專利名稱：用于增加血清抗氧化劑濃度的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于增加血清抗氧化劑水平、降低氧化性化學(xué)物質(zhì)的血清/尿水平、 抑制胰島素受體信號(hào)活性、降低血清甘油三酯水平、增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽(葛瑞林、腦 腸肽，ghrelin)水平、以及降低血清TNF-α水平的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明披露了 制備和給予患者例如來(lái)源于血清或乳汁的載有鋅的(鋅加載的，zinc-charged)、蛋白酶消 化的蛋白質(zhì)的混合物。
背景技術(shù)：
氧化性化學(xué)物質(zhì)是不穩(wěn)定的活性分子如自由基和活性氧物質(zhì)，其可以攻擊體內(nèi)的 細(xì)胞結(jié)構(gòu)。高于氧化性化學(xué)物質(zhì)的正常血清濃度已與早衰和一些種類癌癥的增加的風(fēng)險(xiǎn)相 聯(lián)系?？寡趸瘎┦且活惢瘜W(xué)品，在一些情況下，其可以用來(lái)完全或部分中和氧化性化學(xué) 物質(zhì)-在一些情況下，減少或消除由氧化性分子引起的健康危害。因此，高于正常血清濃 度的抗氧化劑的存在、或抗氧化劑的消耗，可以降低氧化應(yīng)激水平并且可以伴隨人類和其 它哺乳動(dòng)物以及動(dòng)物的長(zhǎng)壽。因此期望開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單的方法用于增加抗氧化劑水平以防止自由 基、活性氧物質(zhì)、以及其它化學(xué)物質(zhì)(能夠引起對(duì)哺乳動(dòng)物生物化學(xué)和生理學(xué)的氧化應(yīng)激) 的有害影響。在人和哺乳動(dòng)物如小鼠中，低空腹胰島素水平也與長(zhǎng)壽相關(guān)(Sciencd99 :572, 2003 ；Science 297 :8112002)。抑制胰島素和IGF-I信號(hào)通路的突變會(huì)增加蠕蟲(chóng)、蠅、以 及哺乳動(dòng)物(包括人)的壽命(Science 299,1346-1351,2003 ；Proc Nat Acad Sci 105， 3438-3442, 2008) 0此外，胰島素受體信號(hào)通路的阻斷會(huì)增加抗氧化基因的表達(dá)，導(dǎo)致增加 的超氧化物歧化酶(過(guò)氧化物歧化酶)的生產(chǎn)，例如，其發(fā)揮作用以催化性地除去超氧化 物。因此，各種研究似乎表明，胰島素受體活性的抑制會(huì)導(dǎo)致抗氧化基因的激活，其又會(huì) 降低氧化應(yīng)激并延長(zhǎng)壽命(Cell 120,449-460. 200 。此外，具有中斷的胰島素受體信號(hào) 的小鼠還顯示降低的年齡相關(guān)的葡萄糖不耐受和甘油三酯水平，從而進(jìn)一步有助于長(zhǎng)壽 (Science 299:572-574,2003)。嚴(yán)重的體重下降是許多疾病的癥狀，并且經(jīng)常地，它可以使已經(jīng)危險(xiǎn)的醫(yī)療條件 惡化。例如，多于60%的晚期癌癥患者患有厭食癥和惡病質(zhì)(Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2007Jul ； 10 (4) :443-8)，并且，到目前為止，在幫助癌癥患者保持體重方面存在較大 的未滿足的需要。生長(zhǎng)激素釋放肽(葛瑞林，ghrelin)是一種由胃釋放的激素。它是一種觀個(gè)氨 基酸肽，其已顯示可以通過(guò)食欲刺激、下調(diào)能量消耗、以及誘導(dǎo)肥胖來(lái)上調(diào)體重。另外，生長(zhǎng) 激素釋放肽會(huì)抑制促炎細(xì)胞因子如IL-Ia、IL_li3、TNF-a，這些促炎細(xì)胞因子可以引起口 腔粘膜炎和厭食癥，所述促炎細(xì)胞因子是體重減輕的結(jié)果。最近，生長(zhǎng)激素釋放肽已表明， 可有利于癌癥患者。參見(jiàn) Barclay，J. Clin. Endocrinol. Metab. 89 :2832-2836 (2004) 還 正在開(kāi)發(fā)生長(zhǎng)激素釋放肽模擬物以防止惡病質(zhì)(Oncologist. 2007May; 12 (5) :594-600)。

發(fā)明內(nèi)容
本文披露的一些方法是在哺乳動(dòng)物受試者中增加血清抗氧化劑濃度的方法，包括 以下步驟給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包括第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段。在 本文披露的一些這樣的方法中，通過(guò)一種包括以下步驟的方法產(chǎn)生第一多個(gè)載有鋅的蛋白 片段片段化第一鋅結(jié)合蛋白，以及使鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。本文披露的一些方法是在哺乳動(dòng)物受試者中抑制胰島素受體活性的方法，包括以 下步驟給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包括通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生的 第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段片段化第一鋅結(jié)合蛋白，以及使鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離 子接觸。本文披露的一些方法是在哺乳動(dòng)物受試者中降低血清甘油三酯濃度的方法，包括 以下步驟給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包含通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生 的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段片段化第一鋅結(jié)合蛋白，以及使鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅 離子接觸。本文披露的一些方法是在哺乳動(dòng)物受試者中增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽濃度的方 法，包括以下步驟給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包含通過(guò)包括以下步驟的方 法產(chǎn)生的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段片段化第一鋅結(jié)合蛋白，以及使鋅結(jié)合蛋白或其片 段與鋅離子接觸。本文披露的一些方法是在哺乳動(dòng)物受試者中降低血清TNF-α濃度的方法，包括 以下步驟給予受試者治療有效量的組合物，該組合物包含通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生 的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段片段化第一鋅結(jié)合蛋白，以及使鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅 離子接觸。本文披露的一些方法是在人受試者中增加血清抗氧化劑濃度的方法，包括給予受 試者治療有效量的組合物的步驟，該組合物通過(guò)包括以下步驟的制備方法制備使鋅結(jié)合 血清或乳蛋白與螯合劑接觸，使所述蛋白與鋅接觸，使所述蛋白與蛋白酶接觸，以及使所述 蛋白與載體、賦形劑或稀釋劑(dilutent)接觸。


圖1示出了所披露的來(lái)源于豬血清的組合物對(duì)小鼠胰島素受體信號(hào)活性的影響。圖2示出了在攝入組合物后1天所披露的組合物對(duì)人血清自由基水平的治療效果。圖3示出了在攝入組合物后4天和6天所披露的組合物對(duì)人血清抗氧化劑水平的 治療效果。圖4示出了在攝入組合物后6天所披露的組合物對(duì)以25倍稀釋的人血清中超氧 化物歧化酶的活性的治療效果。圖5示出了在攝入組合物后6天所披露的組合物對(duì)以500倍稀釋的人血清中超氧 化物歧化酶的活性的治療效果。圖6示出了在攝入組合物的大約1個(gè)月期間所披露的組合物對(duì)人血清空腹胰島素 水平的治療效果。
圖7示出了在攝入組合物的大約1個(gè)月期間所披露的組合物對(duì)人血清抗氧化劑水 平的治療效果。圖8示出了在攝入組合物的大約1個(gè)月期間所披露的組合物對(duì)人尿自由基水平的 治療效果。圖9示出了在攝入組合物的3年時(shí)期結(jié)束時(shí)所披露的組合物對(duì)人血清抑制自由基 形成的能力的治療效果。圖10示出了所披露的組合物對(duì)線蟲(chóng)的預(yù)期壽命的治療效果。圖11示出了在攝入組合物后4天和6天所披露的組合物對(duì)人血清生長(zhǎng)激素釋放 肽(葛瑞林)水平的治療效果。圖12示出了在攝入組合物后4天和6天所披露的組合物對(duì)人血清TNF- α水平的 治療效果。圖13示出了在每日攝入組合物后8天、以及在停止進(jìn)一步攝入組合物以后2天和 10天，所披露的組合物對(duì)人血清甘油三酯水平的治療效果。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)描述了用于增加血清抗氧化劑水平、降低氧化性化學(xué)物質(zhì)的血清水平、抑 制胰島素受體信號(hào)活性、降低甘油三酯水平、增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平、以及降低血清 TNF-α水平的組合物和方法。尤其是，本發(fā)明披露了制備和給予患者例如來(lái)源于血清或乳 汁的載有鋅的、蛋白酶消化的蛋白質(zhì)的混合物。雖然不希望受限于生物活性的任何特定理論，但本文描述的各種組合物顯示出可 以抑制細(xì)胞胰島素受體信號(hào)活性，這又會(huì)上調(diào)抗氧化基因、蛋白伴侶、以及抗菌基因的表 達(dá)，其可以保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激(environmental stress)。例如，胰島素受體信號(hào)通路的 阻斷會(huì)增加抗氧化基因如超氧化物歧化酶的表達(dá)并降低血清甘油三酯水平。在一些實(shí)施方 式中，作用的機(jī)制涉及在脂肪細(xì)胞上胰島素受體的抑制，這可以通過(guò)導(dǎo)致血清抗氧化劑水 平增加的仍然未知的機(jī)制來(lái)激活超氧化物歧化酶(SOD)。胎兒和成年動(dòng)物(牛、羊、小鼠、以及大鼠)血清以及胎兒和成人血清包含鋅結(jié)合 蛋白，包括胎球蛋白、α-1-酸性糖蛋白(AAG)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)。包含一種或多種 這些蛋白的組合物可以過(guò)量加載(supercharge)鋅，使得在過(guò)量加載以后，與它們?cè)谄渥?然狀態(tài)下將結(jié)合的相比，蛋白包含更高量的結(jié)合鋅。已發(fā)現(xiàn)，在給予足夠的劑量以后，包含 這樣的過(guò)量加載的鋅結(jié)合蛋白的組合物能夠增加受試者的血清抗氧化劑水平。此外，由一 種或多種載有鋅的鋅結(jié)合蛋白的片段化(如通過(guò)蛋白酶消化)產(chǎn)生的肽片段的混合物，可 以保留增加受試者的血清抗氧化劑水平的能力。如果未加載鋅，則鋅結(jié)合蛋白和消化的肽 片段均具有大大降低的增加抗氧化劑水平的能力。雖然不希望受作用的任何特定理論的約 束，但據(jù)信載有鋅(zinc-charging)是所述方法的組合物的治療活性的部分基礎(chǔ)。載有鋅， 如在以下部分中所描述的，會(huì)產(chǎn)生這樣的組合物，與例如天然血清或乳蛋白相比，該組合物 具有顯著不同的結(jié)合鋅?，F(xiàn)在進(jìn)一步披露了，除了血清以外，促進(jìn)抗氧化劑水平的過(guò)量加載鋅的蛋白和蛋 白片段可以來(lái)源于乳汁。當(dāng)用鋅和蛋白水解酶(protylyticenzyme)處理全乳并產(chǎn)生載有 鋅的蛋白片段時(shí)，發(fā)現(xiàn)，在給予足夠劑量的包含這些片段的組合物以后，上述片段會(huì)增加受試者的血清抗氧化劑水平。