一種檢測(cè)血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及利用MGB探針結(jié)合巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法進(jìn)行上皮細(xì)胞粘附分 子表達(dá)檢測(cè)，W得到上皮粘附分子表達(dá)水平，W及該測(cè)試方法在檢測(cè)肺癌患者體內(nèi)循環(huán)腫 瘤細(xì)胞水平的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前對(duì)肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)多采用免疫磁珠分選法，該方法雖有較高 的準(zhǔn)確性，但靈敏度不足，面對(duì)越來(lái)越少樣本量的限制，該方法已不足W進(jìn)行大量腫瘤患 者疾病篩選及多次術(shù)后療效評(píng)估。
[0003] 化CAM(上皮細(xì)胞粘附分子）于1979年由化rlyn等W在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為 是人類結(jié)腸癌組織的主要腫瘤相關(guān)抗原。化CAM不同程度地表達(dá)于所有的正常上皮和上皮 源性惡性腫瘤中，且多位于細(xì)胞間緊密連接處。在結(jié)締組織及造血系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞、腦組 織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏明顯的化CAM的表達(dá)。因此，化CAM可作為用于檢測(cè)非小細(xì)胞肺 癌CTCs的組織特異性表達(dá)標(biāo)志物，并可W通過QRT-PCR等非常敏感的定量檢測(cè)方法可對(duì)其 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
[0004] 上皮特異性細(xì)胞粘附分子化CAM是最早W單克隆抗體技術(shù)鑒定出的腫瘤相關(guān)抗 原之一。它W多聚體的形式廣泛表達(dá)于上皮組織表面，介導(dǎo)巧非依賴性細(xì)胞間同型黏附功 能，據(jù)此可歸入粘附分子家族。
[0005] 相關(guān)的研究提示化CAM還具備粘附分子家族的其他特性，參與包括細(xì)胞與基質(zhì)的 相互作用、遷移、細(xì)胞分化、形態(tài)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝等多種過程。同時(shí)，EpCAM在 多種上皮來(lái)源的腫瘤中呈過表達(dá)，提示其與腫瘤生長(zhǎng)增殖等具有密切相關(guān)。多項(xiàng)研究已證 實(shí)化CAM的表達(dá)與乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、周期分布、轉(zhuǎn)移有關(guān)。
[0006] 化CAM在上皮來(lái)源的組織中廣泛表達(dá)（單層上皮，假?gòu)?fù)層上皮，移行上皮），定位于 細(xì)胞基底外側(cè)膜。一般鱗狀上皮不表達(dá)，部分上皮來(lái)源的腺上皮細(xì)胞如肝細(xì)胞，上皮角化細(xì) 胞、胃壁細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和胸腺皮層上皮亦不表達(dá)。間葉組織、肌肉和神經(jīng)內(nèi)分泌組織也 不表達(dá)化CAM。此外，淋己樣來(lái)源的細(xì)胞化CAM也呈陰性表達(dá)。不同的組織類型化CAM的表 達(dá)水平存在差異。如在胃腸道，胃上皮呈陰性或極弱表達(dá)，小腸粘膜相對(duì)高表達(dá)，結(jié)腸在已 知化CAM陽(yáng)性的細(xì)胞中表達(dá)水平最高。
[0007] 大部分粘附分子在細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化期間和其后都發(fā)生表達(dá)的改變，或上調(diào)，或 下調(diào)或原位表達(dá)，化CAM也不例外。在大部分上皮來(lái)源的腫瘤中化CAM都呈高表達(dá)。在間 質(zhì)或外胚層來(lái)源的腫瘤如神經(jīng)原性腫瘤，肉瘤，黑色素瘤或淋己瘤等，EpCAM不表達(dá)。
[000引經(jīng)研究證實(shí)，實(shí)體瘤患者的外周血中存在腫瘤細(xì)胞，CTCs的存在是腫瘤轉(zhuǎn)移必需 的，因此研究者可把CTCs作為未來(lái)正式的一種預(yù)后標(biāo)志物。另外，它也是實(shí)體瘤的先鋒， 被認(rèn)為是一種有效的抗腫瘤藥物的新祀標(biāo)。
