專利名稱：從蠅蛆中提取分離具有體外抗腫瘤作用的有效組份的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類抗腫瘤化合物，特別適用于抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖生長的從蠅蛆中提取分離具有體外抗腫瘤作用的有效組份不飽和脂肪酸。
背景技術：
據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計，近年來我國每年新增腫瘤患者160-170萬，主要類型有胃癌(23.02％)、肝癌(17.83％)、肺癌(15.19％)、食管癌(15.02％)、白血病(3.53％)等。其中白血病是一種造血組織的惡性疾病，隨著環(huán)境污染日益加重，白血病患者已越來越多，目前我國至少有400萬白血病患者，且以每年3-4萬速度增加，嚴重危害著人類健康。同時據(jù)衛(wèi)生部全國腫瘤防治研究辦公室的一項統(tǒng)計顯示，過去5年，中國的肺癌病患者增加了約12萬；發(fā)病年齡每5年降低1歲；每4個癌癥死亡者中就有1人是肺癌患者。如不控制吸煙和空氣污染，中國每年肺癌患者將超過100萬人，成為世界第一“肺癌大國”，因此尋找抗白血病和肺癌的低毒高效藥物已成為刻不容緩的工作。
隨著癌癥發(fā)病率的持續(xù)上升，我國惡性腫瘤治療藥物的市場規(guī)模也迅猛增長。其中天然抗腫瘤藥物尤其受腫瘤患者的青睞，如康萊特、欖香烯、三尖杉酯堿、云芝多糖、香菇多糖等?？鼓[瘤研究已成為目前科研的熱點，對高效、無毒的抗腫瘤藥物的開發(fā)也成為必然趨勢，尤其天然抗腫瘤藥物研究已是我國重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目之一，患者也希望能使用毒副作用較小，對腫瘤細胞敏感的純天然藥物。
蠅蛆是一種新的、廉價的、必需氨基酸含量全面，可開發(fā)的前景資源。常用于治療小兒疳積，隨著現(xiàn)代天然藥物研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)蠅蛆還具有抗菌、消炎、活化上皮細胞等功能，其體內的凝集素、抗菌肽等活性物質還具有抗菌、抗癌、抗病毒的作用。目前，對蠅蛆的研究受到了廣泛的關注。曹小紅等已從家蠅蛹中提取出具有抗菌和抗癌作用的凝集素，他們在對工程蠅蛆體內有效成分初步分離的基礎上，采用MTT法測定K562細胞的生長抑制率，通過倒置顯微鏡觀察K562細胞的形態(tài)變化的方法，對工程蠅蛆體內活性物質及體外抗腫瘤K562細胞作用進行了研究。實驗結果表明峰1組分半致死濃度IC50為100μg/mL，峰2組分半致死濃度IC50為80μg/mL。隨所添加活性物質濃度的增大，腫瘤細胞受抑制作用增強；活性物質作用于K562細胞前后其細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，受抑制細胞由一個完整細胞變?yōu)槎鄠€凋亡小體。因此，可以說明工程蠅蛆體內活性物質在體外對K562細胞具有抑制生長的作用。當前，家蠅抗菌肽對細菌和腫瘤細胞的作用機理研究的相對較多，文彩虹等人的研究表明含有抗菌肽的家蠅免疫血淋巴具有抗腫瘤作用主要是能引起肝癌細胞膜通透性增高，抑制能量代謝，抑制分裂增殖。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是從外源物質誘導的蠅蛆中提取分離具有抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖的有效組份一不飽和脂肪酸，使提取方法簡便，提取得到的組份高效無毒，具有抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖的作用，是天然資源中提取分離得到的極具開發(fā)潛力的抗腫瘤新藥。
本發(fā)明公開了一類抑制人癌腫瘤細胞增殖的不飽和脂肪酸，該組份從外源物質誘導的蠅蛆中提取、分離獲得，適用于抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖生長，當受試物濃度為250μg/ml時，外源物質誘導的蠅蛆干粉以及提取分離得到的不飽和脂肪酸體外抑制人原髓細胞白血病HL-60增殖生長的效果分別為25.5％與96.2％。抑制人肺腺癌A549細胞增殖生長的效果分別為26.8％與97.0％。結果證實，從外源物質誘導的蠅蛆中提取、分離獲得的不飽和脂肪酸對人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖生長的抑制率比未提取的原粉有顯著提高。
經(jīng)HP6890/5973 GC/MS聯(lián)用儀分析，其有效組份不飽和脂肪酸的含量為82.75％(面積歸一化法)，其中所含有的物質單體分別為十六碳一烯酸(C16:1)，十六碳二烯酸(C16:2)，十六碳三烯酸(C16:3)，十七碳一烯酸(C17:1)，十八碳一烯酸(C18:1)，十八碳二烯酸(C18:2)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，二十碳四烯酸(C20:4)，二十碳五烯酸(C20:5)及二十二碳六烯酸(C22:6)。
生物活性對本發(fā)明中分離得到的粗蛋白、粗脂肪和不飽和脂肪酸進行了體外抗腫瘤活性的評價試驗1.方法
1.1外源物質誘導的蠅蛆干粉有效組份分析1.2粗脂肪與粗蛋白的提取外源物質誘導的蠅蛆干粉，經(jīng)乙醚回流提取，提取物揮盡乙醚，得粗脂肪。剩余部分揮盡乙醚，得粗蛋白。
1.3不飽和脂肪酸的提取脂肪經(jīng)皂化反應后，用石油醚抽提除去非皂化物，皂化物再經(jīng)酸化和石油醚提取、濃縮得不飽和脂肪酸。
1.4體外腫瘤細胞增殖抑制試驗(MTT法)取對數(shù)生長期腫瘤細胞，調整細胞懸液濃度，每孔100μl細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種24小時后給藥(100μl/孔)，分別設空白對照組(只加培養(yǎng)液，無細胞和藥物，用于計算藥物抑制率時扣除培養(yǎng)板的吸光度)、細胞對照組、外源物質誘導的蠅蛆干粉以及提取物各5個劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培養(yǎng)液溶解)，37℃培養(yǎng)2～4小時，棄去各孔內液體后加入150μl酸化異丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定570nm處吸光度，計算受試藥物對HL-60和A549細胞增殖抑制率。
1.5小鼠口服急性毒性試驗依據(jù)食品安全性毒理學評價程序和方法(GB15193.1-2003)采用最大耐受量試驗法，選用18-20g體重的小鼠，雌雄各半各10只，受試物為外源物質誘導的蠅蛆中提取的不飽和脂肪酸，用食用油作溶劑配制成1mg/ml的溶液，以20ml/kg容量一次性灌胃，飼養(yǎng)觀察14天，動物不出現(xiàn)死亡，則認為受試物對某種動物的經(jīng)口急性毒性劑量大于某一數(shù)值(g/kg)。
2.結果2.1外源物質誘導的蠅蛆干粉基本成份分析結果，見表1表1外源物質誘導的蠅蛆干粉基本成份分析結果