本文還披露了各種實(shí)驗(yàn)和研究的結(jié)果，其說(shuō)明了本文披露的一些示例性組合物的 治療效果。這些實(shí)驗(yàn)和研究尤其已表明攝入一些所披露的組合物的短期(例如，24小時(shí)、4 天、6天)治療效果、攝入一些所披露的組合物的中期(例如，1個(gè)月)治療效果、以及攝入 一些所披露的組合物的長(zhǎng)期(例如，3年)治療效果。由攝入引起的治療效果，如在這些研 究中所說(shuō)明的，包括血清抗氧化劑濃度的增加、自由基形成的抑制、氧化性化學(xué)物質(zhì)的尿濃 度的降低、在血清中超氧化物歧化酶的活性水平的增加、空腹血清胰島素濃度的降低、甘油 三酯濃度的降低、血清生長(zhǎng)激素釋放肽濃度的增加、以及血清TNF-α濃度的降低。尤其是， 在攝入所披露的組合物后M小時(shí)，血清自由基形成呈現(xiàn)出降低。此外還表明，在大約1個(gè) 月期間內(nèi)所披露的組合物的攝入可以使血清抗氧化劑水平增加大約63%以及使尿自由基 水平降低大約46 %，如在整個(gè)月內(nèi)的不同時(shí)間所測(cè)得的。本專利申請(qǐng)經(jīng)常提及具有(在給予受試者以后)增加血清抗氧化劑水平能力的組 合物。然而，增加血清抗氧化劑水平通常伴隨氧化性化學(xué)物質(zhì)的血清水平的降低。因此， 短語(yǔ)“增加血清抗氧化劑水平”或“促進(jìn)抗氧化劑水平”以及類似短語(yǔ)應(yīng)被理解為等效地是 指氧化性物質(zhì)水平的降低、或氧化性物質(zhì)的血清濃度的降低、或降低的氧化應(yīng)激、或類似短 語(yǔ)。反過(guò)來(lái)也是一樣提及氧化性化學(xué)物質(zhì)或氧化應(yīng)激的降低也是指血清抗氧化劑水平的 增加。如在本文中所使用的，并且除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)“蛋白”是指包含一個(gè)或多個(gè) 多肽鏈或其片段的分子。因?yàn)榭梢杂?，例如，一種或多種糖類或磷酸酯來(lái)修飾多肽鏈，所以 術(shù)語(yǔ)蛋白特別包括糖蛋白和包含蛋白的翻譯后修飾(ΡΤΜ)。術(shù)語(yǔ)蛋白，除非另有指明，否則 沒(méi)有大小限制。尤其是，該術(shù)語(yǔ)包括來(lái)自，例如，血清或乳汁的蛋白(包括糖蛋白)的蛋白 酶消化的片段。用于消化的優(yōu)選蛋白酶包括木瓜蛋白酶。如在本文中所使用的并且除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)“治療”、“處治”和“處理”是指 緩和或減輕與待治療疾病或病癥有關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性。如在本文中所使用的并且除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)“管理”、“控制”和“操縱”是指 保持嚴(yán)重性降低或避免與待管理的疾病或病癥有關(guān)的癥狀。如在本文中所使用的并且除非另有指明，否則術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”、“正在預(yù)防”或“防止” 是指降低獲得待預(yù)防的疾病或病癥、或其癥狀的風(fēng)險(xiǎn)或延遲其發(fā)作。如在本文中所使用的，“受試者”是動(dòng)物，通常是哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中， 受試者是人，如患者。如在本文中所使用的，并且除非另有規(guī)定，否則術(shù)語(yǔ)化合物的“治療有效量”和“有 效量”是指這樣的量，其足以在疾病的治療、預(yù)防和/或管理方面提供治療益處，延遲或使與 待治療疾病或障礙有關(guān)的一種或多種癥狀最小化。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”和“有效量”可以涵 蓋這樣的量，其可以改善整體治療、減少或避免疾病或障礙的癥狀或原因、或增強(qiáng)另一種治 療劑的治療效力。術(shù)語(yǔ)“共同給予”或“聯(lián)合(組合)”包括同時(shí)、并行或順序地(沒(méi)有具體的時(shí)間限 制)給予兩種治療劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，兩種藥劑同時(shí)存在于受試者中或同時(shí)發(fā)揮它們 的生物或治療效果。在一個(gè)實(shí)施方式中，兩種治療劑處于相同的組合物或單位劑型中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，兩種治療劑處于分開(kāi)的組合物或單位劑型中。術(shù)語(yǔ)“膳食補(bǔ)充劑”是指在Action 3of the Dietary Supplement Healthand Education Act of 1994,Public Law 103-417，Oct. 25，1994 中定義為膳食補(bǔ)充劑的材料。 膳食補(bǔ)充劑是口服的產(chǎn)品，其包含用來(lái)補(bǔ)充飲食的“膳食成分”。“膳食成分”包括本發(fā)明的 載有鋅的、蛋白酶消化的組合物以及可選的一種或多種其它膳食成分如維生素、礦物質(zhì)、草 藥或其它植物性藥材、氨基酸、以及物質(zhì)如酶、器官組織、腺、以及代謝物。膳食補(bǔ)充劑還可 以是提取物或濃縮物，并且可以以許多形式如片劑、膠囊劑、軟膠囊、囊形片(軟明膠膠囊， gel cap)、液體、或粉劑存在。組合物以及其制備本文提供了可以用來(lái)增加受試者中的血清抗氧化劑水平的組合物。本文披露了這樣的組合物，該組合物包含有效量的用于增加血清抗氧化劑水平的 載有鋅的、蛋白酶消化的血清或乳蛋白。蛋白可以來(lái)自對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的任何來(lái)源。在一些實(shí)施方式中， 蛋白分離自血清。在一些實(shí)施方式中，蛋白分離自乳汁。在一些實(shí)施方式中，血清蛋白并沒(méi) 有與血清分離，而是載有鋅的和蛋白酶消化的，同時(shí)留在血清中。在一些實(shí)施方式中，乳蛋 白并沒(méi)有與乳汁分離，而是載有鋅的和蛋白酶消化的，同時(shí)留在乳汁中。血清或乳汁可以但 不限于來(lái)自動(dòng)物如牛、羊、豬、馬或人。血清可以是成人或胎兒血清。可以根據(jù)對(duì)本領(lǐng)域技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的任何技術(shù)來(lái)獲得和/或制備乳汁或血清。在一些實(shí)施方式中，蛋白可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)從重組來(lái)源產(chǎn)生和 分離。在一些實(shí)施方式中，蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合成或半合成技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。 在另外的實(shí)施方式中，蛋白可以從商業(yè)來(lái)源獲得。乳汁或血清蛋白可以是有效用于本文提供的方法的任何乳汁或血清蛋白。在一些 實(shí)施方式中，血清或乳蛋白選自由α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、 白蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白組成的組。在一些實(shí)施方式中，血清或乳蛋白是α-2-HS-糖蛋白。在 一些實(shí)施方式中，血清或乳蛋白是α-1-酸性糖蛋白。在一些實(shí)施方式中，血清或乳蛋白是 α-1-抗胰蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，血清或乳蛋白是白蛋白。在一些實(shí)施方式中，血清 或乳蛋白是轉(zhuǎn)鐵蛋白。在一些實(shí)施方式中，組合物包含多于一種的血清或乳蛋白。所述蛋白可以選自由 α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白 組成的組。在一些實(shí)施方式中，組合物包含選自由α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、 α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組成的組中的兩種血清或乳蛋白。在一 些實(shí)施方式中，組合物包含選自由α -2-HS-糖蛋白、α -1-酸性糖蛋白、α 抗胰蛋白酶、 白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組成的組中的三種血清或乳蛋白。在一些實(shí)施方式中，組 合物包含選自由α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、α 抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋 白以及甲胎蛋白組成的組中的四種血清或乳蛋白。在一些實(shí)施方式中，組合物包含選自由 α-2-HS-糖蛋白、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組 成的組中的五種血清或乳蛋白。在一些劑型(配方)中，血清或乳蛋白可以是載有鋅的。如下面所討論的，載有鋅 可以產(chǎn)生具有結(jié)合鋅的組合物，其中結(jié)合鋅基本上不同于可能存在于天然血清或乳汁中的微量鋅。按照對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的任何技術(shù)，可以使血清或乳蛋白載有鋅。 示例性技術(shù)描述在，例如，美國(guó)專利號(hào)5，994，298,6, 258，779,6, 720，311以及6，737，402 中，將它們的全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于本文。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)除去結(jié)合離子， 如金屬離子，接著使蛋白與鋅離子接觸，可以使蛋白載有鋅。可以通過(guò)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的任何技術(shù)，包括，例如，滲析、過(guò)濾、螯合劑等，來(lái)除去結(jié)合離子。在一些 實(shí)施方式中，通過(guò)使蛋白與有效量的螯合劑如EDTA、EGTA、檸檬酸三鈉、或基于氨三乙酸 (nitriolotriacetic) (NTA)的試劑接觸，來(lái)除去結(jié)合離子。條件可以包括，例如，對(duì)于約40 微摩爾(“ μΜ”)蛋白來(lái)說(shuō)，約1毫摩爾(“福”)至約IOOmM EDTA。在一些實(shí)施方式中，在 除去結(jié)合離子以后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如過(guò)濾、滲析、層析或分子篩，從蛋白中除去螯合劑?？梢酝ㄟ^(guò)與以任何形式和可有效用鋅加載蛋白的任何量的鋅接觸來(lái)使蛋白載有 鋅。鋅的示例性形式包括鋅鹽如氯化鋅、乙酸鋅以及硫酸鋅。在以下工作實(shí)施例中，蛋白載 有乙酸鋅。條件可以包括，例如，對(duì)于40 μ M蛋白來(lái)說(shuō)，約ImM至約500mM鋅鹽，例如乙酸鋅、 氯化鋅或硫酸鋅。條件可以包括對(duì)于40 μ M蛋白來(lái)說(shuō)約1至約500mM乙酸鋅。在一些實(shí)施 方式中，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如過(guò)濾、滲析、層析或分子篩來(lái)從蛋白中除去過(guò)量的鋅。在本文披露的組合物中，蛋白可以被蛋白酶消化。在載有鋅以前、載有鋅期間或載 有鋅以后，蛋白可以被蛋白酶消化。在以下工作實(shí)施例中，載有鋅接著是蛋白酶消化。蛋白 酶可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白酶，該蛋白酶能夠產(chǎn)生可有效增加抗氧化劑水平 的片段。示例性的蛋白酶包括木瓜蛋白酶。在適合于產(chǎn)生可有效用于本發(fā)明方法的片段的 條件下，使蛋白與蛋白酶接觸。