標(biāo)記血清糖原磷酸化酶濃度水平的光親和標(biāo)記探針分子、其制備方法及醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類光親和標(biāo)記的探針分子，其制備方法及醫(yī)藥用途。本發(fā)明所涉及到的探針分子可在血清中選擇性標(biāo)記糖原磷酸化酶，從而使得糖原磷酸化酶被定性定量檢測，因此可用于心肌梗死、心絞痛、心律失常、缺血性心臟驟停，冠心病疾病發(fā)生時(shí)生化標(biāo)志物糖原磷酸化酶的標(biāo)記檢測。
【專利說明】標(biāo)記血清糖原磷酸化酶濃度水平的光親和標(biāo)記探針分子、其制備方法及醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類光親和標(biāo)記的探針分子，其制備方法及醫(yī)藥用途。本發(fā)明所涉及到的探針分子可在血清中選擇性標(biāo)記糖原磷酸化酶，從而使得糖原磷酸化酶被定性定量檢測，因此可用于心肌梗死、心絞痛、心律失常、缺血性心臟驟停，冠心病疾病發(fā)生時(shí)生化標(biāo)志物糖原磷酸化酶的標(biāo)記檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]糖原磷酸化酶是糖原分解的關(guān)鍵酶，有3種同工酶，分別是腦型同工酶(GPBB)、肌型同工酶(GPMM)和肝型同工酶(GPLL)，其中GPBB是在人腦和心肌中占優(yōu)勢的同工酶。GPBB最早在實(shí)驗(yàn)室因心肌缺血而被檢測到。目前，GPBB成為最具潛質(zhì)的心肌損傷生物標(biāo)記，其在胸痛開始的I~4h內(nèi)濃度開始增加，并且釋放本質(zhì)上依賴于心肌缺血損傷。對比其他已知心肌標(biāo)志物，GPBB對于診斷心肌梗死、心絞痛、心律失常、缺血性心臟驟停，冠心病等心肌缺血損傷具有高度敏感性和特異性(Clin.Chem.1995，41，966)。
[0003]GPBB的測定方法目前有三種:第一種是基于化學(xué)方法測定糖原分解時(shí)釋放出的無機(jī)磷酸鹽，第二種是用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，第三種是酶聯(lián)免疫吸附測定法。前兩種方法敏感性較低，心肌缺血損傷發(fā)生時(shí)難以從血清中檢出GPBB(Lab Del0.1991，1，17)。酶聯(lián)免疫吸附測定法相對靈敏，檢測下限可達(dá)10μ g/L，但正常人血清中檢測不到GPBB。該法可初步實(shí)現(xiàn)對酶的半定量，并可應(yīng)用全血、血清和血漿樣本進(jìn)行分析，為目前科研工作中常用的檢測方法。但是該方法是利用抗體-抗原間的特異性分子識別機(jī)制，存在著抗體本身穩(wěn)定性差、對溫度敏感等缺點(diǎn)，在一定程度上制約了其臨床應(yīng)用(Clin.Chem.1996，42，S129)。
[0004]光親和標(biāo)記技術(shù)是在復(fù)雜生物樣品中檢測蛋白質(zhì)功能狀態(tài)水平的核心工具之一，是新的蛋白質(zhì)檢測方法學(xué)。迄今為止，國外學(xué)者已經(jīng)成功地運(yùn)用該技術(shù)對一些重要的蛋白酶進(jìn)行了研究，如金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸水解酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶等。該技術(shù)運(yùn)用合成的光親和小分子化合物作為工具探針，經(jīng)特定波長的光照射分解產(chǎn)生高活性的中間體，與其受體活性部位形成特異性的不可逆的共價(jià)結(jié)合，從而可以使得蛋白質(zhì)被定性定量檢測，標(biāo)記效率和檢測靈敏度均較高。此外，小分子探針易于合成和純化，可在體外批量合成，化 學(xué)穩(wěn)定性高，可避免目前酶聯(lián)免疫吸附法穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)(Nature Chem.Bi0.2006，2，274 ；Bioorg.Med.Chem.Lett2008，18，3646 ；Mol.Cell.Proteomics.2008，7，1241)。