2.2外源物質誘導的蠅蛆干粉脂肪酸成分分析，經(jīng)面積歸一化法計算，其結果見表2表2外源物質誘導的蠅蛆干粉脂肪酸成分分析結果

2.3外源物質誘導的蠅蛆干粉不飽和脂肪酸成分分析，經(jīng)面積歸一化法計算，其結果見表3表3外源物質誘導的蠅蛆干粉不飽和脂肪酸成分分析結果

詳見說明書附圖HP6890/5973 GC/MS聯(lián)用儀分析圖譜HP6890/5973 GC/MS聯(lián)用儀分析特種蠅蛆不飽和脂肪酸成分

Sum of corrected areas3221832004070117.D HE-2003.MThu Jan 18 15:24:15 2007
2.4外源物質誘導的蠅蛆干粉、粗脂肪、粗蛋白及不飽和脂肪酸抑制人白血病HL-60腫瘤細胞試驗結果，見表4表4外源物質誘導的蠅蛆干粉及分離提取物抑制人原髓細胞白血病HL-60增殖試驗結果

2.5外源物質誘導的蠅蛆干粉及不飽和脂肪酸抑制人A549肺癌細胞增殖試驗結果，見表5表5外源物質誘導的蠅蛆干粉及不飽和脂肪酸抑制人A549肺癌細胞增殖試驗結果

注表4、表5中YQ-1、YQ-2、YQ-3、YQ-4分別指蠅蛆干粉、粗脂肪、粗蛋白和不飽和脂肪酸2.6從外源物質誘導的蠅蛆中提取的不飽和脂肪酸，經(jīng)小鼠口服急性毒性試驗證實其LD50大于10g/kg，屬實際無毒。


