是僅有的其它常染色體三體性，這造成特征異常綜合癥，導(dǎo)致在出生后的時(shí)期里新生兒很快死亡。余下的活產(chǎn)的三體性患者具有額外的性染色體，XXY、XYY或XXX。進(jìn)行產(chǎn)前診斷主要是試圖檢測胎兒中的染色體異常，具體的是唐氏綜合癥。唐氏綜合癥是引起人智力遲鈍的最重要的遺傳因素，還與先天性心臟病和白血病的高風(fēng)險(xiǎn)性有關(guān)。
在懷孕過程中進(jìn)行產(chǎn)前診斷以檢測胎兒的單基因病或染色體異常。目前，產(chǎn)前診斷包含侵入性步驟，即以絨毛膜絨毛取樣(CVS)(10-12周)或羊膜腔穿刺(14-16周)的形式鑒定胎兒中潛在的染色體非整倍性。這兩種步驟都具有流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)(1-2％)。因此，產(chǎn)前檢驗(yàn)僅提供給發(fā)覺具有較大風(fēng)險(xiǎn)的婦女，包括年長的孕婦(大于35歲)，具有母體血清篩選異常的婦女或以前懷有染色體異常的胎兒的婦女。
通常，使用侵入性方法對(duì)絨毛膜或羊膜細(xì)胞取樣進(jìn)行產(chǎn)前診斷。這些取樣方法確保當(dāng)前胎兒的胎兒細(xì)胞也被檢驗(yàn)。從其它來源例如血液獲得的樣品不能保證胎兒細(xì)胞這樣鑒定，可使用從當(dāng)前的胎兒或是最近流產(chǎn)的胎兒獲得的細(xì)胞，因?yàn)檫@種細(xì)胞可在循環(huán)系統(tǒng)中保留幾年。一獲得胎兒細(xì)胞就使用細(xì)胞遺傳技術(shù)鑒別染色體異常。這一過程時(shí)間很長并需要高水平的專門的技術(shù)知識(shí)。而且，患者通常要到三周后才能得到結(jié)果。
所以一種快速的、非侵入性的診斷技術(shù)，并且優(yōu)選地是一種確保檢驗(yàn)當(dāng)前胎兒的技術(shù)將非常有益于具有或高或低的遺傳風(fēng)險(xiǎn)性的所有懷孕的婦女。在24小時(shí)內(nèi)的作出的診斷將給予她們一種意見和早做決定的機(jī)會(huì)，即在其懷孕的頭三個(gè)月進(jìn)行治療性的墮胎。
因此，需要一種快速和非-侵入性的診斷試驗(yàn)用于懷孕的婦女，以鑒別基本上完整胚胎的細(xì)胞和從她們正在進(jìn)行的妊娠中診斷例如唐氏綜合癥的常見的胎兒染色體非整倍性，以及其它遺傳和單基因疾病。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是克服或至少減少以往技術(shù)中的一些問題和改進(jìn)對(duì)懷孕婦女的遺傳檢驗(yàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了從子宮頸粘液樣品中提取細(xì)胞的方法，所述方法包括獲得子宮頸粘液樣品；用膠原酶和蛋白酶處理樣品，以從子宮頸粘液樣品中分離細(xì)胞；和從樣品中提取分離的細(xì)胞。
優(yōu)選地，本方法提取基本上完整的細(xì)胞，該細(xì)胞基本上保持其細(xì)胞膜的完整性，這使得可以例如通過抗體檢驗(yàn)進(jìn)行可靠的鑒定。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，子宮頸粘液樣品在用膠原酶和蛋白酶處理分離細(xì)胞前還用粘液溶解劑進(jìn)行處理。人們發(fā)現(xiàn)通過以這種組合的方式處理，從子宮頸粘液樣品中獲得了更多的懸浮的單細(xì)胞。
該粘液樣品進(jìn)一步用酶混合物處理以分解粘液。理想的是，混合物保持細(xì)胞的完整性，以保存細(xì)胞膜，便于胎兒或孕婦細(xì)胞的鑒別。因此選擇以組合方式使用兩種酶，它們對(duì)細(xì)胞基本上沒有影響。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)蛋白酶與膠原酶的組合以及優(yōu)選地與粘液溶解劑的組合，成功地以允許細(xì)胞鑒定和用于隨后的診斷目的的形式釋放出細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種從子宮頸粘液樣品中提取胎兒細(xì)胞的方法，所述方法包括如上所述獲得分離的細(xì)胞；使用胎兒特異性抗體處理細(xì)胞；
鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞；和提取已鑒別的胎兒細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了鑒別胎兒細(xì)胞的方法，所述方法包括如上所述從子宮頸粘液樣品獲得分離的細(xì)胞；使用胎兒特異性抗體處理細(xì)胞；和鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了鑒別胎兒細(xì)胞的染色體中染色體非整倍性的方法，所述方法包括獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；和確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了產(chǎn)前診斷的方法，所述方法包括如本文所述從子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)(3)表示胎兒細(xì)胞特征的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖；和把等位基因分布圖與產(chǎn)前診斷癥狀相關(guān)聯(lián)。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種診斷唐氏綜合癥的方法，所述方法包括用以下通過如下方法鑒別染色體的非整倍性，所述方法包括獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記；確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖；和確定染色體21的三體性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了從個(gè)體獲得的子宮頸粘液樣品中證實(shí)胎兒細(xì)胞起源的方法，所述方法包括從同一個(gè)體中獲得胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞；選擇表示胎兒或母體細(xì)胞特征的至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；和在胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞上確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
附1顯示從一個(gè)患有唐氏綜合癥的男性獲得的單個(gè)人口腔細(xì)胞的DNA指紋。微衛(wèi)星標(biāo)記D21S1413、D21S11和D21S1442顯示三等位基因模式，而D21S1437、D21S11和D21S1411顯示具有預(yù)期的1∶2等位比的二等位基因加倍劑量模式。
圖2顯示從一個(gè)二倍體患者獲得的單個(gè)人口腔細(xì)胞的DNA指紋。在這個(gè)八重(octaplex)DNA指紋分析系統(tǒng)中，對(duì)如下每一個(gè)染色體具有兩個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，X、13、18和21都顯示二倍體等位比。
圖3顯示從一個(gè)二倍體患者獲得的單個(gè)人口腔細(xì)胞的DNA指紋，該患者是常見的囊性纖維化δF508突變的攜帶者。在這個(gè)DNA指紋中對(duì)于染色體21有四個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，以及對(duì)囊性纖維化δF508的突變檢測。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了從子宮頸粘液樣品提取細(xì)胞的方法，所述方法包括獲得子宮頸粘液樣品；用膠原酶和蛋白酶處理樣品，以從子宮頸粘液樣品中分離細(xì)胞；和從樣品中提取分離的細(xì)胞。
本發(fā)明提供了從子宮頸粘液樣品中釋出母體和胎兒細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞可能束縛于復(fù)合粘液結(jié)構(gòu)中，并且以前曾嘗試將這些細(xì)胞釋出。然而，以前沒有成功地釋出這些細(xì)胞，即使被釋出，它們保持為塊狀或其細(xì)胞膜完整性遭到破壞，因此降低了其隨后用于例如產(chǎn)前診斷或有效的鑒定的有效性。