在一些實(shí)施方式中，在37°C下，使蛋白與木瓜蛋白酶接觸約 兩小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如過(guò)濾、滲析、層析或分子篩，從蛋 白中除去木瓜蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)如冰 凍-解凍技術(shù)來(lái)消化蛋白。蛋白的消化導(dǎo)致蛋白的片段化并產(chǎn)生蛋白質(zhì)片段。通常，與本 發(fā)明各種實(shí)施方式有關(guān)的蛋白的片段化可以通過(guò)許多方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些方法包括通過(guò)蛋白 酶的消化、經(jīng)由冷凍-解凍方法的片段化、以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它方法。在一些實(shí)施方式中，如本文描述的載有鋅的、蛋白酶消化的血清或乳蛋白的大小 基本上小于 100kDa、50kDa、25kDa、20kDa、15kDa、10kDa、5kDa 或 3kDa。術(shù)語(yǔ)“大小基本上小 于”是指不多于50175190%或95%的蛋白酶消化的血清或乳蛋白片段大于尺寸限制。 可以按照對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的任何技術(shù)，包括，例如，過(guò)濾、滲析、層析或分 子篩，來(lái)對(duì)載有鋅的、蛋白酶消化的血清或乳蛋白片段定尺寸。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括下面描述的那些技術(shù))，可以將組合物配制成在以下部分 中描述的形式，如膳食補(bǔ)充劑、食品添加劑、食物成分、保健品組合物(營(yíng)養(yǎng)品組合物， nutraceutical composition)或藥物組合物。在哺乳動(dòng)物中增加血清抗氧化劑濃度、降低 血清甘油三酉旨濃It、降彳氏血清TNF-α濃It、抑泡Ifl夷島素警彳本{言號(hào)活t牛、禾Π /或 曾力D血清牛長(zhǎng)本文披露了在哺乳動(dòng)物受試者中增加血清抗氧化劑濃度的方法，該方法包括給予 受試者治療有效量的一種或多種組合物。可以交替(可替換地)或另外地將組合物給予哺 乳動(dòng)物受試者，用于降低血清甘油三酯濃度的目的?？梢越惶婊蛄硗獾貙⒔M合物給予哺乳 動(dòng)物受試者，用于抑制胰島素受體信號(hào)活性的目的。這樣的方法可以包括以下步驟使一種 或多種表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞與有效量的組合物接觸以調(diào)節(jié)受體活性。表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的表達(dá)任何胰島素受體的任何細(xì)胞，包括體內(nèi)、體外或離 體表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)胰島素受體的細(xì)胞可以處于受試者內(nèi)。 可以交替或另外地將組合物給予哺乳動(dòng)物受試者，用于增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽濃度的目 的。可以交替或另外地將組合物給予哺乳動(dòng)物受試者，用于降低血清TNF-α濃度的目的。組合物可以包含第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段(或多個(gè)載有鋅的第一蛋白片段)。 在一些這樣的方法中，組合物可以另外包含第二多個(gè)載有鋅的蛋白片段(或多個(gè)載有鋅的 第二蛋白片段)。在一些這樣的方法中，組合物可以另外包含第三多個(gè)載有鋅的蛋白片段 (或多個(gè)載有鋅的第三蛋白片段)。在一些方法中，鋅結(jié)合蛋白可以是哺乳動(dòng)物乳汁和/或 哺乳動(dòng)物血清特產(chǎn)的蛋白。在一些方法中，鋅結(jié)合蛋白可以是非哺乳動(dòng)物血清特產(chǎn)的蛋白。 在一些方法中，鋅結(jié)合蛋白可以選自由α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、α 抗胰蛋 白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組成的組?？梢酝ㄟ^(guò)這樣的方法來(lái)產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段，所述方法包括用蛋白酶消化一個(gè) 或更多的多個(gè)鋅結(jié)合蛋白。在一些方法中，可以通過(guò)使哺乳動(dòng)物血清或乳汁與蛋白酶接觸 來(lái)產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段(和/或待給予的組合物)。在一些方法中，蛋白酶是木瓜蛋白 酶。如上面所討論的，還可以通過(guò)用于片段化一個(gè)或更多的多個(gè)鋅結(jié)合蛋白的其它方法， 如冰凍-解凍技術(shù)，來(lái)產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段?？梢酝ㄟ^(guò)這樣的方法來(lái)產(chǎn)生載有鋅的蛋白 片段，所述方法包括使一個(gè)或更多的多個(gè)鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。在一些方法 中，可以顛倒片段化和與鋅接觸的步驟。在一些方法中，可以通過(guò)使哺乳動(dòng)物血清或乳汁與 鋅離子接觸來(lái)產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段(和/或待給予的組合物)?？梢酝ㄟ^(guò)這樣的方法來(lái) 產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段，所述方法包括剛描述的以任一次序的兩個(gè)步驟。在一些方法中， 使鋅結(jié)合蛋白與鋅接觸包括采用以乙酸鋅溶液形式的鋅。在其它方法中，采用不同鋅鹽的 溶液，如氯化鋅和硫酸鋅。在一些方法中，鋅鹽(如乙酸鋅、氯化鋅、或硫酸鋅、或它們的任 何組合)的溶液包括濃度在約ImM到約500mM之間(包括約5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、 200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、以及約450mM，還包括在這些列舉濃度之間的濃度，以及 相鄰于列舉濃度的低側(cè)和高側(cè)的濃度范圍)的鋅鹽。在一些方法中，上述方法另外包括除 去未結(jié)合于任何蛋白的過(guò)量的鋅。產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段的方法還可以包括使一個(gè)或更多的多個(gè)鋅結(jié)合蛋白或片 段與螯合劑接觸。在一些方法中，可以通過(guò)使哺乳動(dòng)物血清或乳汁與螯合劑接觸來(lái)產(chǎn)生載 有鋅的蛋白片段(和/或待給予的組合物)。在一些方法中，螯合劑包括EDTA和/或EGTA， 其濃度在約 ImM 到約 IOOmM 之間(包括約 5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、;35mM、40mM、 45mM、50mM、60mM、70mM、80mM、以及約90mM，還包括在這些列舉濃度之間的濃度，以及相鄰于 列舉濃度的低側(cè)和高側(cè)的濃度范圍)。在一些方法中，上述方法另外包括除去螯合劑，所述 除去可選地包括過(guò)濾和/或滲析。產(chǎn)生載有鋅的蛋白片段的方法還可以包括使一個(gè)或更多 的多個(gè)鋅結(jié)合蛋白或片段或哺乳動(dòng)物血清或乳汁與載體、賦形劑或稀釋劑接觸。在一些方法中，一些數(shù)量的、或所有、或基本上所有的所得的鋅結(jié)合或載有鋅的蛋 白片段(包括待給予的組合物)可以具有在約0. 3千道爾頓至約50千道爾頓之間的分子 量(包括約0. 4千道爾頓、0. 5千道爾頓、0. 6千道爾頓、0. 7千道爾頓、0. 8千道爾頓、0. 9千 道爾頓、1千道爾頓、2千道爾頓、3千道爾頓、4千道爾頓、5千道爾頓、10千道爾頓、15千道 爾頓、20千道爾頓、30千道爾頓、以及約40千道爾頓，還包括在這些列舉的分子量之間的分子量，以及相鄰于列舉的分子量的低側(cè)和高側(cè)的分子量范圍)。在一些方法中，所得的鋅結(jié)合或載有鋅的蛋白片段(包括待給予的組合物)的平 均分子量可以具有在約0. 3千道爾頓到約50千道爾頓之間的分子量(包括約0. 4千道爾 頓、0. 5千道爾頓、0. 6千道爾頓、0. 7千道爾頓、0. 8千道爾頓、0. 9千道爾頓、1千道爾頓、2 千道爾頓、3千道爾頓、4千道爾頓、5千道爾頓、10千道爾頓、15千道爾頓、20千道爾頓、30 千道爾頓、以及約40千道爾頓，還包括在這些列舉的分子量之間的分子量，以及相鄰于列 舉的分子量的低側(cè)和高側(cè)的分子量范圍)。在一些方法中，待給予的組合物可以基本上沒(méi)有分子量大于截止值(cutoff)的 載有鋅的或鋅結(jié)合蛋白片段，上述截止值在約0. 8千道爾頓到約50千道爾頓之間(包括約 0. 9千道爾頓、1千道爾頓、2千道爾頓、3千道爾頓、4千道爾頓、5千道爾頓、10千道爾頓、15 千道爾頓、20千道爾頓、30千道爾頓、以及約40千道爾頓，還包括在這些列舉的分子量截止 值之間的分子量截止值)。在一些方法中，產(chǎn)生組合物的方法可以包括選擇截止值并從分子 量大于所選截止值的一些分子中分離載有鋅的或鋅結(jié)合蛋白片段。截止值可以在約0. 3千 道爾頓到約50千道爾頓之間(包括約0. 4千道爾頓、0. 5千道爾頓、0. 6千道爾頓、0. 7千道 爾頓、0. 8千道爾頓、0. 9千道爾頓、1千道爾頓、2千道爾頓、3千道爾頓、4千道爾頓、5千道 爾頓、10千道爾頓、15千道爾頓、20千道爾頓、30千道爾頓、以及約40千道爾頓，還包括在 這些列舉的分子量截止值之間的分子量截止值)。在一些方法中，待給予的組合物可以包含在鹽水溶液中的鋅結(jié)合蛋白，其濃 度在約 0. 01 μ M 至約 400 μ M 的范圍內(nèi)(包括約 0. 05 μ Μ、0. 1 μ Μ、0. 25 μ Μ、0. 5 μ Μ、 1· 0 μ Μ、2· 5 μ Μ、5· 0 μ Μ、10. 0 μ Μ、20· 0 μ Μ、30· 0 μ Μ、40· 0 μ Μ、50· 0 μ Μ、60· 0 μ Μ、70· 0 μ Μ、 80. 0 μ Μ、90· 0 μ Μ、100. 0 μ Μ、150. 0 μ Μ、200· 0 μ Μ、250. 0 μ Μ、300· 0 μ M 以及約 350. 0 μ Μ,