[0009] 化CAM(上皮細(xì)胞粘附分子，非小細(xì)胞肺癌CTCs,外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是利用MGB探針結(jié)合巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法對(duì)肺癌患者外周 血進(jìn)行上皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)檢測(cè)，W反映體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，提出W下技術(shù)方案：
[0012] 一種巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平的方法，該方法利用 MGB探針結(jié)合巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行上皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)檢測(cè)，得到上皮粘附分 子表達(dá)水平，用W檢測(cè)肺癌患者體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，其特征在于，所述上皮細(xì)胞粘附分子表 達(dá)檢測(cè)流程包括W下步驟：
[0013] 1)在非小細(xì)胞肺癌患者肘正中靜脈處采取外周血液2mU將血液保存于邸TA抗凝 血管中，并放置在4 °C冰箱內(nèi)存儲(chǔ)；
[0014] 。W300G離屯、10分鐘，棄去上層血漿，保留血細(xì)胞層；
[0015] 3)利用紅細(xì)胞裂解液去除血細(xì)胞中的紅細(xì)胞，保留其中有核細(xì)胞，在-80°C冰箱 中保存；
[0016] 4)將經(jīng)上述處理的樣本加入Trizol液提取總RNA;
[0017] 5)將總RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到相應(yīng)的cDNA樣本；
[00化]6)制備化CAM,利用化t-PCR絕對(duì)定量法進(jìn)行化CAM表達(dá)水平檢測(cè)，并W健康志愿 者標(biāo)本為陰性對(duì)照。
[0019] 在步驟4中，提取總RNA的過程如下：
[0020] 4. 1)勻漿化作用，取出約50~lOOmg步驟3中處理后的樣本，放入10ml的無(wú)酶 玻璃勻裝管中，加入1ml的Trizol液，在電動(dòng)勻漿器充分勻漿；
[0021] 4. 2)分離階段，把勻漿液轉(zhuǎn)移至5ml的無(wú)酶離屯、管，室溫放置5min，然后加入 0. 2ml的氯仿，蓋緊離屯、管，用手劇烈搖蕩離屯、管15s;
[002引 4. 3)再次離屯、，室溫放置5min，放入4 °C預(yù)冷后的離屯、機(jī)，12000巧m，4 °C離屯、 30min；
[0023] 4. 4)RNA的沉淀，取上層水相轉(zhuǎn)移至一新的無(wú)酶離屯、管，加入等量異丙醇，室溫放 置lOmin,再次放入4°C預(yù)冷后的離屯、機(jī)，12000巧111，4°C，離屯、lOmin;
[0024] 4. 5)RNA的洗脫，倒掉上清，留取底部沉淀，加入1ml現(xiàn)配的預(yù)冷好的75%的無(wú) 酶己醇，所述配比為DEPC水：無(wú)水酒精=1:3,振蕩洗漆RNA沉淀一次，然后放入4°C預(yù)冷 的離屯、機(jī)，7500巧m, 4°C,離屯、5min;
[0025] 4.6)RNA的再溶解，倒掉上清，取沉淀置于超凈工作臺(tái)，室溫下自然風(fēng)干5min，此 時(shí)RNA沉淀變透明，再在管中加入20ulDEPC水，50°C水浴lOmin，充分溶解，將所提取的 總RNA保存于-80°C冰箱備用；
[0026] 在步驟5中，cDNA的合成包括步驟；
[0027]5. 1)在冰上準(zhǔn)備0. 5ml無(wú)酶PCR反應(yīng)管并建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1化1，其中，總RNA 3ul；01igodT18primerlul；DEPCtreatedwaterSul；
[002引將W上混合物W6000巧m，4rC，離屯、5sec，旋轉(zhuǎn)混勻，按W下反應(yīng)條件進(jìn)行第一 步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；65°C，5min，再W4°C存lOmin;
[0029] 5. 2)繼續(xù)在冰上依次加入 5Xreactionbuffer4ul，RibolockRNAseInhibitor lul，RevertAidM-ReverseTranscriptaselul，dNTPmixture2ul，總反應(yīng)體系 20ul;