因此，優(yōu)選的是本方法提取基本上完整的細(xì)胞，該細(xì)胞基本上保持其細(xì)胞膜的完整性，這使得可以例如通過抗體檢驗(yàn)進(jìn)行可靠的鑒定。
為了正確地診斷胎兒的遺傳疾病，理想地是使用胎兒細(xì)胞。然而，獲得用于這種用途的可靠分離和鑒定的胎兒細(xì)胞始終存在問題。子宮頸粘液提供了這些細(xì)胞的來源，但是問題依然存在，即從主要包含母體細(xì)胞的粘液中有效地分離胎兒細(xì)胞，然后保持其完整性用于鑒定和診斷。
檢驗(yàn)胎兒的非侵入性方法將降低流產(chǎn)和胎兒死亡的發(fā)生率。胎兒細(xì)胞流入較低的子宮極(uterine pole)，母親的子宮頸粘液提供了胎兒細(xì)胞的潛在來源。然而，與這一來源有關(guān)的是分離胎兒細(xì)胞用于進(jìn)一步鑒定和診斷的問題。直到現(xiàn)在也難以從周圍的粘液栓中分離這些稀少的細(xì)胞。甚至當(dāng)細(xì)胞從粘液中釋出后，從母體細(xì)胞中分離和鑒別這些稀有的胎兒細(xì)胞仍然存在問題。因此，在可以進(jìn)行隨后的用于任何遺傳疾病的單細(xì)胞分子診斷前，需要從大多數(shù)的母體細(xì)胞中正確鑒定這些稀有的細(xì)胞。以前的研究表明起源于當(dāng)前胎兒的這些細(xì)胞僅僅在妊娠的7-13周的這一段短短的時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。
在妊娠的頭三個(gè)月和中三個(gè)月中，在母親的血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了胎兒起源的有核紅血細(xì)胞，雖然出現(xiàn)的頻率為約百萬分之一。一些研究小組使用不同形式的細(xì)胞分選方法試圖分離這些稀有的胎兒有核紅血細(xì)胞；但是進(jìn)展有限。此外，研究顯示分娩后胎兒細(xì)胞仍保留在母體血液循環(huán)中，因此能夠混淆當(dāng)前胎兒的診斷。到目前為止，在胎兒紅血細(xì)胞和其它胎兒細(xì)胞的表面使用胎兒特異性抗原，結(jié)合顯微操作技術(shù)，最有希望鑒別胎兒細(xì)胞。
術(shù)語“完整的”細(xì)胞是指保持細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。理想地，該細(xì)胞沒有損失胞內(nèi)物質(zhì)，以便通過使用包括DNA、RNA和mRNA的核酸進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。
本方法提供了從子宮頸粘液獲得細(xì)胞，優(yōu)選的是完整細(xì)胞的手段，這提供了非侵入性檢驗(yàn)胎兒的基礎(chǔ)。一旦從粘液栓中釋出細(xì)胞，它們可被進(jìn)一步鑒定為胎兒的或母體的，這樣提供了用于遺傳檢驗(yàn)的胎兒細(xì)胞的來源。
樣品中的細(xì)胞包括來自子宮頸內(nèi)導(dǎo)管的細(xì)胞，該細(xì)胞從胎兒流出并遷移到子宮頸。在妊娠頭三個(gè)月(大約7-13周)，在子宮頸內(nèi)導(dǎo)管中發(fā)現(xiàn)了這些細(xì)胞。該細(xì)胞可能起源于胎兒或者母體。
假定這些細(xì)胞從正在退化的絨毛膜絨毛流入較低的子宮極和子宮頸粘液。胎兒細(xì)胞可連同母體細(xì)胞一起以非侵入的方法提取，與pap涂片相似，優(yōu)選地通過從子宮頸內(nèi)導(dǎo)管和較低的子宮極抽吸粘液。以前的研究顯示這些胎兒細(xì)胞發(fā)生于50-90％的經(jīng)子宮頸的的樣品；發(fā)生頻率的變化是由于取樣技術(shù)、操作者的技術(shù)水平以及不能準(zhǔn)確無誤地區(qū)別胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)子宮頸的細(xì)胞的收集是安全而有效的。在CVS前對(duì)懷孕的婦女進(jìn)行初步的研究表明這一過程不會(huì)增加感染或自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。迄今為止報(bào)道的研究涉及200多名婦女，在正在進(jìn)行的妊娠過程中抽吸子宮樣品，并且這些步驟對(duì)于母親和胎兒健康沒有不良影響。只有在某些樣品中通過在大量經(jīng)子宮頸的細(xì)胞進(jìn)行PCR后，來自父親的遺傳微衛(wèi)星標(biāo)記的存在證實(shí)胎兒的起始。母體細(xì)胞污染將干擾產(chǎn)前診斷。
可以在懷孕的任何階段獲得子宮頸粘液樣品。優(yōu)選地，的妊娠的頭三個(gè)月和中三個(gè)月獲得樣品。理想地，在能夠?qū)μ旱牧己脿顩r做出決定的階段獲得樣品，和優(yōu)選地在有機(jī)會(huì)對(duì)治療性流產(chǎn)做出早期決定的期間內(nèi)獲得樣品。優(yōu)選地直到妊娠的14周獲得樣品。更佳地，在妊娠的頭三個(gè)月獲得樣品。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，子宮頸粘液樣品用膠原酶和蛋白酶處理以分離細(xì)胞前還用粘液溶解劑進(jìn)行處理。人們發(fā)現(xiàn)以這種結(jié)合的方式進(jìn)行處理，從子宮頸粘液樣品中獲得了更多的細(xì)胞。
適合的粘液溶解劑選自N-乙酰-L-半胱氨酸、DTT、胰蛋白酶和胰蛋白酶/EDTA。優(yōu)選地，粘液溶解劑是N-乙酰-L-半胱氨酸。
樣品在用酶處理之前優(yōu)選用粘液溶解劑處理。然而，這一步也可以與用膠原酶和蛋白酶進(jìn)行的酶處理組合進(jìn)行。組合處理的結(jié)果導(dǎo)致粘液分解的協(xié)同作用，因此促進(jìn)細(xì)胞的釋出。粘液溶解劑和酶(膠原酶和蛋白酶)的組合作用比僅用粘液溶解劑和僅用酶處理的分離的和總和的效果更有效。
優(yōu)選地，樣品用2-20mg/ml的N-乙酰-L-半胱氨酸處理。更佳地，使用的最終濃度為10mg/ml。
樣品處理一段時(shí)間，使之足以分解粘液并通常通過分解粘液栓成為小珠降低粘液的粘性。更佳地，樣品在大約37℃處理30-60分鐘。最優(yōu)選地，緩緩攪動(dòng)樣品并處理45分鐘。
進(jìn)一步用酶混合物處理粘液樣品以分解粘液。理想地，混合物保持細(xì)胞的完整性以保存細(xì)胞膜，從而便于胎兒或母體細(xì)胞的鑒定。所以挑選并組合使用酶，這些酶對(duì)細(xì)胞基本上沒有影響。
通常避免使用酶如蛋白酶，特別是如果細(xì)胞膜的完整性得到保持。然而，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)蛋白酶和膠原酶組合，并且優(yōu)選地與粘液溶解劑組合，成功地釋出細(xì)胞，細(xì)胞的形式使之可以被鑒定和用于隨后的診斷目的。
膠原酶和蛋白酶可以單獨(dú)使用或組合使用。然而，兩種酶同時(shí)使用處理粘液細(xì)胞是優(yōu)選的。還需要制備用于粘液樣品處理的酶的混合物，這樣可完成粘液樣品的同時(shí)處理。
優(yōu)選地，酶的濃度足以充分地分解粘液。該濃度最好足夠高，使之無論如何在一次或兩次處理后分解粘液。
用膠原酶和蛋白酶處理子宮頸粘液樣品。可使用熟練的技術(shù)人員所熟悉的任何膠原酶類型或蛋白酶類型。
商業(yè)購得的酶混合物，如分離酶混合酶(liberase blendzyme)，可用來補(bǔ)足膠原酶和蛋白酶處理。分離酶混合酶是膠原酶同工型I和II以及嗜熱菌蛋白酶的組合，可從Roche購得。酶混合物的適當(dāng)?shù)臐舛却蠹s為分離酶混合酶(0.5-10WU/ml)膠原酶和分散酶(0.1-1.5mg/ml)。
然而，并發(fā)明并不限于這些特定的濃度。濃度和培養(yǎng)時(shí)間的操作在某些粘液樣品中可提供更多細(xì)胞的釋放。
分離的細(xì)胞將包含母體和胎兒的細(xì)胞，就是來自這種細(xì)胞混合物的胎兒細(xì)胞可進(jìn)一步鑒定和分離，用于產(chǎn)前診斷測試或需要分離的細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的其它用途。
可使用熟練的技術(shù)人員可利用的任何方法從樣品中提取分離的細(xì)胞，這些方法包括用適當(dāng)?shù)木彌_液和鹽溶液洗滌后離心。提取或除去細(xì)胞包括從上清液中分離細(xì)胞。一旦提取，可使用該細(xì)胞用于進(jìn)一步鑒定為母體和胎兒的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了從子宮頸粘液樣品提取胎兒細(xì)胞的方法，所述方法包括如上所述獲得分離的細(xì)胞；用胎兒特異性抗體處理細(xì)胞；鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞；和提取鑒別的胎兒細(xì)胞。