圖1為有效組份之一十六碳一烯酸(C16:1)分析圖譜。
圖2為有效組份之一十六碳二烯酸(C16:2)分析圖譜。
圖3為有效組份之一十六碳三烯酸(C16:3)分析圖譜。
圖4為有效組份之一十七碳一烯酸(C17:1)分析圖譜。
圖5為有效組份之一十八碳一烯酸(C18:1)分析圖譜。
圖6、7為有效組份之一十八碳二烯酸(C18:2)分析圖譜。
圖8為有效組份之一二十碳二烯酸(C20:2)分析圖譜。
圖9為有效組份之一十碳三烯酸(C20:3)分析圖譜。
圖10為有效組份之一二十碳四烯酸(C20:4)分析圖譜。
圖11、12為有效組份之一二十碳五烯酸(C20:5)分析圖譜。
圖13為有效組份之一二十二碳六烯酸(C22:6)分析圖譜。
本發(fā)明的有效組份不飽和脂肪酸來源于外源物質誘導的蠅蛆，與先前大量報道的工程蠅蛆中的抗腫瘤成分主要是抗菌肽、凝集素、免疫蛋白是完全不同的一類物質，從而首次提出外源物質誘導的蠅蛆抗腫瘤的有效組份是不飽和脂肪酸。本發(fā)明提取方法簡便，提取得到的組份高效無毒，具有抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖的作用，是天然資源中提取分離得到的極具開發(fā)潛力的抗腫瘤新藥。
具體實施例方式
實施例1制備脂肪酸(1)外源物質誘導的蠅蛆經(jīng)20-80℃烘干、粉碎、過20-100目篩，稱取100g，以乙醚回流提取2-8小時，減壓回收溶劑，得乙醚提取物約30-35g，該提取物即為蠅蛆的混合脂肪酸。
實施例2制備脂肪酸(2)外源物質誘導的蠅蛆經(jīng)低溫冷凍干燥、粉碎、過20-100目篩，稱取100g，以乙醚回流提取3-6小時，減壓回收溶劑，得乙醚提取物約30-35g，該提取物即為蠅蛆的混合脂肪酸。
實施例3制備不飽和脂肪酸取實施例1、2制得的混合脂肪酸40g，加入10倍質量1mol/L的KOH乙醇溶液，密封2小時，離心，取濾液，濾液在-30℃放置1小時，離心，上清液經(jīng)減壓濃縮部分乙醇，加水稀釋，用石油醚抽提除去非皂化物，水層經(jīng)稀HCL酸化，再用石油醚提取，石油醚層用水洗至中性，以無水硫酸鈉干燥，回收溶劑，得不飽和脂肪酸，經(jīng)HP6890/5973 GC/MS聯(lián)用儀分析，見說明書附圖1。
實施例4體外人原髓細胞白血病HL-60細胞增殖抑制試驗取對數(shù)生長期HL-60細胞，調整細胞懸液濃度為1×105個/ml，每孔100μl細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。次日給藥(100μl/孔)，分別設空白對照組、細胞對照組、外源物質誘導的蠅蛆干粉和提取物31.25、62.5、125、250、500μg/ml劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培養(yǎng)液溶解)，37℃培養(yǎng)4h，離心棄去各孔內液體后加入150μl酸化異丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔570nm處吸光度，計算受試物對HL-60細胞的增殖抑制率。結果為蠅蛆干粉對人原髓細胞白血病HL-60的增殖抑制率為-4.2％、-2.8％、1.6％、25.5％、90.3％，提取物的增殖抑制率為-2.9％、10.4％、73.8％、96.2％、99.9％。生物顯微鏡下觀察，給藥后24h蠅蛆干粉500μg/ml劑量組和提取物125μg/ml劑量組細胞即發(fā)生明顯的形態(tài)變化，與對照組細胞相比細胞體積變小，膜皺縮，芽生形成細胞膜包裹的小體；隨著藥物處理時間延長，形態(tài)變化進一步加劇，大部分細胞膜破裂，呈壞死狀。