還包括在這些列舉的濃度之間的濃度，以及相鄰于列舉濃度的低側(cè)和高側(cè)的濃度范圍)。在一些方法中，組合物可以是膳食補(bǔ)充劑。在一些方法中，組合物可以是食品添加 劑或食物成分。在一些方法中，組合物可以是藥物組合物。在一些方法中，組合物可以包含 藥用載體、賦形劑、或稀釋劑。在一些方法中，組合物可以是保健品組合物。為了引起血清抗氧化劑濃度的增加、或血清甘油三酯濃度的降低、或胰島素受體 信號(hào)活性的抑制、或增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平、或降低血清TNF-α水平，必須給予受 試者的特定組合物的量(劑量)可以大大取決于受試者和待給予的特定組合物而變化。在 一些方法中，治療有效量可以是至少約0.02毫克(“mg”)的載有鋅的蛋白片段/千克受 試者體重。因此，當(dāng)給予通常具有大約70千克的體重的人時(shí)，可以將組合物配制成至少約 Ijmg載有鋅的蛋白片段的單位劑量。在一些方法中，治療有效量可以達(dá)到約50mg載有 鋅的蛋白片段/千克受試者體重。因此，當(dāng)給予通常具有大約70千克的體重的人時(shí)，可以 將組合物配制成可達(dá)約3. 5g載有鋅的蛋白片段的每天劑型。在一些這樣的方法中，組合 物的治療有效量可以在約0. 02毫克到約50毫克的載有鋅的蛋白片段/千克受試者體重 之間(包括約 0. 03mg、0. 04mg、0. 05mg、0. lmg、0. 25mg、0. 5mg、l. 0mg、l. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、 3. 0mg、4. 0mg、5. 0mg、6. Omg>7. Omg>8. Omg>9. 0mg> 10. 0mg> 11. 0mg> 12. 0mg> 13. 0mg> 14. Omg> 15. 0mg、20. 0mg、25. 0mg、30. 0mg、35. 0mg、40. Omg、以及約 45. Omg/ 千克受試者體重，還包括 在這些列舉的重量之間的重量/千克受試者體重，以及相鄰于列舉重量的低側(cè)和高側(cè)的 重量范圍)。在一些方法中，待給予的組合物的治療有效量可以在約Img載有鋅的蛋白片段/天到約IOOOmg載有鋅的蛋白片段/天之間(包括約ang、;3mg、％ig、5mg、10mg、25mg、 50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、 700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、以及約950mg，還包括在這些列舉的重量之間的重量，以 及相鄰于列舉重量的低側(cè)和高側(cè)的重量范圍)。下文更詳細(xì)地描述用于給予受試者的組合 物的適當(dāng)劑量的選擇。受試者群體受試者可以是需要本發(fā)明的方法的任何受試者。在一些實(shí)施方式中，受試者是動(dòng) 物。在一些實(shí)施方式中，受試者是哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，受試者是人。在一些實(shí)施 方式中，受試者是患者。在本文披露的方法的一些實(shí)施方式中，受試者可以正經(jīng)歷以高于自由基、活性氧 物質(zhì)、以及其它氧化性物質(zhì)的正常血清濃度列舉的氧化應(yīng)激。在一些實(shí)施方式中，受試者僅 僅處于高于經(jīng)歷氧化應(yīng)激的一般風(fēng)險(xiǎn)。列舉高于經(jīng)歷氧化應(yīng)激的一般風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)示例性受試者組是開(kāi)始經(jīng)受化療的癌 癥患者。利用化療藥劑治療癌癥經(jīng)常伴隨由氧化應(yīng)激的發(fā)生所引起的副作用。在化療期間， 經(jīng)常檢測(cè)到增強(qiáng)的脂質(zhì)過(guò)氧化、抗氧化維生素的減少、在血漿中的自由基捕獲能力、以及組 織谷胱甘肽(GSH)水平的顯著降低?；钚匝跷镔|(zhì)的無(wú)法抵抗的生產(chǎn)會(huì)損害健康組織，并因 此被認(rèn)為是化療藥劑的毒性副作用的原因之一。尤其是，具有高增殖率的組織和細(xì)胞，如胃 腸道的上皮、骨髓、以及毛囊，尤其會(huì)受到氧化性損害(oxidativeinsult)的影響。另外，在 癌癥化療期間產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)還可以降低通過(guò)干擾細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞周期進(jìn)程和藥物誘 導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低治療的效力，上述細(xì)胞過(guò)程對(duì)于化療藥劑發(fā)揮它們對(duì)癌細(xì)胞的最佳效 應(yīng)是重要的。在本文披露的方法的其它實(shí)施方式中，受試者可能未正經(jīng)歷高于氧化應(yīng)激的正常 水平(或有經(jīng)歷高于氧化應(yīng)激的正常水平的危險(xiǎn))，然而可能期望改善老化特性，其中的 許多老化特性通過(guò)自由基、活性氧物質(zhì)、以及可以存在于體內(nèi)的其它氧化劑的正常血清水 平而惡化。在多個(gè)研究中，已用文件很好地證明了氧化性物質(zhì)對(duì)老化進(jìn)程的影響(Science 27359-63 ；Cancer Res 6610805-14 ;J Cell Sci 117，2417-26)。本文披露的增加血清抗氧 化劑水平的一些方法因此可以用于降低氧化性物質(zhì)的血清濃度，并且因此降低老化的生理 特性。本文披露的用于增加血清抗氧化劑濃度的方法可以與用于實(shí)現(xiàn)其它治療效果的 其它方法組合。例如，本文披露的可用于增加血清抗氧化劑濃度的組合物可以與具有其它 治療效果的其它活性組分組合，因而產(chǎn)生新的組合物，該新的組合物可用于降低氧化性物 質(zhì)的血清水平同時(shí)治療第二病癥，這取決于其它活性組分的特性。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，組合不同治療劑的方法是眾所周知的。膳食補(bǔ)充劑和藥物組合物以本文披露的方法給予的組合物可以以食品、食品添加劑、膳食補(bǔ)充劑、保健品或 藥品的形式給予。組合物可以包含載體、稀釋劑、或賦形劑。取決于期望的用途，可以選擇 載體、稀釋劑、或賦形劑以適合于人用或獸用、食品、添加劑、補(bǔ)充劑或藥物用途。在一些實(shí)施方式中，以與乳汁的混合物，提供在本文披露的方法中使用的組合物，用于給予受試者。在一些實(shí)施方式中，以干粉的形式提供組合物?？梢园凑毡绢I(lǐng)域技 術(shù)人員已知的任何技術(shù)來(lái)干燥組合物，包括冷凍干燥、冰凍干燥、噴霧干燥以及蒸發(fā)干燥。 粉末可以包含抗氧化劑水平促進(jìn)組合物(抗氧化水平促進(jìn)組合物，antioxidant level promotingcomposition)以及可選的任何載體、稀釋劑、賦形劑或其它添加劑(本文描述的 或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的)。在一些實(shí)施方式中，可以以液體的形式來(lái)提供抗氧化劑水平促 進(jìn)組合物。上述液體可以包含抗氧化劑水平促進(jìn)組合物以及可選的任何載體、稀釋劑、賦形 劑或其它添加劑(本文描述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的)。上述液體可以是本領(lǐng)域技術(shù)人 員認(rèn)為有利的任何體積，例如，對(duì)于劑量和給予途徑來(lái)說(shuō)方便的體積。如在本文中所使用的，“食品”或“食物成分”是基本上由蛋白質(zhì)、碳水化合物和/ 或脂肪構(gòu)成的物質(zhì)，其用于生物體的體內(nèi)以維持生長(zhǎng)、修復(fù)和生命過(guò)程以及提供能量。食品 還可以包含補(bǔ)充物質(zhì)如礦物質(zhì)、維生素以及調(diào)味品。術(shù)語(yǔ)食品包括適合于人或動(dòng)物消耗的 飲料。如在本文中所使用的，“食品添加劑”如由FDA在21CFR 170.3(e)(1)中所定義并且 包括直接和間接添加劑?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)配制技術(shù)將本文提供的組合物配制成軟膠囊、茶劑、片劑等。參 見(jiàn)例如，Remington’ s Pharmaceutical Sciences，18th ed. ， MackPublishing， Easton Pa. (1990)。可以將本文提供的組合物配制成膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)劑型、或藥物制劑，用于給予 受試者為了促進(jìn)血清抗氧化劑水平/濃度的目的，如本文描述的。組合物的適宜形式包括食品添加劑、食物成分(包括飲料成分)以及膳食補(bǔ)充劑。 可以將組合物加入到各種食品中以便同時(shí)消費(fèi)。作為食品添加劑，可以以與常規(guī)食品添加 劑相同的方式來(lái)使用組合物，因此僅需要與其它食物成分混合。應(yīng)當(dāng)明了，膳食補(bǔ)充劑可以不一定使用與藥物組合物相同的配方成分或具有與藥 物組合物相同的無(wú)菌和其它FDA要求。膳食補(bǔ)充劑可以以液體形式，例如，溶液、糖漿或懸 浮液，或可以以產(chǎn)品的形式用于在使用前用水或任何其它合適的液體重組?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī) 方式來(lái)制備這樣的液體制劑如茶劑、保健飲料、膳食混合飲料(dietary shake)、液體濃縮 物、或液體可溶性片劑、膠囊劑、丸劑、或粉劑，使得可以通過(guò)將液體可溶性片劑、膠囊劑、丸 劑、或粉劑溶解在液體中來(lái)制備飲料并消費(fèi)所得的飲料?？商鎿Q地，膳食補(bǔ)充劑可以采取通 過(guò)常規(guī)方式制備的片劑或膠囊劑的形式并且可選地包括其它膳食補(bǔ)充劑，包括維生素、礦 物質(zhì)、其它草藥補(bǔ)充劑、粘合劑、填料、潤(rùn)滑劑、崩解劑、或濕潤(rùn)劑，如上文所討論的那些。可 以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法來(lái)涂布片劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，膳食補(bǔ)充劑可以采 取膠囊劑或粉劑的形式以被溶解在液體中用于口服消費(fèi)。在治療或預(yù)防疾病或病癥中的活性組分的飲食劑量的大小將隨著待治療疾病或 病癥的嚴(yán)重性和給予途徑而變化。劑量、以及也許劑量頻率也將根據(jù)消費(fèi)者或患者的年齡、 體重、反應(yīng)、以及過(guò)去的醫(yī)療史而變化。適當(dāng)考慮到這樣的因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易 地選擇合適的給予劑量方案。加入到食品中的抗氧化劑水平促進(jìn)組合物的量將取決于食品的種類和期望的效 果。通常，單份食物(single serving)包含一定量的組合物，其為食品的約0. 至約 100% (包括食品的約 0. 2%、0· 3%、0· 4%、0· 5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、 50%,60%,70%,80%,90%,以及約95%，還包括在這些列舉的百分比之間的百分比，以及 相鄰于列舉的百分比的低側(cè)和高側(cè)的百分比范圍)。在一些實(shí)施方式中，食品包含按食品的重量計(jì)以約至約10%的量的抗氧化劑水平促進(jìn)組合物。食品的實(shí)例包括但不限于甜食如糖果(糖果、果凍、果醬等)、樹(shù)膠、豆醬、烤糖果 或模壓糖果(餅干、小點(diǎn)心等)、蒸糖果、可可豆或可可產(chǎn)品(巧克力和可可粉)、乳制品(酸 奶、乳飲料等)、冰凍糖果(冰淇淋、冰塊等)、飲料(果汁、軟飲料、碳酸飲料)、健康飲品、健 康棒、以及茶葉(綠茶、紅茶等)?？梢杂酶鞣N方式來(lái)包裝或標(biāo)記本文披露的組合物并用于各種目的。例如，如果作 為商業(yè)產(chǎn)品出售組合物，則不管是作為食品、膳食補(bǔ)充劑、或藥物，表明存在本發(fā)明的組合 物的標(biāo)簽可以是適合的?？蛇x地，標(biāo)簽可以標(biāo)識(shí)組合物的化學(xué)成分、可以標(biāo)識(shí)組合物的有益 性能、提供使用組合物和/或?qū)⒔M合物給予受試者的說(shuō)明。在一些實(shí)施方式中，用于給藥的組合物是藥物組合物或單位劑型。藥物組合物 和單位劑型可以包含預(yù)防或治療有效量的一種或多種預(yù)防或治療劑、以及通常一種或多 種藥用載體或賦形劑或稀釋劑。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中并且在這方面，術(shù)語(yǔ)“藥用”是指 得到了聯(lián)邦或州政府或列在美國(guó)藥典或其它一般公認(rèn)的藥典(用于動(dòng)物，更特別地用于 人類)中的管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。術(shù)語(yǔ)“載體”是指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全和 不完全的))、賦形劑、或媒介，通過(guò)其給予治療劑。這樣的藥物載體可以是無(wú)菌液體，如水 和油，包括那些石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油，如花生油、大豆油、礦物油、麻油等。當(dāng) 靜脈內(nèi)給予藥物組合物時(shí)，水可以是適當(dāng)?shù)妮d體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也 可以用作液體載體，尤其用于注射溶液。合適的藥物載體的實(shí)例描述在E.W.Martin的 “Remington，sPharmaceutical Sciences”中。保健品組合物可以但不必包含對(duì)于目前本 領(lǐng)域的醫(yī)生來(lái)說(shuō)不一定被認(rèn)為是藥用的一種或多種活性或非活性成分。