如上所述制備了分離細(xì)胞的樣品后，可從子宮頸粘液樣品提取胎兒細(xì)胞。從子宮頸粘液樣品獲得的分離的細(xì)胞是胎兒和母體細(xì)胞的混合物。然后對(duì)該細(xì)胞混合物進(jìn)行鑒別，鑒定出胎兒起源的細(xì)胞。
本發(fā)明的胎兒細(xì)胞可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒別和分離。這些技術(shù)包括，但不僅限于，包含使用抗體標(biāo)記細(xì)胞的免疫組織化學(xué)，并因此鑒定該它為胎兒起源的細(xì)胞。這些技術(shù)還包括使用初次抗體和二次抗體鑒別細(xì)胞為妊娠頭三個(gè)月的胎兒起源的細(xì)胞。優(yōu)選地，抗體與胎兒特異性抗原結(jié)合，并可以是IgG、IgM和單克隆的。優(yōu)選地，胎兒特異性抗原位于胎兒細(xì)胞的表面。一旦結(jié)合，胎兒細(xì)胞被加工，“標(biāo)記的”細(xì)胞與那些缺乏標(biāo)記的細(xì)胞分離。細(xì)胞的標(biāo)記可包括進(jìn)一步使用與初次抗體結(jié)合的二次抗體。二次抗體的例子包括將與小鼠衍生的初次抗體結(jié)合的兔抗-小鼠熒光素異硫氰酸鹽異構(gòu)體I(FITC)。然而初次抗體可能適合于在二次抗體缺乏的情況下鑒別和分離細(xì)胞。適當(dāng)?shù)亩慰贵w可通過熟練的技術(shù)人員考慮初次抗體和二次抗體對(duì)初次抗體作出的反應(yīng)而確定。
使用胎兒特異性抗體鑒定胎兒細(xì)胞。一旦細(xì)胞從子宮頸樣品的粘液中分離，就可使用目前可購得的胎兒特異性抗體。優(yōu)選地，胎兒特異性抗體對(duì)妊娠的頭三個(gè)月具有特異性。更佳地，該抗體包括對(duì)合胞滋養(yǎng)層、絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞柱具有特異性的抗體。
其它適當(dāng)?shù)奶禾禺愋钥贵w描述于Sunderland，C.A等，(1981)“人合胞滋養(yǎng)層的單克隆抗體”(Monoclonal Antibodies to human syncytiotrophoblast)Immunology 43(3)541-6和Griffith-Jones，M.D.等，(1992)“通過基因擴(kuò)增從妊娠的頭三個(gè)月獲得的經(jīng)子宮頸的棉拭中的胎兒DNA的檢測一種產(chǎn)前診斷的新途徑？”(Detection of fetal DNA in trans-cervical swabs from first trimesterpregnancies by gene amplificationA new route to prenatal diagnosis？)，British Journal of Obstetrics and Gynecology，99(6)508-11。特別地，這些抗體是NDOG1、NDOG5和FT1.41.1。NDOG1染色合胞滋養(yǎng)層，NDOG5染色合胞滋養(yǎng)層和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞柱，F(xiàn)T1.41.1染色合胞滋養(yǎng)層和妊娠頭三個(gè)月的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層。這些抗體不與母體的子宮內(nèi)膜或子宮頸組織發(fā)生反應(yīng)。
這些抗體可以單獨(dú)使用或組合使用。如果允許細(xì)胞與抗體反應(yīng)和與抗體結(jié)合，那么這些抗體可以分別或同時(shí)給予細(xì)胞。優(yōu)選地，將它們用做抗體混合物來鑒定胎兒細(xì)胞。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)這些抗體特異性地結(jié)合胎兒細(xì)胞的細(xì)胞膜。
胎兒特異性抗體對(duì)所有的胎兒細(xì)胞類型都具有特異性是優(yōu)選的。由于在子宮頸粘液樣品中胎兒細(xì)胞的異質(zhì)性增加，需要使用胎兒特異性抗體的混合物檢測所有類型的胎兒細(xì)胞。當(dāng)使用一個(gè)抗體時(shí)，其它胎兒細(xì)胞類型可能被遺漏?？赏ㄟ^了解妊娠的階段選擇抗體，并因此可預(yù)測具體的細(xì)胞類型。相應(yīng)地，對(duì)該預(yù)測的細(xì)胞類型具有特異性的抗體可優(yōu)先單獨(dú)使用或組合使用。
抗體可包含一個(gè)標(biāo)記以便于鑒別。本文使用的術(shù)語“標(biāo)記”是指直接或間接地與例如核酸探針或抗體的試劑結(jié)合或融合，并促進(jìn)與其結(jié)合或融合的試劑的檢測的化合物或組合物。標(biāo)記本身可以被檢測(例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或在酶標(biāo)記的情況下可催化可被檢測的基質(zhì)化合物或組合物的化學(xué)改變。
使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)鑒別和/或分離用抗體標(biāo)記的胎兒細(xì)胞，這些技術(shù)包括熒光激活細(xì)胞分類(FACS)、磁珠分離術(shù)、顯微操作術(shù)、激光捕獲和用于母體細(xì)胞的負(fù)選擇或胎兒細(xì)胞的正選擇的熒光免疫組織化學(xué)。優(yōu)選地，使用熒光免疫組織化學(xué)鑒別和/或分離胎兒細(xì)胞，用于母體細(xì)胞的負(fù)選擇或胎兒細(xì)胞的正選擇。例如，使用熒光免疫組織化學(xué)標(biāo)記的胎兒細(xì)胞可在熒光顯微鏡下從形態(tài)上得以鑒定，且細(xì)胞使用顯微操縱術(shù)進(jìn)行分離，該顯微操縱術(shù)例如使用拉伸的玻璃移液管或顯微操縱器。
一旦細(xì)胞得以鑒定，那么可通過熟練的技術(shù)人員可以得到的方法進(jìn)行分離或提取。例如，如果細(xì)胞是熒光標(biāo)記的，它們可使用激光捕獲進(jìn)行分離或通過FACS分析進(jìn)行分選。然而，可使用其它方法，這取決于通過抗體識(shí)別的細(xì)胞的鑒定方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了通過本文描述的方法提取的胎兒細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了鑒別胎兒細(xì)胞的方法，所述方法包括如上所述從子宮頸粘液樣品中獲得分離的細(xì)胞；用胎兒特異性抗體處理細(xì)胞；和鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞。
通過從子宮頸粘液樣品中獲得細(xì)胞懸浮液成功地從子宮頸粘液樣品中鑒別了胎兒細(xì)胞。優(yōu)選地該細(xì)胞是完整的，使抗體可以與基本上完整的細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了鑒別胎兒細(xì)胞的方法。所述方法包括獲得細(xì)胞樣品；用抗體處理細(xì)胞樣品，所述抗體選自本文所述的NDOG1、NDOG5和FT1.41.1或它們的等價(jià)物；和鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞。
如上文所述，可使用僅與胎兒細(xì)胞反應(yīng)的特異性的抗體混合物鑒別胎兒細(xì)胞。這些抗體也就是對(duì)胎兒細(xì)胞具有特異性的NDOG1、NDOG5和FT1.41.1。它們可以被單獨(dú)使用或組合使用并且它們可以被分別或同時(shí)加入。
術(shù)語“它們的等價(jià)物”，它涉及抗體NDOG1、NDOG3和FT1.41.1，并且如本文所使用的是指等價(jià)抗體，該抗體以相似的方式進(jìn)行反應(yīng)并且對(duì)任何一個(gè)所列出的抗體具有相似的特異性。例如，可通過確定NDOG1、NDOG5和FT1.41.1的靶位點(diǎn)并使用熟練的技術(shù)人員所熟悉的方法，例如產(chǎn)生單克隆和多克隆抗體的方法生產(chǎn)其它抗體。
優(yōu)選地，如上文所述的方式標(biāo)記抗體。熒光標(biāo)記是最優(yōu)選的。
一旦優(yōu)選地從非侵入性來源，例如子宮頸粘液栓中鑒別并提取了胎兒細(xì)胞，該細(xì)胞可以任何方式使用，所述方式包括(a)用于胎兒鑒別、染色體非整倍性和單基因診斷的多重FL-PCR；(b)WGA、雜交和微陣列分析，包括用于胎兒鑒別的SNP’s和用于單基因疾病和染色體非整倍性的探針；或(c)mRNA、cDNA文庫的提取，雜交和基因表達(dá)微陣列的分析。