[0005]探針分子包括三個(gè)功能部位；活性基團(tuán)、光親和標(biāo)記基團(tuán)、報(bào)告基團(tuán)，以及他們之間的連接部位。活性基團(tuán)的作用是將探針分子導(dǎo)向受體蛋白的活性中心。光親和標(biāo)記基團(tuán)的作用是在探針分子被導(dǎo)向受體蛋白的活性中心之后經(jīng)特定波長的紫外光照射分解產(chǎn)生高活性的卡賓或氮賓中間體，將探針分子共價(jià)修飾在受體蛋白的活性中心。報(bào)告基團(tuán)的作用主要是方便蛋白標(biāo)記以后的分離、純化、檢測等操作，最常用的報(bào)告基團(tuán)有熒光基團(tuán)、生物素和放射性標(biāo)簽。由于報(bào)告基團(tuán)的存在，經(jīng)常造成探針的分子量較大，所以近年來探針分子設(shè)計(jì)中引入了潛在的報(bào)告基團(tuán)的概念。潛在的報(bào)告基團(tuán)一般為分子量較小的疊氮基團(tuán)，在探針分子共價(jià)標(biāo)記了靶蛋白后，再與帶炔基的生物素或熒光基團(tuán)發(fā)生Huisgenl，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)引入生物素或熒光基團(tuán)等報(bào)告基團(tuán)，方便以后的分離、純化、檢測等操作。其中β羰基疊氮是一個(gè)很特殊的結(jié)構(gòu)，它與普通的烷基疊氮或芳基疊氮不同，在紫外光照射下具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)查作為潛在的報(bào)告基團(tuán)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種光親和標(biāo)記的探針分子，具有式(I)所示的結(jié)構(gòu):
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一類結(jié)構(gòu)式如通式(I)所示的光親和標(biāo)記探針分子:

2.權(quán)利要求1的光親和標(biāo)記的化學(xué)小分子探針，其特征在于: R代表生物素、丹磺酰基、異硫氰酸熒光素(FITC)、6_羧基熒光素(FAM)；
X 代表 O、CH2 ；
η代表1-5。
3.權(quán)利要求1、2的化合物的制備方法，包括: a.活性基團(tuán)的合成路線:
4.本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供式(I)中所示的光親和標(biāo)記分子探針在標(biāo)記檢測心肌缺血損傷發(fā)生時(shí)血清生化標(biāo)志物糖原磷酸化酶中的應(yīng)用。利用本發(fā)明提供的光親和標(biāo)記分子探針標(biāo)記檢測心肌缺血損傷發(fā)生時(shí)血清生化標(biāo)志物糖原磷酸化酶通過以下步驟實(shí)現(xiàn):正常SD大鼠和急性心肌缺血模型大鼠腹主動(dòng)脈取血，4°C，3000轉(zhuǎn)離心，取血清備用。取4份正常大鼠(500ul)血清，分別加入IOOng, 50ng, 25ng, 12.5ng,0ng糖原磷酸酶b(100ng/ml,50ng/ml,20ng/ml和0)，混勻后加入探針分子，終濃度為10uM，4°C孵育過夜。另取急性心肌缺血模型大鼠血清，加入探針分子，終濃度為10uM，4°C孵育過夜。365nm紫外光燈照射，總能量為8焦耳(約35分鐘)。將照射后的血清加入透析管中，透析液為PBS，12小時(shí)換液一次，透析48小時(shí)。BCA法定量血清蛋白含量，取30ug總蛋白上樣，page膠分離蛋白后，轉(zhuǎn)PVDF膜，在image上掃描熒光，通過光密度值的大小，間接定量模型組中GPb的含量。計(jì)算方法:利用光密度值和蛋白濃度成正比，用點(diǎn)線圖擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過探針分子結(jié)合的GPb的條帶光密度值帶入擬合公式計(jì)算蛋白濃度。
5.權(quán)利要求1至2的化合物，其特征在于:這些化合物是光親和標(biāo)記的化學(xué)小分子探針。
6.權(quán)利要求 5的用途，其特征在于:光親和標(biāo)記的化學(xué)小分子探針可用于心肌梗死、心絞痛、心律失常、缺血性心臟驟停,冠心病疾病發(fā)生時(shí)生化標(biāo)志物糖原磷酸化酶的標(biāo)記檢測。
【文檔編號】C07D493/10GK103819486SQ201410042805
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】張麗穎 申請人:承德醫(yī)學(xué)院