實施例5體外人肺腺癌A549細胞增殖抑制試驗取對數(shù)生長期A549細胞，0.25％胰蛋白酶消化后，調整細胞懸液濃度為5×104個/ml，每孔100μl細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。次日給藥(100μl/孔)，分別設空白對照組、細胞對照組、外源物質誘導的蠅蛆干粉和其提取物不飽和脂肪酸31.25、62.5、125、250、500μg/ml劑量組。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培養(yǎng)液溶解)，37℃培養(yǎng)2小時，棄去各孔內液體后加入150μl酸化異丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔570nm處吸光度，計算受試物對人肺腺癌A549細胞的增殖抑制率，結果為蠅蛆干粉對人肺腺癌A549細胞的增殖抑制率為1.3％、3.3％、5.8％、26.8％、95.1％，其提取物的增殖抑制率為3.5％、1.0％、15.0％、97.0％、99.2％生物顯微鏡下觀察，給藥后24h蠅蛆干粉500μg/ml劑量組和提取物250μg/ml劑量組細胞即發(fā)生明顯的形態(tài)變化，與對照組細胞相比細胞體積變小，變圓，細胞內出現(xiàn)空泡，細胞折光性變弱；隨著藥物處理時間延長，形態(tài)變化進一步加劇，部分細胞腫脹、邊緣模糊，甚至細胞膜破裂，呈壞死狀。
權利要求
1.從外源物質誘導的蠅蛆中提取分離具有抗腫瘤作用的有效組份不飽和脂肪酸，其特征在于有效組份的成分為十六碳一烯酸，十六碳二烯酸，十六碳三烯酸，十七碳一烯酸，十八碳一烯酸，十八碳二烯酸，二十碳二烯酸，二十碳三烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的抗腫瘤作用的不飽和脂肪酸，其特征在于結構為十六碳一烯酸(C16:1)，十六碳二烯酸(C16:2)，十六碳三烯酸(C16:3)，十七碳一烯酸(C17:1)，十八碳一烯酸(C18:1)，十八碳二烯酸(C18:2)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，二十碳四烯酸(C20:4)，二十碳五烯酸(C20:5)及二十二碳六烯酸(C22:6)。
3.根據(jù)權利要求1所述的抗腫瘤作用的不飽和脂肪酸，其特征在于具有抑制人原髓細胞白血病HL-60和人肺腺癌A549細胞增殖生長的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類抗腫瘤化合物，特別適用于抑制人癌腫瘤細胞的增殖生長。該組份從外源物質誘導的蠅蛆中提取、分離獲得，具有抑制人原髓細胞白血病HL－60和人肺腺癌A549細胞增殖生長的作用，當受試物濃度為250μg/ml時，外源物質誘導的蠅蛆干粉及其不飽和脂肪酸體外抑制人原髓細胞白血病HL－60增殖生長的效果分別為25.5％與96.2％，抑制人肺腺癌A549細胞增殖生長的效果分別為26.8％與97.0％。結果證實，從外源物質誘導的蠅蛆中提取、分離獲得的不飽和脂肪酸抑制人原髓細胞白血病HL－60和人肺腺癌A549細胞增殖生長比未提取的外源物質誘導的蠅蛆干粉有顯著提高。該組份經(jīng)動物急性毒性試驗，結果為無毒。
文檔編號A61K31/202GK101032525SQ20071006795
公開日2007年9月12日 申請日期2007年4月10日 優(yōu)先權日2007年4月10日
發(fā)明者周淡宜, 鄭曉亮, 徐水祥, 陳青青 申請人:浙江省醫(yī)學科學院