這些技術(shù)可用于表征胎兒細(xì)胞以鑒別胎兒細(xì)胞的任何生化的、代謝的或遺傳的疾病。這些分離的胎兒細(xì)胞可用于鑒別所有類型的異常，包括可在任何細(xì)胞類型中得到確定的異常。一旦胎兒細(xì)胞從子宮頸粘液樣品中得以分離和鑒別，就可在該細(xì)胞上進(jìn)行任何細(xì)胞分析。
微陣列也可用于證實(shí)細(xì)胞起源、單基因疾病的診斷和染色體異常。在一個(gè)單一的微陣列上，使用單核苷酸多態(tài)性(SNP’s)鑒定胎兒細(xì)胞是可能的，單基因疾病和染色體異常也是同樣。使用這種方法，分離的和鑒別的單一的胎兒細(xì)胞可通過引物延伸預(yù)擴(kuò)增PCR(PEP-PCR)、降解寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)、連接體-適配器-PCR或者M(jìn)SD(多股鏈的置換)WGA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增(WGA)。來自WGA的熒光標(biāo)記的產(chǎn)物可與微陣列平臺(tái)雜交，并且結(jié)合熒光的激光掃描可證實(shí)胎兒起源和所有23對(duì)人類染色體的染色體非整倍性的診斷以及鑒定任何特異性單基因缺陷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種組合物，當(dāng)用于鑒定胎兒細(xì)胞時(shí)，所述組合物包括抗體NDOG1、NDOG5和FT1.41.1。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種在胎兒細(xì)胞的染色體中鑒別染色體非整倍性的方法，所述方法包括獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；和確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
本發(fā)明的這一方面涉及在胎兒細(xì)胞的染色體中鑒別染色體非整倍性的方法。本文使用的“染色體中的染色體非整倍性”包括當(dāng)與受試者的正常的天然染色體組型相比較時(shí)，染色體丟失或具有一個(gè)額外的拷貝或染色體部分，并包括缺失、添加和移位，這在具體的位點(diǎn)引起單體性或三體性。優(yōu)選地，非整倍性選自常染色體的三體性和單體性，性染色體的單體性、二體性和三體性。
優(yōu)選地，如上所述從子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞。優(yōu)選地，樣品取自懷孕的婦女。然而，本發(fā)明不排除從流產(chǎn)的婦女獲得胎兒細(xì)胞。
獲得胎兒細(xì)胞的侵入性方法，例如絨毛膜絨毛取樣(CVS)或羊膜穿刺產(chǎn)生絨毛膜絨毛樣品、羊水細(xì)胞(aminocyte)、胎兒組織和臍血，可提供胎兒細(xì)胞。然而，從子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞的非侵入性方法是優(yōu)選的?？墒褂萌魏坞A段的任何類型的胎兒細(xì)胞。
本發(fā)明包括對(duì)核酸具有特異性的多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的使用。本發(fā)明的核酸可以是DNA，優(yōu)選染色體DNA。優(yōu)選地，多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記位于相同的染色體。
優(yōu)選地，選擇多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記基于高度的雜合性、等位基因的廣分散性、產(chǎn)生三等位基因模式的高概率和對(duì)指示染色體的特異性。例如用于唐氏綜合癥診斷的染色體21的四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記列于表2中，用于其它綜合癥的診斷的其它四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記列于表3中。
選擇的多態(tài)標(biāo)記將用于鑒定各種模式的非整倍性，它包括常染色體的三體性和單體性，和性染色體的單體性、二體性和三體性。等位基因大小的廣泛分布對(duì)于成功的遺傳分析是優(yōu)選的，因?yàn)檫@種等位基因大小的范圍提供了非整倍性的等位基因模式的診斷，具體是三體性、二體性或單體性。還選擇了標(biāo)記，這樣各個(gè)標(biāo)記在DNA指紋中具有一個(gè)獨(dú)特的等位基因分布圖并且不與其它的標(biāo)記重疊。
三體性是最常見的染色體異常，常見于流產(chǎn)和死產(chǎn)，染色體21、18和13的三體性和X和Y的二體性為最大的群體。染色體21的三體性和唐氏綜合癥是妊娠期間最常見的常染色體異常。
本發(fā)明在染色體上需要至少三個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，使之可以進(jìn)行染色體非整倍性的鑒別。
少于三個(gè)多態(tài)性的標(biāo)記的擴(kuò)增由于一些原因給出了虛假的結(jié)果。與通過在有限的模板上進(jìn)行多重?zé)晒饩酆厦告湻磻?yīng)(FL-PCR)得到的DNA指紋有關(guān)的問題包括整個(gè)擴(kuò)增的失敗、親本純合性的可能性(每個(gè)親本具有相同等位基因的兩個(gè)拷貝)、等位基因丟失(ADO)(一個(gè)等位基因在PCR的前幾輪中整個(gè)擴(kuò)增失敗，以致于只有一個(gè)等位基因可檢測)和優(yōu)先擴(kuò)增(PA)(一個(gè)等位基因的不足表現(xiàn)導(dǎo)致預(yù)期的1∶1二對(duì)等位基因的比的改變)。因此，每個(gè)染色體需要最少三個(gè)高度多態(tài)的微衛(wèi)星標(biāo)記用于非整倍性細(xì)胞的診斷。
為了提高精確度，微衛(wèi)星標(biāo)記的數(shù)量可以增加。本方法需要至少三個(gè)(3)標(biāo)記。然而，五個(gè)(5)微衛(wèi)星標(biāo)記是優(yōu)選的。具有至少三個(gè)(3)微衛(wèi)星標(biāo)記，等位基因的丟失(ADO)和優(yōu)選擴(kuò)增就不會(huì)很大程度上干擾到結(jié)果，因?yàn)槿绻粋€(gè)基因座標(biāo)記被影響，其它的保留用于最后的診斷。優(yōu)選地，五個(gè)多態(tài)性標(biāo)記被擴(kuò)增。
貫穿本說明書的描述和權(quán)利要求，詞語“包含”以及該詞時(shí)態(tài)的變化，并不是要排除其它的添加劑、成分、整體或步驟。
等位基因分布圖提供了鑒定非整倍性和胎兒起源的手段。通過多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別的各種等位基因的比提供了可鑒別為各種類型的非整倍性中的任何一種的等位基因模式，該非整倍性包括，但不限于三體性、二體性和單體性。
通過多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記可使用各種方法檢測等位基因。其它的方法包括限制性片段多態(tài)性(RFLP’s)、單核苷酸多態(tài)性(SNP’s)和微陣列。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通過多態(tài)性標(biāo)記的擴(kuò)增確定等位基因分布圖而產(chǎn)生等位基因分布圖。等位基因分布圖可提供具體的非整倍性的指示，該非整倍性包括但不限于單體性、二體性或三體性。例如，因?yàn)樵u(píng)估在FL-PCR擴(kuò)增中產(chǎn)生的DNA的量與最初的靶序列的量成比例，任何具體的基因座位的等位基因的比可從最終的熒光產(chǎn)量計(jì)算得出(從第一個(gè)等位基因得到的PCR產(chǎn)物的量被第二個(gè)等位基因的產(chǎn)物的量分開)。因此，二體性可通過預(yù)期的1∶1的二等位基因比確定，而三體性可確定為三等位基因模式和預(yù)期的1∶1∶1的比。單體性的診斷可能需要所有5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記以顯示單一的等位基因，同時(shí)三體性可通過一個(gè)標(biāo)記的至少一個(gè)三等位基因模式得到最終的診斷。
