專利名稱：一種分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，具體地，涉及ー種分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
原代細(xì)胞作為ー種體外模型，在基因功能研究方面有其突出的優(yōu)點可同時獲得大量性狀較均一的樣本；與生物體內(nèi)情況基本保持一致，可以在接近生理狀態(tài)的情況下研究基因的表達；排除許多復(fù)雜因素干擾，如神經(jīng)、激素的干擾；原代肝細(xì)胞具有較好的體 外實驗重現(xiàn)性，基本維持了肝臟的代謝功能，特別是很好的保留了與體內(nèi)一致的細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450)的水平，基本保留肝臟原有的代謝功能和細(xì)胞分化狀態(tài)。肝細(xì)胞Ofepatocytes)是肝臟最主要的實質(zhì)細(xì)胞類型，生理狀況下占60 %，屬于高度分化的多功能、實質(zhì)性臟器細(xì)胞。肝細(xì)胞既能高度分化，又能很快進入細(xì)胞周期而增殖，在體外培養(yǎng)體系中，根據(jù)研究目的的不同，既有支持其増殖的培養(yǎng)體系，也有支持其分化的培養(yǎng)體系。肝細(xì)胞離體后，在不適宜的環(huán)境中很快出現(xiàn)肝細(xì)胞衰老和失功能，PH值不適合、無激素支持導(dǎo)致細(xì)胞死亡，基因的激活造成細(xì)胞凋亡等。原代肝細(xì)胞在一般培養(yǎng)條件下，幾小時內(nèi)便喪失其縫隙連接，幾天內(nèi)喪失其組織特異性代謝活動?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的肝細(xì)胞分離方法是灌流法，傳統(tǒng)灌流法操作環(huán)節(jié)多，時間長，肝細(xì)胞容易損傷，活力低、效率低，純度不高。因此，迫切需要制備體外培養(yǎng)活力旺盛、功能良好的豬肝臟原代細(xì)胞以滿足細(xì)胞生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)等研究的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法，以克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷。本發(fā)明提供的分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法，包含以下步驟(I)從肝臟的肝門靜脈輸入灌流液；所述的灌流液，其IL配方為NaCl 8-9. 4g，KCl O. 2-0. 4，HEPES 2. 4-4. 8g,雙蒸水定容至 1L, pH 值 7. 2-7. 4 ；(2)輸入膠原酶灌流溶液，肝組織呈龜背狀裂開后，停止灌流；(3)將消化成熟的肝臟浸泡于膠原酶溶液中；(4)加清洗液終止消化，過濾，收集肝細(xì)胞懸液；(5)離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。所述步驟I)的肝臟為新鮮采集的離體肝臟，或新鮮離體肝臟經(jīng)肝門靜脈以80-100ml/min速度注射3倍以上肝體積的0_4°C預(yù)冷UW液，肝溫降至10°C以下，保持1_4°C離體3h之內(nèi)的肝臟。當(dāng)肝溫降至10°C以下后，可將肝臟置于冰盒或其他能夠保持1_4°C的容器中保存肝臟不超過3h。本發(fā)明方法采用蠕動泵進行灌流，用無菌PBS排空蠕動泵管道內(nèi)氣泡。其中所述步驟(I)是以恒溫37で灌流液開放灌流10-15min,流速50-60ml/min。其中所述步驟(2)膠原酶灌流溶液灌流流速50-60ml/min。
其中所述步驟(2)的膠原酶灌流液，其IL配方為NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g，CaCl2O. 10-0. 15g，II 型或 IV 型膠原酶 0. 5g，雙蒸水定容至1L。其中所述步驟⑶浸泡時間為5-10min。其中所述步驟(4)清洗液配方為NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g，HEPES 2. 4-4. 8g，Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g，雙蒸水定容至 IL0其中所述步驟(4)過濾是將肝臟細(xì)胞懸液通過兩層紗布和兩層細(xì)胞篩，紗布和細(xì)胞篩均用清洗液浸潤，所述細(xì)胞篩上層100目，下層200目。本發(fā)明分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞所用幾種溶液的配方見表I。表I灌流液，膠原酶灌流液，清洗液配方表
權(quán)利要求
1.一種分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法，包含以下步驟 1)從離體肝臟的肝門靜脈輸入灌流液，所述的灌流液，其IL配方為NaCl8-9. 4g,KCl0.2-0. 4，HEPES 2. 4-4. 8g，雙蒸水定容至 1L，pH 值 7. 2-7. 4 ； 2)輸入膠原酶灌流液，肝組織呈龜背狀裂開后，停止灌流； 3)將消化成熟的肝臟浸泡于膠原酶灌流液中； 4)加清洗液終止消化,過濾,收集肝細(xì)胞懸液； 5)離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)的肝臟為新鮮采集的離體肝臟；或新鮮離體肝臟經(jīng)肝門靜脈以80-100ml/min速度注射3倍以上肝體積的0-4°C預(yù)冷UW液，肝溫降至10°C以下，保持1_4°C離體3h之內(nèi)的肝臟。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)是以恒溫37°C灌流液開放灌流10-15min,流速 50-60ml/mino
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)膠原酶灌流液灌流流速50_60ml/mino
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)的膠原酶灌流液，其IL配方為NaCl 8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g, HEPES 2. 4-4. 8g, Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g, II 型或IV型膠原酶0. 5g，雙蒸水定容至1L。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟3)浸泡時間為5-10min。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟4)清洗液配方為NaCl8-9. 4g，KCl 0. 2-0. 4g, HEPES 2. 4-4. 8g, Na2HPO4O. 5-0. 6g, CaCl2O. 10-0. 15g，雙蒸水定容至 1L。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟4)過濾是將肝臟細(xì)胞懸液通過兩層紗布和兩層細(xì)胞篩，紗布和細(xì)胞篩均用清洗液浸潤，所述細(xì)胞篩上層100目，下層200目。
9.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟5)離心是將肝細(xì)胞濾液分別加入離心管中，400rpm,3min,棄上清,按與沉淀的體積比5_8 I加入權(quán)利要求7所述的清洗液，再次離心500rpm, 3min,棄上清。
10.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟5)中完全培養(yǎng)基其配方為含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基添加終濃度為200-600U/ml青霉素，20-60 u g/ml鏈霉素，1% -2%二甲基亞砜，l-10mg/L胰島素，l-10mmol/L尼克酰胺,0. 1-lmmol/L抗壞血酸，用IM的NaHCO3 調(diào)節(jié) pH 至 I. 2-7. 4。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離培養(yǎng)肝臟原代細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)從肝臟的肝門靜脈輸入灌流液；2)輸入膠原酶灌流液；3)將消化成熟的肝臟浸泡于膠原酶灌流液中；4)加清洗液終止消化，過濾，收集肝細(xì)胞懸液；5)離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)。本發(fā)明方法操作簡單，成本低，穩(wěn)定高效，肝細(xì)胞得率高，活力高，易貼壁。此法可在實驗室推廣，成為科學(xué)研究的常規(guī)方法。
文檔編號C12N5/071GK102634480SQ20121008369
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月27日
發(fā)明者方美英, 白瑩, 董新星, 陳剛, 陳潔 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)