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷，可以通過(guò)任何途徑來(lái)給予可用于增加抗氧化劑水平 (和/或降低氧化性化學(xué)物質(zhì)的血清濃度)的藥物或保健品組合物，包括但不限于口服、靜 脈內(nèi)、胃內(nèi)、十二指腸內(nèi)、腹腔內(nèi)或腦室內(nèi)。典型的藥物或保健品組合物和劑型包含一種或多種賦形劑。合適的賦形劑對(duì)于制 藥領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，并且合適的賦形劑的非限制性實(shí)例包括淀粉、葡萄糖、乳 糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂 奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。特定的賦形劑是否適合于加入到藥物或保健品組合 物或劑型中取決于本領(lǐng)域眾所周知的各種因素，包括但不限于將劑型給予患者的方式以及 劑型中的具體活性組分。組合物或單位劑型，如果需要的話，還可以包含少量的潤(rùn)濕劑或乳 化劑、或PH緩沖劑。本發(fā)明的無(wú)乳糖組合物可以包含賦形劑，該賦形劑在本領(lǐng)域是眾所周知的并且列 在，例如，美國(guó)藥典(USP) SP (XXI)/NF (XVI)中。通常，無(wú)乳糖組合物包含藥物相容和藥用量 的活性組分、粘合劑/填料、以及潤(rùn)滑劑。示例性的無(wú)乳糖劑型包含活性組分、微晶纖維素、 預(yù)膠化淀粉、以及硬脂酸鎂。本文披露的方法可以包括給予藥物組合物或保健品組合物和劑型，其包含可降低 通過(guò)其使活性組分分解的速率的一種或多種化合物。這樣的化合物，其在本文中稱作“穩(wěn)定 劑”，包括但不限于抗氧化劑如抗壞血酸、PH緩沖劑、或鹽緩沖劑。藥物組合物或保健品組合物和單位劑型可以采取以下形式溶液、懸浮液、乳劑、 片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、緩釋劑型等?？诜┬涂梢园?biāo)準(zhǔn)載體如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這樣的組合物和劑型將包含預(yù)防或治療有 效量的預(yù)防或治療劑(優(yōu)選以純化形式)、以及適量的載體，以便提供用于適合給予患者的 形式。劑型應(yīng)適合給予的方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，藥物組合物或單位劑型是無(wú)菌 的并以用于給予受試者的適宜形式，優(yōu)選動(dòng)物受試者，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，以及最優(yōu)選 人受試者。將用于增加血清抗氧化劑水平的藥物組合物或保健品組合物配制成與它預(yù)期的 給予途徑相容。給予途徑的實(shí)例包括但不限于胃腸道外，例如，靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、 皮下、口服、頰、舌下、吸入、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、局部、透粘膜、腫瘤內(nèi)、滑膜內(nèi)以及直腸給予。在一個(gè) 具體的實(shí)施方式中，按照常規(guī)程序?qū)⒔M合物配制成藥物組合物或保健品組合物，其適于靜 脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、口服、鼻內(nèi)或局部給予人類。在一個(gè)實(shí)施方式中，按照常規(guī)程序?qū)⑺幬?組合物配制成用于皮下給予人類。通常，用于靜脈內(nèi)給予的組合物是在無(wú)菌等滲含水緩沖 液中的溶液。必要時(shí)，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑如利諾卡因(lignocamne)以 在注射部位減輕疼痛。劑型的實(shí)例包括但不限于片劑；囊片；膠囊劑，如軟彈性明膠膠囊劑；扁囊劑；藥 片；錠劑；分散劑；栓劑；軟膏劑；泥敷劑(膏藥)；糊劑；粉劑；敷料；乳膏劑；硬膏劑；溶 液；貼劑；氣霧劑(例如，鼻腔噴霧劑或吸入劑)；凝膠劑；適合于口服或粘膜給予患者的液 體劑型，包括懸浮液(例如，含水或非水液體懸浮液、水包油乳劑、或油包水液體乳劑)、溶 液、以及酏劑；適合于胃腸道外給予患者的液體劑型；以及無(wú)菌固體(例如，結(jié)晶或無(wú)定形 固體)，其可以被重構(gòu)以提供適合于胃腸道外給予患者的液體劑型。組合物的劑型的組成、形狀、以及類型通常會(huì)取決于它們的用途而變化。例如，與 在慢性治療相同疾病中所使用的劑型相比，在急性治療障礙中所使用的劑型可以包含更大 量的一種或多種其所包括的成分。此外，治療有效劑型可以隨不同類型的疾病或障礙而變 化。類似地，與用來(lái)治療相同疾病或障礙的口服劑型相比，胃腸道外劑型可以包含更少量的 一種或多種其所包括的活性組分。這些和其它方式(其中本發(fā)明涵蓋的具體劑型將彼此不 同)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)會(huì)是容易明了的。參見(jiàn)，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed. , Mack Publishing, Easton PA(1990)o通常，包括所述組成的組合物的組分是分開(kāi)供給的或在單位劑型中混合在一起， 例如，作為在封閉地密封的容器如安瓿或小藥囊(sachette)(其指明活性劑的量)中干燥 的冷干粉或無(wú)水濃縮物。在通過(guò)輸注來(lái)給予組合物的情況下，可以借助于包含無(wú)菌藥物級(jí) 水或鹽水的輸液瓶來(lái)分配組合物。在通過(guò)注射給予組合物的情況下，可以提供無(wú)菌注射用 水或鹽水的安瓿，以便在給予以前可以混合組分。給予本文披露的任何組合物的方法可以使用包含如上所述的量的任何這樣的組 合物的劑型?？梢宰鳛閱未稳談┝炕蜃鳛檎麄€(gè)一天中的分開(kāi)劑量來(lái)給予劑量。本文披露的適合于口服給予的藥物組合物可以提供為離散劑型，如但不限于片劑 (例如，咀嚼片)、囊片、膠囊劑、以及液體(例如，調(diào)味糖漿)。這樣的劑型包含預(yù)定量的活性 組分，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的制藥方法來(lái)制備。通常參見(jiàn)，Remington’ s Pharmaceutical Sciences，18thed. ，Mack Publishing，Easton PA(1990)o在一些實(shí)施方式中，口服劑型是固體并且在無(wú)水條件下用無(wú)水成分制備，如在以 上部分中詳細(xì)地描述的。然而，用于給予的形式可以不同于無(wú)水的固體口服劑型。因此，本文描述了另外的形式。典型的口服劑型按照常規(guī)藥物配制技術(shù)通過(guò)組合均質(zhì)混合物中的活性組分與至 少一種賦形劑來(lái)制備。賦形劑可以采取各種形式，這取決于期望給予的制劑的形式。例如， 適用于口服液體或氣溶膠劑型的賦形劑包括但不限于水、二醇、油、醇、增香劑、防腐劑、以 及著色劑。適用于固體口服劑型(例如，粉劑、片齊U、膠囊劑、以及囊片)的賦形劑的實(shí)例包 括但不限于淀粉、糖類、微晶纖維素、稀釋劑、造粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、以及崩解劑?？梢杂糜诳诜┬偷馁x形劑的實(shí)例包括但不限于粘合劑、填料、崩解劑、以及潤(rùn) 滑劑。適用于藥物組合物和劑型的粘合劑包括但不限于玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、或其它淀 粉、明膠、天然和合成樹(shù)膠如阿拉伯膠、海藻酸鈉、海藻酸、其它海藻酸鹽、粉狀黃芪膠、瓜爾 豆膠、纖維素以及其衍生物(例如，乙基纖維素、醋酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維 素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、預(yù)膠化淀粉、羥丙基甲基纖維素(例如，2208J906、 四10號(hào))、微晶纖維素、以及它們的混合物。適用于本文披露的藥物組合物和劑型的填料的實(shí)例包括但不限于滑石、碳酸鈣 (例如，顆粒或粉末)、微晶纖維素、粉狀纖維素、葡聚糖結(jié)合劑、高嶺土、甘露醇、硅酸、山梨 醇、淀粉、預(yù)膠化淀粉、以及它們的混合物。藥物組合物中的粘合劑或填料通常以藥物組合 物或劑型的約50至約99wt%存在。微晶纖維素的適宜形式包括但不限于作為AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、 AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105 出售的物質(zhì)(可獲自 FMC Corporation,American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA)、以及它們的混合物。一種具體粘合劑是作為 AVICEL RC-581出售的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉的混合物。合適的無(wú)水或低水分賦形 劑或添加劑包括AVICEL-PH-103TM和淀粉1500LM。與本文披露的抗氧化劑促進(jìn)組合物一起使用崩解劑以提供當(dāng)暴露于含水環(huán)境時(shí) 會(huì)崩解的片劑。包含太多崩解劑的片劑可以在存儲(chǔ)過(guò)程中崩解，而那些包含太少崩解劑的 片劑可能不會(huì)以期望的速率或在期望的條件下發(fā)生崩解。因此，足量的崩解劑(其既不太 多也不太少，使得不會(huì)有害地改變活性組分的釋放)應(yīng)當(dāng)用來(lái)形成本發(fā)明的固體口服劑 型。所使用的崩解劑的量基于劑型的類型而變化，并且對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容 易辨別的。典型的藥物組合物包含約0. 5至約15wt%的崩解劑，尤其是約1至約5wt%的 崩解劑?？梢杂糜诒疚呐兜目寡趸瘎┐龠M(jìn)組合物的藥物劑型的崩解劑包括但不限于瓊 脂、海藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聚維酮、聚克立林鉀、淀粉羥基乙 酸鈉、土豆或木薯淀粉、預(yù)膠化淀粉、其它淀粉、粘土、其它褐藻膠、其它纖維素、樹(shù)膠、以及 它們的混合物。可以用于本文披露的抗氧化劑促進(jìn)組合物的藥物劑型的潤(rùn)滑劑包括但不限于硬 脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕質(zhì)礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其它二醇、硬脂 酸、十二烷基硫酸鈉、滑石、氫化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花油、麻油、橄欖油、玉米 油、以及大豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂、以及它們的混合物。另外的潤(rùn)滑 劑包括，例如，syloid 硅膠(AER0SIL 200，由 W. R. Grace Co. ofBaltimore, MD 制造)、合成 氧化硅的凝固氣霧劑(由 Degussa Co. of Piano, TX 銷售)、CAB-O-SIL (由 Cabot Co. of Boston，MA出售的熱解二氧化硅產(chǎn)品)、以及它們的混合物。如果完全使用的話，潤(rùn)滑劑的用量經(jīng)常為小于它們加入其中的藥物組合物或劑型的約lwt%。給予的劑量和頻率將有效預(yù)防、治療、管理、或改善障礙或其一種或多種癥狀的組合物的量將隨著疾 病或病癥的特性和嚴(yán)重性、以及給予活性組分的途徑而變化。頻率和劑量還將根據(jù)每位患 者特有的因素而變化，這取決于給予的具體治療劑(例如，治療或預(yù)防劑)，障礙、疾病、或 病癥的嚴(yán)重性，給予的途徑，以及患者的年齡、身體、體重、反應(yīng)、以及過(guò)去的醫(yī)療史。有效劑 量可以外推自來(lái)源于體外或動(dòng)物模型試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量-反應(yīng)曲線。