本文使用的術(shù)語“擴(kuò)增”包括本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員已知的，提高核酸或其部分的拷貝數(shù)量的任何方法。核酸擴(kuò)增可通過本領(lǐng)域已知的任何核酸擴(kuò)增方法完成，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。各種形式的PCR包含于本發(fā)明的范圍中，包括多重FL-PCR。本領(lǐng)域已知各種擴(kuò)增方法并描述于“聚合酶鏈反應(yīng)”(The polymerase chainreaction)Baumforth等，Journal of Clinical PathologyMolecular Pathology1999，(52)1-10。
可以使用本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的方法分析擴(kuò)增的核酸，并產(chǎn)生分布圖，所述方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，優(yōu)選地使用變性凝膠?？墒褂米詣?dòng)化的或手動(dòng)方法進(jìn)行分析，例如自動(dòng)化分析可包括使用ABI Prism 377 DNA測序儀并結(jié)合Genescan 672軟件(Biosystems澳大利亞提供)。其它自動(dòng)化分析包括ABI Prism3100遺傳分析儀(Genetic Analyzer)和變性高效液相色譜(DHPLC)。
本文使用的術(shù)語“引物”包括短的核酸，優(yōu)選DNA寡核苷酸15核苷酸或更長，它可退火成為，例如，通過核酸雜交形成互補(bǔ)靶DNA鏈，以在引物和靶DNA鏈之間形成雜合體，然后通過聚合酶沿著靶DNA鏈延伸，優(yōu)選地使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶?？墒褂靡飳?duì)擴(kuò)增核酸，例如通過PCR或通過本領(lǐng)域熟知的其它核酸擴(kuò)增方法。PCR-引物對(duì)可從核酸序列獲得，并根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，大約50％的GC含量，長度為18-24個(gè)堿基對(duì)，形成最小的引物-二聚體和自我退火，在引物的3’末端有2個(gè)G或C堿基，正向和反向引物具有相同的長度(+/-1個(gè)核苷酸)，一列中不超過三個(gè)重復(fù)的堿基，且PCR產(chǎn)物的大小長度在100-400個(gè)核苷酸之間。
文獻(xiàn)中描述了制備和使用引物的方法，例如Sambrook等，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(Molecular CloningA Laboratory manual)，第二版，1-3卷；Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA 1989；“分子生物學(xué)現(xiàn)狀”(Current Protocols in Molecular Biology)，Asubel等，GreenePublishing and Wiley-Interscience，NY，USA 1987。
最優(yōu)選地，本方法包括通過DNA指紋確定多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了產(chǎn)前診斷的方法，所述方法包括
如本文所述從子宮頸粘液樣品獲得胎兒細(xì)胞；在染色體上鑒別至少三個(gè)(3)表示胎兒特征的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖；和將等位基因分布圖與產(chǎn)前診斷癥狀聯(lián)系起來。
本文使用的術(shù)語“產(chǎn)前診斷”包括確定遺傳突變的存在或胎兒細(xì)胞中的任何生化或代謝鑒定。產(chǎn)前診斷旨在鑒別所有類型的胎兒異常。遺傳突變包括，但不僅限于染色體非整倍性、點(diǎn)突變、易位、三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展、倒位、多態(tài)性、插入和缺失。遺傳突變可引起基因疾病，例如囊性纖維化、β地中海貧血、亨庭頓病、脆性X綜合癥、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良、杜興氏肌營養(yǎng)不良或鐮狀細(xì)胞貧血。
產(chǎn)前診斷可包括遺傳疾病，其發(fā)生是由于染色體異常。染色體異常包括最頻繁的染色體21、18、13、X和Y，并發(fā)現(xiàn)于活產(chǎn)的嬰兒中。其它非整倍性通常在著床前或早在懷孕的頭三個(gè)月遺漏，然而用早期非侵入性方法診斷所有23對(duì)染色體的非整倍性可指用多重FL-PCR或微陣列完成。遺傳疾病包括，但不僅限于特納氏綜合癥(XO)、克蘭費(fèi)而特綜合癥(XXY)、XXX女性和XYY男性、三倍性(69、XXX或XXY或XYY)、帕韜氏綜合癥(三體性13)和愛德華氏綜合癥(三體性18)。唐氏綜合癥(三體性21)也可通過本方法檢測。優(yōu)選地，產(chǎn)前診斷可檢測非整倍性形式的染色體異常。產(chǎn)前診斷也可包括由特異性基因突變引起的單基因疾病。最常見的疾病是囊性纖維化?？稍?500個(gè)嬰兒中發(fā)現(xiàn)一例囊性纖維化，并且25人中有1人是這種常染色體隱性條件的攜帶者。
本發(fā)明優(yōu)選的一個(gè)方面提供了診斷唐氏綜合癥的方法，所述方法包括通過如下方法鑒定染色體非整倍性，所述方法包括獲得胎兒細(xì)胞；鑒定染色體上至少三個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖；確定染色體21的三體性。
目前，向小于35歲的孕婦提供了一系列的非診斷性的血清篩選測試用于唐氏綜合癥胎兒的檢測。這些測試包括測定已鑒定與唐氏綜合癥胎兒有關(guān)的變量的范圍，所述變量包括在12周的超聲檢查中測定胎兒頸后液體累積的量(頸的厚度)、在懷孕頭三個(gè)月的母體血液中游離-βhCG和與妊娠有關(guān)的血漿蛋白-A(PAPP-A)的濃度以及在懷孕中三個(gè)月的母體血液中游離-β hCG和a-胎兒球蛋白(AFP)的濃度。從結(jié)合的試驗(yàn)結(jié)果可計(jì)算出具有80-90％的檢測效率和5-10％的假陽性比率的患者的特異性風(fēng)險(xiǎn)。然而，這些篩選試驗(yàn)是非診斷性的，并且一個(gè)否定的結(jié)果并不表示胎兒沒患有唐氏綜合癥。目前，近80％的患有唐氏綜合癥的活產(chǎn)嬰兒是由35歲以下的母親生產(chǎn)的。
可從上面描述的任何來源獲得胎兒細(xì)胞。優(yōu)選該細(xì)胞是從懷孕婦女的經(jīng)子宮頸的的棉拭或頸管的抽吸物獲得的胎兒細(xì)胞。這對(duì)于非侵入性的診斷方法是理想的。
在本方法中，染色體21的三體性是唐氏綜合癥的指示物。
使用至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行本方法。然而，使用至少五個(gè)(5)標(biāo)記是優(yōu)選的。染色體21上的四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記是高度雜合的，并且它具有廣泛分布的等位基因大小，這特別適用于本發(fā)明。
對(duì)于唐氏綜合癥，選擇產(chǎn)生獨(dú)特的等位基因分布圖或不具有任何熒光或大小重疊的模式的標(biāo)記物是優(yōu)選的。關(guān)于唐氏綜合癥的優(yōu)選的診斷見表2。
雖然本方法需要至少三個(gè)(3)微衛(wèi)星標(biāo)記，優(yōu)選地選自表2，最佳的是使用五個(gè)(5)標(biāo)記診斷唐氏綜合癥。
在本系統(tǒng)中包含五個(gè)(5)微衛(wèi)星標(biāo)記，等位基因的丟失和優(yōu)先的擴(kuò)增不干擾結(jié)果，這是因?yàn)槿绻粋€(gè)基因座位的標(biāo)記受影響，還有余下的四個(gè)用于最終的診斷。確定等位基因分布圖的方法可使用產(chǎn)生可表示由多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記代表的等位基因的模式的任何方法。優(yōu)選地，等位基因分布圖通過標(biāo)記的DNA擴(kuò)增確定，優(yōu)選地使用PCR，更佳地使用FL-PCR。
本文描述了分析PCR產(chǎn)物的方法。
一旦建立了等位基因分布圖，如上所述，對(duì)于總的DNA可鑒別其非整倍性，以此確定的用于唐氏綜合癥的它們各自的等位基因比和大小見圖2，圖3是染色體13、18、21和X的非整倍性。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于診斷唐氏綜合癥的方法的微衛(wèi)星標(biāo)記，所述標(biāo)記具有一個(gè)正向引物序列，所述正向引物序列選自-tatgtgagtcaattccccaagtga；-atgatgaatgcatagatggatg；-ttgcagggaaaccacagtt；-tgaacatacatgtacatgtgtctgg；或-cactgcagacggcatgaacttc.