[0030] 將W上共20ul的混合離屯、5sec，液旋轉(zhuǎn)混勾，按w下反應(yīng)條件進(jìn)行第二步逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)：42°C，60min，70°C，5min;再W4°C存lOmin，合成的cDNA存放在-2°C的冰箱儲(chǔ)存?zhèn)?用。
[0031] 5. 3)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的1.化bRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系；
[003引 5. 4)質(zhì)量檢測(cè)：采用試劑盒里提供的485bp的管家基因GAPDH引物對(duì)獲得的cDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0033] 在步驟5. 4)中，cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增包括步驟；
[0034] 5. 4. 1)在冰上建立W下反應(yīng)體系 25ul，包括普通PCRreactionmix1:ure12. 5ul， GAPDH的上、下游引物各lul，cDNA模板lul，加無(wú)菌去離子水至25ul;
[0035] 5. 4. 2)反應(yīng)條件；預(yù)變性94°C3min，變性94°C45s，退火55°C30s，延伸 72°C:45s，共30個(gè)循環(huán)，終延伸5min;
[0036]5. 4. 3)將PCR產(chǎn)物通過1. 5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120V恒壓電泳30min。
[0037] 在步驟6中，EpCAM制備包括步驟：
[003引 6. 1)將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%低烙點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行恒壓電泳，DNA上樣量50ul，電 泳30min，將電泳產(chǎn)物在紫外投射儀下透視，從瓊脂糖凝膠中切下所需的目凝膠重量400mg的DM片段，放入1. 5ml無(wú)酶離屯、管中稱量；
[0039] 6.。將離屯、管中的凝膠切成小塊W助凝膠溶解，隊(duì)疑膠的重量mg:Solution1的 體積ml為1:3比例加入Solution1 ;
[0040] 6. 3)在5°C恒溫水浴加熱5~15min，直到凝膠完全融化，每隔2~3min將管內(nèi) 混合液混勻一次，溫育后如果混合液顏色變紫色，加入lOul己酸鐘使其變回黃色；
[0041] 6. 4)凝膠完全融化后加入W凝膠重量mg:異丙醇體積ul為1:1的異丙醇并充分 混勻，對(duì)于DNA片段大于500bp不需要加入異丙醇；
[004引 6. 5)混合液全部轉(zhuǎn)移至Spincol皿an內(nèi)，放入離屯、機(jī)，20°C, 6000;rpm,離屯、 Imin，棄去接液管中液體；
[0043] 6. 6)向Spincolumm內(nèi)加入 500mlExtractionBuffer, 20°C, 12000巧m,離屯、 Imin，棄去接液管中液體；
[0044] 6. 7)向Spincolumm內(nèi)加入 750ulWashBuffer, 20°C, 12000;rpm,離屯、Imin,棄 去接液管中液體；
[0045] 6. 8)棄液后將Spincolumm再次放入離屯、機(jī)，室溫下，12000;rpm,離屯、Imin,后 將Spincolumm至于無(wú)菌的1. 5ml離屯、管中；
[0046] 6. 9)向Spincolumm內(nèi)加入 50mlElutionBuffer,室溫靜置Imin后，12000;rpm, 離屯、Imin，離屯、回收DNA樣品，1. 5ml離屯、管內(nèi)液體含有目的DNA片段，回收的DNA樣品 于-20保存。
[0047] 在步驟4中，還包括對(duì)總RNA提取質(zhì)量檢測(cè)：取3ul總RNA溶液加lul上樣緩沖 液，W120V穩(wěn)壓電泳30inin，紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，紫外燈下可見28s，18s，5sS 條rRNA的清晰條帶，并且28s條帶的強(qiáng)度高于18s，18s條帶的強(qiáng)度高于5s，表明RNA未 降解，質(zhì)量良好。
[0048] 在步驟6. 9)中，還包括對(duì)回收DNA的定量與檢測(cè)；