上文已描述了待給予受 試者的可能劑量，以毫克組合物/千克受試者體重為單位表示。此外以上描述了可能的劑 量，其表示為每天給予受試者的組合物的毫克數(shù)。在其中純蛋白質(zhì)(例如，重組蛋白或商購(gòu)蛋白質(zhì))是起始原料的實(shí)施方式中，劑量 可以在上述范圍的較低端。在其中蛋白質(zhì)從乳汁或血清制備的實(shí)施方式中，在膳食補(bǔ)充劑 或食品配方中，劑量可以在上述范圍的較高端。可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)例如，受試者年 齡、體重、BMI或其它因素，來(lái)確定實(shí)際劑量?？梢宰鳛閱蝿┝炕蚍珠_(kāi)的劑量/天來(lái)給予組合 物。在一些實(shí)施方式中，以同樣分開(kāi)的劑量每日兩次給予每日劑量。在其它實(shí)施方式中，每 日三次給予每日劑量。在特定的實(shí)施方式中，以同樣分開(kāi)的劑量每日三次給予每日劑量。在 特定的實(shí)施方式中，以同樣分開(kāi)的劑量每日四次給予每日劑量。在一些實(shí)施方式中，可以每 日重復(fù)給予本文披露的組合物。在一些實(shí)施方式中，給予可以相隔至少1天、2天、或3天。有效量的本文描述的組合物會(huì)提供治療益處而沒(méi)有引起顯著毒性?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn) 制藥程序在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中來(lái)確定組合物的毒性，例如，通過(guò)確定LD50(導(dǎo)致50% 群體死亡的劑量)或LDltltl(導(dǎo)致100%群體死亡的劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比 是治療指數(shù)。呈現(xiàn)高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。獲自這些細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究的 數(shù)據(jù)可以用于制定對(duì)人用無(wú)毒性的劑量范圍。本文描述的化合物的劑量?jī)?yōu)選位于包括有 效劑量并具有很小或沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度的范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，這取決于 采用的劑型和采用的給予途徑。精確配方、給予途徑以及劑量可以由個(gè)人醫(yī)生考慮到患者 的情況來(lái)選擇。(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ingl et al.，1996，In :The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th ed. , Chapter 2, p. 29, ElliotM. Ross)。實(shí)施例使蛋白載有鋅的示例性方法方法1 用8ml的0. IM EDTA(溶解在水中)溫育40毫升的血清(來(lái)自各種動(dòng)物)1 小時(shí)。通過(guò)相對(duì)于4升的去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si 濃度)溫育EDTA處理的血清至少4小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。使40ml的血清相對(duì)于去 離子水經(jīng)受三輪滲析以除去過(guò)量的鋅首先，相對(duì)于10升18小時(shí)，然后相對(duì)于新鮮4升另 外4小時(shí)。方法2 用8ml的0. IM EDTA (溶解在水中)溫育40毫升的乳汁(來(lái)自各種動(dòng)物)1 小時(shí)。通過(guò)相對(duì)于4升的去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si 濃度)溫育EDTA處理的乳汁至少4小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。使40ml的乳汁經(jīng)受相對(duì) 于去離子水的兩輪滲析以除去過(guò)量的鋅首先，相對(duì)于10升18小時(shí)，然后相對(duì)于新鮮4升 另外4小時(shí)。方法3 在室溫下，用在IOml鹽水溶液(包含2mM HEPES，pH 7. 0)中的IOmM EDTA溫育蛋白質(zhì)溶液(各自40μ M的α-2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α 酸性糖蛋白 (AAG)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白，以任何組合或單一蛋白 質(zhì)類型)1小時(shí)。借助于通過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩的重復(fù)過(guò)濾來(lái)除去EDTA。用 50mM乙酸鋅溫育蛋白質(zhì)溶液GO μ Μ) 18小時(shí)。借助于相對(duì)于20體積的鹽水溶液(ρΗ 7. 0) 的四輪濃縮來(lái)除去過(guò)量的鋅離子，每次使用分子篩，其導(dǎo)致鋅離子的6X10—6的稀釋因子。 從蛋白質(zhì)溶液的IOKDa膜濾液確定了游離鋅離子濃度為約5-10 μ Μ，一種先前未觀測(cè)到細(xì) 胞毒性的濃度。方法4 在室溫下，用在IOml鹽水溶液(包含2mM HEPES, ρΗ 7. 0)中的5mM EDTA 來(lái)溫育蛋白質(zhì)溶液(各自40 μ M的α -2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α 酸性糖蛋 白(AAG)、α-l-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白)1小時(shí)。借助于通過(guò) 分子量截止值為IOKDa的分子篩的重復(fù)過(guò)濾來(lái)除去EDTA。用80 μ M的乙酸鋅溫育蛋白質(zhì)溶 液(40 μ Μ) 18小時(shí)。方法5 在室溫下，用在IOml鹽水溶液(包含2mM HEPES，pH 7. 0)中的IOmM EDTA 來(lái)溫育蛋白質(zhì)溶液(各自40 μ M的α -2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α 酸性糖蛋 白(AAG)、α-l-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白)1小時(shí)。借助于通過(guò) 分子量截止值為IOKDa的分子篩的重復(fù)過(guò)濾來(lái)除去EDTA。用50mM乙酸鋅溫育蛋白質(zhì)溶液 (40 μ Μ) 18小時(shí)。通過(guò)相對(duì)于1000體積的去離子水滲析2小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅離子。方法6 在室溫下，用在IOml鹽水溶液(包含2mM HEPES，pH 7. 0)中的IOmM EDTA 來(lái)溫育蛋白質(zhì)溶液(各自40 μ M的α -2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α 酸性糖蛋 白(AAG)、a-l-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ)、甲胎蛋白、白蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白)1小時(shí)。用50mM乙酸 鋅溫育蛋白質(zhì)溶液(40 μ Μ) 18小時(shí)。 Msa 11 ^ . -^ a a^i^Mt^Tffe方法1 在37°C下用木瓜蛋白酶(2，500單位，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的 載有鋅的血清G0ml)2小時(shí)。通過(guò)使溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為3KDa并可達(dá)IOKDa 的分子篩來(lái)收集片段。方法2:在37°C下用木瓜蛋白酶0，500單位，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的 載有鋅的乳汁GOml) 2小時(shí)。通過(guò)使溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為3KDa并可達(dá)IOKDa 的分子篩來(lái)收集片段。方法3:在37°C下用木瓜蛋白酶G68單位，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載 有鋅的蛋白(5ml，各自包含40μ M的α-2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α-1-酸性糖 蛋白(AAG)、α-l-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ)、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白)2小時(shí)。通過(guò)使溫 育混合物穿過(guò)分子量截止值為3KDa的分子篩來(lái)收集片段。方法4:在37°C下用木瓜蛋白酶G68單位，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載 有鋅的蛋白(5ml，各自包含40μ M的α-2-HS-糖蛋白(AHSG、或胎球蛋白)、α-1-酸性糖 蛋白(AAG)、α-l-抗胰蛋白酶(ΑΑΤ)、甲胎蛋白、白蛋白以及轉(zhuǎn)鐵蛋白)2小時(shí)?？赺丨,動(dòng)4勿研窮龍硫夷島素警體掛件X寸小薩J旨Ife細(xì)朐,__丨通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用最終EDTA濃度為IOmM的EDTA溫育豬血清1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫 育經(jīng)EDTA處理的血清至少4小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物，接著相對(duì)于去離子水進(jìn)行滲析。然后在37°C下用木瓜蛋白酶(60單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育載有鋅的血清 2小時(shí)。通過(guò)使溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為3KDa的分子篩來(lái)收集片段。在制備組合物以后，使包含豐富的胰島素受體的小鼠脂肪細(xì)胞細(xì)胞系3T3-L1的 細(xì)胞裂解液與組合物接觸。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示在圖1中，其表明組合物會(huì)在細(xì)胞系中抑制胰 島素受體信號(hào)活性，如通過(guò)酪氨酸激酶的比色ELISA測(cè)定(K-LISA PTK Screening Kit, Calbiochem cat#539701)所示。參照?qǐng)D1，孔1和2( —式兩份)包含單獨(dú)的細(xì)胞裂解液，孔3和4( 一式兩份)包 含與組合物接觸的細(xì)胞裂解液，孔5和6 ( —式兩份)包含細(xì)胞裂解液和胰島素，而孔7和 8(—式兩份)包含與組合物接觸的細(xì)胞裂解液和胰島素。如由孔的暗與亮染色模式(圖 案)所示，孔1和孔2對(duì)于3T3-L1細(xì)胞裂解液具有基底酪氨酸激酶活性，而向孔3和4中 添加組合物導(dǎo)致孔3和4中基底酪氨酸激酶活性的抑制。當(dāng)將胰島素加入到脂肪細(xì)胞的細(xì) 胞裂解液(參見(jiàn)孔5和6)中時(shí)，胰島素受體酪氨酸激酶活性更強(qiáng)。添加組合物(參見(jiàn)孔7 和8)消除了大部分胰島素誘導(dǎo)的胰島素受體酪氨酸激酶活性。