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于診斷唐氏綜合癥的方法的微衛(wèi)星標(biāo)記，所述標(biāo)記具有一個(gè)反向引物序列，所述反向引物序列選自
-gttgtattagtcaatgttctccag；-aatgtgtgtccttccaggc；-tccttggaataaattcccgg；-ttctctacatatttactgccaacac；或-ccagaatcacatgagccaattcc.
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，提供了用于診斷唐氏綜合癥的方法的微衛(wèi)星標(biāo)記，其中所述標(biāo)記是選自表2中所述的任何一個(gè)標(biāo)記。這些標(biāo)記中的任何一個(gè)可與至少兩個(gè)(2)其它適當(dāng)?shù)臉?biāo)記組合使用，用于根據(jù)本發(fā)明描述的方法診斷三體性21。另外，可設(shè)計(jì)引物序列與多重FL-PCR中的其它引物序列互補(bǔ)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于產(chǎn)前診斷的試劑盒，所述試劑盒包括至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，用于在胎兒細(xì)胞的染色體中鑒別染色體非整倍性的方法，所述方法包括獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；和確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
優(yōu)選地，如本文所述從子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，所述試劑盒進(jìn)一步含有在胎兒細(xì)胞的特異性染色體上鑒別多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的手段，這樣獲得等位基因分布圖。
在另一個(gè)方面中，所述試劑盒包括擴(kuò)增多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的方法，優(yōu)選地使用PCR，更佳地使用FL-PCR。本文描述了擴(kuò)增標(biāo)記的方法。
在一個(gè)優(yōu)選的方面中，提供了用于診斷唐氏綜合癥的試劑盒，其中標(biāo)記選自上述用于唐氏綜合癥的任何標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了證實(shí)胎兒細(xì)胞的起源的方法，所述細(xì)胞取自個(gè)體的子宮頸粘液樣品，所述方法包括從同一個(gè)體獲得胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞；選擇胎兒或母體細(xì)胞的至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記特征；和在胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞上確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
優(yōu)選地，從一個(gè)個(gè)體證實(shí)胎兒細(xì)胞起源的方法包括鑒定母體細(xì)胞和胎兒細(xì)胞的染色體中染色體的非整倍性。
另外，由于胎兒細(xì)胞從子宮頸分離，這一非侵入性方法還可檢測引起單基因疾病的突變，例如囊性纖維化。
結(jié)合單基因疾病的突變檢測和DNA指紋分析系統(tǒng)，并提供給孕婦染色體非整倍性和指示性的單基因疾病的診斷也是可能的(參見圖3)。
包含于本說明書中的文獻(xiàn)、事實(shí)、材料、設(shè)備、論文等的討論僅僅是為了提供本發(fā)明的范圍。并不表示或代表由于在本申請(qǐng)的各項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日前它已存在于澳大利亞，任何或全部這些內(nèi)容形成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分，或在與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中是常見的一般的知識(shí)。
現(xiàn)在本發(fā)明將參照如下的實(shí)施例進(jìn)行更全面的描述。但是，應(yīng)當(dāng)理解下文的描述僅僅是舉例說明，不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明上文描述的普遍性。
實(shí)施例實(shí)施例1唐氏綜合癥的診斷(a)經(jīng)子宮頸的細(xì)胞的收集和制備在頭三個(gè)月或中三個(gè)月中，從孕婦體內(nèi)收集經(jīng)子宮頸的的細(xì)胞與pap涂片的過程相似，并包括使用一個(gè)細(xì)的導(dǎo)管(catheder)(Aspiracath，Cook IVF)從子宮頸內(nèi)管和較低的子宮極直接吸取子宮頸粘液。切下含有母體粘液和經(jīng)子宮頸的細(xì)胞的導(dǎo)管頂端，放入含有0.5ml RPMI培養(yǎng)基的微量離心管中，并放置于37℃。輕輕地將內(nèi)容物從導(dǎo)管的內(nèi)部頂端取出并于37℃懸浮于培養(yǎng)基中。
(b)從經(jīng)子宮頸的樣品中鑒別和分離胎兒細(xì)胞。
收集后，用0.5ml、20mg/ml的N-乙酰-L-半胱氨酸處理樣品，并在37℃輕微搖動(dòng)，進(jìn)一步培養(yǎng)45分鐘。然后，在用0.5ml的酶混合物(膠原酶和蛋白酶)在37℃培養(yǎng)1小時(shí)前，整個(gè)樣品在PBS中洗滌兩次。在培養(yǎng)過程中，除去分離的細(xì)胞，用新鮮的酶處理原來樣品中余下的部分。全部分離后，細(xì)胞懸浮物用PBS洗滌兩次，之后用免疫熒光標(biāo)記。
在37℃，用熒光標(biāo)記的三種胎兒特異性抗體的混合物(NDOG1、NDOG5和FT1.41.1)加入細(xì)胞懸浮液，并使之僅與胎兒細(xì)胞的細(xì)胞膜特異性地結(jié)合。NDOG1使懷孕頭三個(gè)月的合胞滋養(yǎng)層著色，NDOG5使合胞滋養(yǎng)層和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞柱著色，F(xiàn)T1.41.1使合胞滋養(yǎng)層和絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層著色。這些抗體都不與母體的子宮內(nèi)膜或子宮頸組織發(fā)生反應(yīng)。在倒置顯微鏡下，使用延長的玻璃吸管進(jìn)行顯微操作和顯微解剖技術(shù)，鑒別和分離單個(gè)和小塊狀的熒光標(biāo)記的胎兒細(xì)胞，并在PBS緩沖液中洗滌三次，之后轉(zhuǎn)移到0.2ml的PCR管中進(jìn)行分析。作為一個(gè)負(fù)控制，還分離了母體的鱗狀上皮細(xì)胞并將其在PBS緩沖液中洗滌三次，之后轉(zhuǎn)移到0.2ml的PCR管中進(jìn)行分析。
(c)胎兒起源的證實(shí)和染色體21三體性的診斷多重FL-PCR反應(yīng)與發(fā)現(xiàn)于染色體21上的五個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合。從所述多重FL-PCR產(chǎn)生的等位基因分布圖證實(shí)母體或胎兒的起源，以及染色體21是否存在。FL-PCR反應(yīng)包括2.5μl的10×PCR緩沖液(500mM KCL，100mM Tris-HCl，pH 9.0和15mM MgCl2)，0.5μl的10mM dNTPs(200μM)，0.3μl的Taq聚合酶(5單位/μl)，11.20μl MQ-H2O和10.5μl的引物混合液，使最終體積為25μl。在各個(gè)PCR反應(yīng)中，引物對(duì)包括D21S1411、D21S11、D21S1413、D21S1442和D21S1437。所有經(jīng)歷手工“Hot Start”和多重FL-PCR的反應(yīng)混合物使用9700 Thermocycler PCR儀器(購自Biosystems，澳大利亞)進(jìn)行。進(jìn)行35次熱循環(huán)反應(yīng)，包括在94℃變性45秒，在60℃退火45秒，在72℃延伸1分鐘。當(dāng)進(jìn)行各個(gè)單個(gè)細(xì)胞的多重FL-PCR時(shí)，還包括正、負(fù)控制，以確?；旌系腜CR反應(yīng)是可操作的，且沒有一種反應(yīng)物被污染。
其它實(shí)施例包括唐氏綜合癥和常見的囊性纖維化δF508突變的同時(shí)診斷。如上所述的FL-PCR進(jìn)行如下改變引物混合物含有四種信息染色體21微衛(wèi)星標(biāo)記以及用于δF508突變檢測的引物對(duì)。
(d)胎兒起源的讀出和染色體21三體性的診斷使用ABI Prism 3100 DNA測序儀和附帶的Genescan 672軟件(購自Biosystems，澳大利亞)分析所有的FL-PCR產(chǎn)物。各個(gè)PCR產(chǎn)物(0.5-1.0μl)與9.75μl的甲酰胺和0.25μl的內(nèi)標(biāo)物混合。樣品在95℃變性5分鐘，放置于冰上且將其10μl裝入96孔平板。使樣品經(jīng)受動(dòng)電注射和通過Genescan軟件進(jìn)行自動(dòng)測量的電泳。由于染色的峰值取決于使用的熒光染料，產(chǎn)生的基因掃描分布圖或“指紋”顯示了PCR產(chǎn)物(見

圖1-一個(gè)唐氏綜合癥患者的單個(gè)細(xì)胞的等位基因分布圖)。
微陣列也可用于證實(shí)胎兒的起源、單基因疾病和染色體異常的診斷。在一個(gè)單一的微陣列上，可以使用單核苷酸多態(tài)性(SNP’s)、單基因疾病和染色體異常鑒別胎兒細(xì)胞。使用這一方法分離和鑒別的單個(gè)胎兒細(xì)胞將首先通過PEP-PCR、DOP-PCR、連接體-適配器-PCR或MSDWGA進(jìn)行整個(gè)基因組的擴(kuò)增(WGA)。從WGA獲得的熒光標(biāo)記產(chǎn)物可與微陣列平臺(tái)雜交，且結(jié)合的熒光性的激光掃描將證實(shí)胎兒的起源和所有23對(duì)人類染色體的染色體非整倍性的診斷以及鑒定任何特異性的單基因缺陷。
實(shí)施例2唐氏綜合癥II的診斷
(a)如實(shí)施例1所描述的進(jìn)行經(jīng)子宮頸的細(xì)胞的收集和制備。
(b)胎兒細(xì)胞的鑒別和分離收集后，樣品鋪于載玻片上并用100％的乙醇固定。使用前三個(gè)月的胎兒特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以鑒別胎兒細(xì)胞。然后使載玻片脫水。使用激光捕獲顯微解剖術(shù)從載玻片上除去陽性染色的細(xì)胞并放置于膜上，它可直接轉(zhuǎn)移到PCR管中。
(c，d和e)隨后如實(shí)施例1所述進(jìn)行用于染色體21的三體性的FL-PCR DNA指紋分析和FL-PCR產(chǎn)物的分析以及非整倍性的診斷。
實(shí)施例3唐氏綜合癥和囊性纖維化δF508突變的同時(shí)診斷(a&b)如實(shí)施例1中所述收集和制備經(jīng)子宮頸的細(xì)胞，并隨后鑒別和分離胎兒細(xì)胞。
(c)染色體21的三體性FL-PCR DNA指紋分析和囊性纖維化δF508突變的診斷。
上述的FL-PCR反應(yīng)進(jìn)行如下改變引物混合液含有四種信息染色體21微衛(wèi)星標(biāo)記以及用于δF508突變檢測的引物對(duì)。概括于表2和3中的微衛(wèi)星標(biāo)記是雙親基因組DNA的基因型，以鑒別雜合的基因座位，用于結(jié)合入DNA指紋分析系統(tǒng)。最終優(yōu)化的引物對(duì)濃度是反應(yīng)和引物特有的。
(d&e)如上所述進(jìn)行FL-PCR產(chǎn)物的分析非整倍性的診斷(見圖3)。
最后，應(yīng)當(dāng)理解可以進(jìn)行各種其它的修飾和/或改變，而不背離本文中概括的本發(fā)明的精神。
表1-非整倍性妊娠的詳細(xì)情況表2-四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記的詳細(xì)情況
表3鑒別的四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記用于DNA指紋分析和染色體13、18、21、X和Y的非整倍性診斷
權(quán)利要求
1.一種從子宮頸粘液樣品中提取細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括獲得子宮頸粘液樣品；用膠原酶和蛋白酶處理樣品以從子宮頸粘液樣品中分離細(xì)胞；和從樣品中提取分離的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述子宮頸粘液樣品是經(jīng)子宮頸的樣品。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述子宮頸粘液樣品從子宮頸區(qū)域獲得，所述子宮頸區(qū)域包括子宮頸內(nèi)管和較低的子宮極。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述子宮頸粘液樣品在妊娠頭三個(gè)月或中三個(gè)月獲得。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述子宮頸粘液樣品用膠原酶和蛋白酶以及分離酶混合酶的組合處理。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括用粘液溶解劑處理子宮頸粘液樣品。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述子宮頸粘液樣品在用膠原酶和蛋白酶處理前用粘液溶解劑處理。
8.一種用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制備的分離的細(xì)胞。
9.一種從子宮頸粘液樣品中提取胎兒細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括獲得用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制備的分離細(xì)胞的混合物；用胎兒抗體處理所述細(xì)胞；鑒別與胎兒抗體結(jié)合的細(xì)胞；和提取鑒別的細(xì)胞。
10.一種鑒別胎兒細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括獲得用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制備的分離細(xì)胞的混合物；用胎兒特異性抗體處理所述細(xì)胞；和鑒別與胎兒抗體結(jié)合的細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述胎兒抗體是頭三個(gè)月的胎兒的特異性抗體。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗體單獨(dú)使用或與另一種抗體結(jié)合使用以鑒別胎兒細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述一種或多種抗體用于鑒別胎兒細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求9-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述胎兒細(xì)胞通過與母體對(duì)照比較微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)一步鑒別，其中所述胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞共用一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述微衛(wèi)星標(biāo)記通過正向引物序列鑒別，所述正向引物序列選自-tatgtgagtcaattccccaagtga；-atgatgaatgcatagatggatg；-ttgcagggaaaccacagtt；-tgaacatacatgtacatgtgtctgg；或-cactgcagacggcatgaacttc。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述微衛(wèi)星標(biāo)記通過反向引物序列鑒別，所述反向引物序列選自-gttgtattagtcaatgttctccag；-aatgtgtgtccttccaggc；-tccttggaataaattcccgg；-ttctctacatatttactgccaacac；或-ccagaatcacatgagccaattcc。