人體試驗(yàn)#1通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫 育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪滲析 分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60單位/ 毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使溫育混 合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀、干燥、然后包裝到明 膠膠囊劑中。為了評(píng)估在攝入組合物后1天對(duì)人血清抗氧化劑水平的治療效果，進(jìn)行了以下實(shí) 驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始以前，從人受試者收集血液作為對(duì)照血清。來(lái)自商業(yè)來(lái)源的另一種對(duì)照血清 也用作參比。然后在上午7:00點(diǎn)，人受試者攝入200mg的在膠囊劑中的組合物。在第二天 早晨上午9:00點(diǎn)，收集空腹血液樣品。利用離心來(lái)分離血清。利用來(lái)自Cayman Chemical 的抗氧化劑測(cè)定試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，測(cè)試了對(duì)照和實(shí)驗(yàn)血清體外抑制自由基形成 的能力。用比色測(cè)定在A720nm處測(cè)量了自由基抑制的水平并且結(jié)果示于圖2中，示出為平 均值+/_標(biāo)準(zhǔn)差，其中N = 3。如圖2所示，相對(duì)于商業(yè)血清以及攝入組合物以前的人受試 者自身的血清兩者，在攝入組合物后大約26小時(shí)，人受試者呈現(xiàn)出更大的自由基抑制。人體試驗(yàn)#2通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃 度)溫育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪 滲析分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60 單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使 溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀、干燥、然后包 裝到明膠膠囊劑中。為了評(píng)估在攝入組合物后4天和6天對(duì)人血清抗氧化劑水平的治療效果，進(jìn)行了 以下實(shí)驗(yàn)從人受試者收集血液作為對(duì)照血清。連續(xù)6天，每天早上上午7:00點(diǎn)，人受試者攝入在膠囊劑中的200mg組合物。在第1天(在首次攝入后2小時(shí))、第4天、以及第6天 的上午9:00點(diǎn)收集空腹血液。利用離心分離血清，然后利用來(lái)自Cayman Chemical的抗氧 化劑測(cè)定試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)重復(fù)兩次測(cè)量了總血清抗氧化劑水平。測(cè)得的血清抗 氧化劑水平示出在圖3中。雖然在第1天在攝入以后2小時(shí)，血清抗氧化劑水平稍微降低， 但在第4天血清抗氧化劑水平相對(duì)于對(duì)照大約為兩倍，并且在第6天血清抗氧化劑水平大 約是三倍。人體試驗(yàn)#3通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃 度)溫育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的兩輪 滲析分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60 單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使 溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀、干燥、然后包 裝到明膠膠囊劑中。為了評(píng)估組合物是否通過(guò)超氧化物歧化酶的增加的活性會(huì)呈現(xiàn)出增加的抗氧化 劑活性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段以前，在上午9:00點(diǎn)從人受試者收集空腹血液作為 對(duì)照樣品。連續(xù)6天，每天早上上午7:00點(diǎn)，人受試者攝入在膠囊劑中的250mg組合物。 在第6天上午9:00點(diǎn)收集空腹血液。通過(guò)在離心后除去血清來(lái)分離血細(xì)胞。通過(guò)利用來(lái) 自NorttwestLife Science的超氧化物歧化酶活性測(cè)定試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，測(cè)量 了細(xì)胞內(nèi)Cu/Si超氧化物歧化酶(SOD)活性。將血細(xì)胞裂解液分別稀釋25倍和500倍，并 在時(shí)間過(guò)程中測(cè)量自動(dòng)氧化反應(yīng)的SOD抑制。測(cè)得的對(duì)25倍稀度樣品和500倍稀度樣品的超氧化物歧化酶活性的影響分別示 出在圖4和圖5中。如圖4所示，在25倍稀度下，對(duì)照血細(xì)胞裂解液和6天血細(xì)胞裂解液 (即，在攝入組合物6天以后獲得的裂解液)兩者均強(qiáng)烈抑制自動(dòng)氧化。如圖5所示，在500 倍稀度下，在對(duì)照血細(xì)胞裂解液存在的情況下沒(méi)有檢測(cè)到SOD活性，而在6天血細(xì)胞裂解液 存在的情況下，檢測(cè)到顯著的SOD活性，S卩，隨時(shí)間自動(dòng)氧化的顯著抑制。人體試驗(yàn)#4 中期影響通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫 育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪滲析 分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60單位/ 毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使溫育混 合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。為了評(píng)估對(duì)空腹人血清胰島素水平的治療效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段期 間，人受試者攝入20ml(10mg/ml)液體劑型的組合物25天。在對(duì)照階段期間，監(jiān)測(cè)人受試 者，同時(shí)沒(méi)有攝入本發(fā)明的組合物1個(gè)月。在上述月期間，在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲取血液樣品。 利用ELISA測(cè)定法，測(cè)試每種樣品(一式兩份)的空腹胰島素和供給的胰島素水平。如從 圖6可以看到的，攝入組合物會(huì)顯著降低受試者的空腹胰島素水平。在實(shí)驗(yàn)階段期間，空腹 胰島素水平為1. 38+/-0. 04μ U/ml。對(duì)照階段的胰島素水平為2. 02+/-0. 07μ U/ml。本發(fā)明的組合物使受試者的胰島素水平降低約32%。另外，雖然未在圖中示出，但在實(shí)驗(yàn)階段期間供給的胰島素水平是 30+/-13. 65yU/mL·對(duì)照階段的供給的胰島素水平是22+/-7. 21 μ U/ml。因此，本發(fā)明的組 合物并不顯著改變供給的胰島素水平。這表明，組合物并不會(huì)不加區(qū)別地抑制胰島素的釋 放。在沒(méi)有食品存在的情況下，組合物會(huì)降低血液中的循環(huán)胰島素，而飯后會(huì)快速釋放胰島 素。該現(xiàn)象意味著，本發(fā)明的組合物會(huì)增加受試者的胰島素敏感性。人體試驗(yàn)#5 通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫 育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪滲析 分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60單位/ 毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使溫育混 合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。為了評(píng)估在大約1個(gè)月的期間內(nèi)對(duì)血清抗氧化劑水平和血清自由基水平的治療 效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段期間，人受試者攝入20ml (10mg/ml)液體形式的組合物 25天。在對(duì)照階段期間，監(jiān)測(cè)人受試者，同時(shí)在1個(gè)月內(nèi)沒(méi)有攝入一定量的組合物。在上述 月期間，在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)獲取血液樣品。利用Calbiochem總抗氧化劑狀態(tài)測(cè)定試劑盒測(cè) 試每種樣品(一式兩份)的抗氧化劑水平。在兩個(gè)階段中的每一個(gè)期間，在3個(gè)不同的時(shí) 間點(diǎn)還獲取尿樣品，以利用OXIDATA氧化應(yīng)激試驗(yàn)來(lái)確定自由基的水平。如圖7所示，在對(duì)照階段期間抗氧化劑水平為1. 07+/-0. 32mM。在實(shí)驗(yàn)階段期間 的抗氧化劑水平為1. 88+/-0. 39mM。本發(fā)明的組合物使受試者的抗氧化劑水平增加大約 76%。如圖8所示，通過(guò)比色測(cè)定測(cè)量了在對(duì)照階段期間的自由基水平。在A450處的吸 光度為0. 30+/-0. 04。在實(shí)驗(yàn)階段期間，自由基水平為0. 10+/-0. 02。本發(fā)明的組合物使受 試者尿中的自由基降低大約66%。人體試驗(yàn)#6 長(zhǎng)期影響在3年期間內(nèi)，人受試者重復(fù)攝入多種組合物，所述組合物包含來(lái)源于哺乳動(dòng)物 血清和乳汁的載有鋅的肽片段。以各種劑型給予組合物。例如，人受試者攝入以液體形式 或膠囊劑形式的牛和豬血清肽，范圍為5mg-250mg/天；以液體形式、膠囊劑形式、或干粉而 不是膠囊劑形式的牛奶肽，范圍為10mg-450mg/天；以及以液體或膠囊劑形式的鋅-胎球蛋 白肽片段，范圍為Img-IOmg/天。在構(gòu)成3年期間的天數(shù)中，大約75%或更多的天數(shù)攝入各 種組合物和劑型。盡管攝入的頻率變化，但在3個(gè)星期期間內(nèi)人受試者始終至少攝入一次 組合物。換句話說(shuō)，在隨后攝入之間時(shí)間的最長(zhǎng)間隔小于3周。從獲取肽的第一個(gè)日期開(kāi)始3年，人受試者禁食過(guò)夜。在早上上午7:00點(diǎn)收集唾 液和血清。通過(guò)利用來(lái)自Cayman Chemical的抗氧化劑測(cè)定試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)， 測(cè)試了對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣品體外抑制自由基形成的能力。圖9示出了如通過(guò)比色測(cè)定在A720nm 處(N = 3)測(cè)得的自由基抑制的水平。與正常人相比，志愿者的唾液的自由基水平類似于 在正常人血清中的水平。相反，受試者的血清自由基水平則低得多，這表明受試者的血清具 有強(qiáng)抗氧化劑能力，其足以中和高百分比的自由基物質(zhì)。