17.一種用權(quán)利要求9或11-16中任一項(xiàng)所述方法制備的胎兒細(xì)胞。
18.一種鑒別胎兒細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括獲得細(xì)胞樣品；用選自本文所描述的NDOG1、NDOG5和FT1.41.1的抗體或其等價(jià)物處理細(xì)胞樣品；和鑒別與抗體結(jié)合的細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗體單獨(dú)使用或組合使用以鑒別胎兒細(xì)胞。
20.一種用于鑒別胎兒細(xì)胞的組合物，其特征在于，所述組合物含有抗體NDOG1、NDOG5和FT1.41.1。
21.一種表征胎兒細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括從用權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述方法制備的子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞；用選自以下的方法處理胎兒細(xì)胞(a)多重FL-PCR；(b)WGA、雜交和微陣列分析；或(c)mRNA、cDNA文庫的提取，雜交和基因表達(dá)微陣列分析；和分析處理結(jié)果以表征所述細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述胎兒細(xì)胞的特征為生化、代謝或遺傳異常。
23.一種在胎兒細(xì)胞的染色體中鑒別染色體非整倍性的方法，其特征在于，所述方法包括從用權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述方法制備的子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；和確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述等位基因分布圖通過5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記中的一個(gè)或多個(gè)加以確定。
25.一種產(chǎn)前診斷的方法，其特征在于，所述方法包括從用權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述方法制備的子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞；鑒別染色體上至少三個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖；和使等位基因分布圖與產(chǎn)前診斷癥狀相關(guān)聯(lián)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述產(chǎn)前診斷包括確定胎兒細(xì)胞中遺傳突變的存在，其中所述遺傳突變選自染色體非整倍性、點(diǎn)突變、易位、三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展、插入和缺失。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述遺傳突變與疾病相關(guān)，所述疾病選自囊性纖維化、β地中海貧血、亨庭頓病、脆性X綜合癥、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良、杜興氏肌營養(yǎng)不良、鐮狀細(xì)胞貧血、特納氏綜合癥(XO)、克蘭費(fèi)而特綜合癥(XXY)、XXX女性和XYY男性、三倍性(69、XXX或XXY或XYY)、帕韜氏綜合癥(三體性13)和愛德華氏綜合癥(三體性18)或唐氏綜合癥(三體性21)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述染色體非整倍性發(fā)生在選自染色體21、18、13、X和Y的人類染色體。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述等位基因分布圖顯示染色體21的三體性。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述遺傳疾病是唐氏綜合癥。
31.如權(quán)利要求23-30中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述微衛(wèi)星標(biāo)記包括正向引物序列，所述正向引物序列選自-tatgtgagtcaattccccaagtga；-atgatgaatgcatagatggatg；-ttgcagggaaaccacagtt；-tgaacatacatgtacatgtgtctgg；或-cactgcagacggcatgaacttc。
32.如權(quán)利要求23-31中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述微衛(wèi)星標(biāo)記包括反向引物序列，所述反向引物序列選自-gttgtattagtcaatgttctccag；-aatgtgtgtccttccaggc；-tccttggaataaattcccgg；-ttctctacatatttactgccaacac；或-ccagaatcacatgagccaattcc。
33.如權(quán)利要求23-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括使用選自表2所列標(biāo)記的微衛(wèi)星標(biāo)記。
34.一種證實(shí)個(gè)體細(xì)胞胎兒起源的方法，所述方法包括從用權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述方法制備的子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞，并從同一個(gè)體獲得母體細(xì)胞；選擇表示胎兒或母體細(xì)胞特征的至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記；和在胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞上確定至少三個(gè)(3)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分布圖。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述證實(shí)個(gè)體細(xì)胞胎兒起源的方法包括鑒別母體細(xì)胞和胎兒細(xì)胞染色體的染色體非整倍性。
36.一種檢測單基因疾病的方法，其特征在于，所述方法包括從用權(quán)利要求9-16中任一項(xiàng)所述方法制備的子宮頸粘液樣品中獲得胎兒細(xì)胞；和檢測胎兒細(xì)胞的基因突變。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述單基因疾病選自囊性纖維化、β地中海貧血、亨庭頓病、脆性X綜合癥、肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良、杜興氏肌營養(yǎng)不良和鐮狀細(xì)胞貧血。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述遺傳疾病是囊性纖維化。
39.一種如實(shí)施例1或2所描述的提取如權(quán)利要求1所述細(xì)胞的方法。
40.一種如實(shí)施例1或2所描述的提取如權(quán)利要求9所述細(xì)胞的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及提取和鑒別細(xì)胞，具體是胎兒細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的非侵入性方法。本發(fā)明包括使用細(xì)胞鑒別染色體異常和突變的方法，具體用于通過進(jìn)行染色體和單基因疾病的遺傳診斷進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本發(fā)明還包括證實(shí)細(xì)胞胎兒起源的方法。
文檔編號(hào)C12S3/24GK1582341SQ02822118
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2002年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者M·G·凱茨, D·S·克蘭姆 申請(qǐng)人:莫拿什大學(xué), 莫拿什Ivf控股有限公司