線蟲(chóng)長(zhǎng)壽研究為了確定組合物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響，通過(guò)以下方法制備了組合物用EDTA(以 20mM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。 用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀 物。通過(guò)兩輪相對(duì)于去離子水的滲析分別為18小時(shí)和4小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C 下，用木瓜蛋白酶(60單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的 乳汁2小時(shí)。通過(guò)使溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。于是，組合物是由猶他大學(xué)進(jìn)行的線蟲(chóng)長(zhǎng)壽研究的主題。在該研究中，40只L4幼 蟲(chóng)N2 (野生型)蠕蟲(chóng)的對(duì)照組在4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)NGM瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)，并且40只L4幼蟲(chóng) N2 (野生型)蠕蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)組在4個(gè)包含1 500稀度的液體形式的10mg/ml肽的NGM平板 上進(jìn)行培養(yǎng)。所有平板接種有大腸桿菌菌株0P50并存儲(chǔ)在4°C下直到需要。每天將蠕蟲(chóng)轉(zhuǎn) 移到新鮮平板直到停止產(chǎn)生子代，其后每周進(jìn)行轉(zhuǎn)移。記錄每天存活動(dòng)物的平均數(shù)?；谌鄙賹?duì)刺激(prodding)的反應(yīng)和缺少咽抽吸 (pharyngeal pumping)，蠕蟲(chóng)被評(píng)估為死亡。利用平均值，計(jì)算存活動(dòng)物的分?jǐn)?shù)。此外，計(jì)算 每天死亡動(dòng)物的數(shù)目并且數(shù)值用于對(duì)數(shù)等級(jí)檢驗(yàn)，以檢查針對(duì)生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)平板上的N2蠕 蟲(chóng)與用本發(fā)明的組合物培養(yǎng)的N2蠕蟲(chóng)所獲得的數(shù)值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。該研究表明，線蟲(chóng)攝入組合物會(huì)顯示弱的但統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加的壽命。如圖10所 示，在對(duì)照組中，50 %的蠕蟲(chóng)在第14天死亡，而50 %的攝入組合物的蠕蟲(chóng)則在第17天死亡。 這表明中值壽命增加21 %。與攝入肽的最后的蠕蟲(chóng)在第25天死亡相比，最后的對(duì)照蠕蟲(chóng)在 第20天死亡。假設(shè)人類平均壽命是75歲，則這種組合物可能會(huì)增加壽命15年。一種可能的解釋涉及在線蟲(chóng)中編碼胰島素樣受體的daf-2基因。研究者研究表 明，在daf-2中的突變會(huì)使蠕蟲(chóng)的壽命加倍。已知該基因會(huì)調(diào)節(jié)生殖發(fā)育、老化、對(duì)氧化應(yīng) 激的抗性、耐熱性、對(duì)缺氧的抗性、以及還對(duì)細(xì)菌病原體的抗性。因此，可以是這樣的情況， 載有鋅的肽片段改進(jìn)用來(lái)調(diào)節(jié)線蟲(chóng)的老化的由daf-2基因的表達(dá)。人體試驗(yàn)#7 對(duì)血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平的影響通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃 度)溫育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪 滲析分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60 單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使 溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀，干燥，然后包 裝到明膠膠囊劑中。為了確定在給予人受試者以后組合物對(duì)血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平的影響，進(jìn)行了 以下實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段以前，從人受試者收集血液以用作對(duì)照血清。連續(xù)六天，每天早上上 午7:00點(diǎn)，人受試者攝入以膠囊劑形式的200mg組合物。在第4天和第6天，在上午9:00 點(diǎn)收集空腹血液。利用離心分離血清。利用LINCO活性生長(zhǎng)激素釋放肽ELISA試劑盒測(cè)試 每種樣品(一式三份)的生長(zhǎng)激素釋放肽水平。如圖11所示，在獲取組合物以前受試者的血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平(即，對(duì)照) 具有0.019+/-0.001的A450nm吸光度讀數(shù)。在實(shí)驗(yàn)階段期間，血清生長(zhǎng)激素釋放肽水平為0. 024+/-0. 005和0. 039+/-0. 01。因此，組合物統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地增加了受試者的血清生長(zhǎng) 激素釋放肽水平，因而，在6天期間具有增加的趨勢(shì)。人體試驗(yàn)#8 對(duì)血清TNF- α水平的影響通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃度)溫 育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪滲析 分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60單位/ 毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使溫育混 合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀、干燥、然后包裝到明 膠膠囊劑中。為了確定在給予人受試者以后組合物對(duì)血清TNF-α水平的影響，進(jìn)行了以下實(shí) 驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段以前，從人受試者收集血液作為對(duì)照血清。連續(xù)六天，每天早上上午7:00 點(diǎn)，人受試者攝入以膠囊劑形式的200mg組合物。在第4天和第6天，在上午9:00點(diǎn)，收集 空腹血液。禾1J用離心分離血清。禾U用來(lái)自Pierce Biotechnology, Inc.的Endogen Human TNF-α ELISA試劑盒根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，確定了血清TNF-α水平。如圖12所示，在獲取組合物以前，受試者的血清TNF- α水平(即，對(duì)照)在1. Spg/ ml的正常范圍內(nèi)。在每日攝入組合物4天和6天以后，受試者的血清TNF-α水平分別降 低至0. 15pg/ml和0. 18pg/ml。該結(jié)果符合由本發(fā)明的組合物誘導(dǎo)的血清生長(zhǎng)激素釋放肽 水平的增加，因?yàn)橐呀?jīng)表明，生長(zhǎng)激素釋放肽可以抑制促炎因子的分泌，包括TNF-α (Am J PhysiolEndocrinol Metab. 293 1697—702，2007)。人體試驗(yàn)#9 對(duì)血清甘油三酯水平的影響通過(guò)以下方法來(lái)制備組合物用EDTA(以IOmM的最終EDTA濃度)溫育牛奶1小 時(shí)。通過(guò)相對(duì)于去離子水滲析3小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的EDTA。用乙酸鋅(以50mM的最終Si濃 度)溫育經(jīng)EDTA處理的乳汁18小時(shí)。通過(guò)離心除去沉淀物。通過(guò)相對(duì)于去離子水的三輪 滲析分別為4小時(shí)、4小時(shí)、以及18小時(shí)來(lái)除去過(guò)量的鋅。在37°C下，用木瓜蛋白酶(60 單位/毫升乳汁混合物，來(lái)自木瓜乳)溫育如上所述制備的載有鋅的乳汁2小時(shí)。通過(guò)使 溫育混合物穿過(guò)分子量截止值為IOKDa的分子篩來(lái)收集片段。使蛋白質(zhì)沉淀、干燥、然后包 裝到明膠膠囊劑中。為了確定在給予人受試者以后，組合物對(duì)血清甘油三酯水平的影響，進(jìn)行了以下 實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)階段以前，從人受試者收集血液以用作對(duì)照血清。連續(xù)8天，每天早上上午 7:00點(diǎn)人受試者攝入以膠囊劑形式的200mg組合物。在第9天，在上午9:00收集空腹血 液。利用離心分離血清。在第11天(兩天沒(méi)有攝入組合物)，在上午9:00收集空腹血液。 利用離心分離血清。在第19天(10天沒(méi)有攝入組合物)，在上午9:00收集空腹血液。利用 離心分離血清。利用Cardiochek 甘油三酯測(cè)試條和分析儀測(cè)試了每種樣品(一式三份) 的甘油三酯水平。如圖13所示，在獲取組合物以前，受試者的血清甘油三酯水平(S卩，對(duì)照)是 109+/-5. lmg/dl。在實(shí)驗(yàn)階段期間，血清甘油三酯水平是77. 3+/-4. ang/dl。在沒(méi)有攝入組 合物的2天和10天的血清甘油三酯水平是66. 3+/-3. 5mg/dl和91. 0+/-5. 3mg/dl。因此， 組合物統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地降低了受試者的血清甘油三酯水平。在沒(méi)有另外每日攝入組合物的情況下，甘油三酯降低效應(yīng)持續(xù)至少兩天，并且在10天洗出期間以后甘油三酯水平回到更 高的水平。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中增加血清抗氧化劑濃度的組合物，包括第一鋅結(jié)合蛋 白的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段可通過(guò)以下方法來(lái)獲得，所述方法包括以任一次序的下列步驟片段化所述第一鋅結(jié)合蛋白；以及使所述鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物是膳食補(bǔ)充劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物是食品添加劑或食物成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物是藥物組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述藥物組合物另外包括藥用載體、賦形劑、 或稀釋劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述組合物是保健品組合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述第一鋅結(jié)合蛋白選自由 α-2-HS-糖蛋白、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組 成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物另外包括通過(guò)包括片 段化第二鋅結(jié)合蛋白的方法產(chǎn)生的第二多個(gè)載有鋅的蛋白片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述第一鋅結(jié)合蛋白和第二鋅結(jié)合蛋白中的 每一個(gè)選自由α -2-HS-糖蛋白、α -1-酸性糖蛋白、α 抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以 及甲胎蛋白組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述組合物另外包括通過(guò)包括片段化第三鋅 結(jié)合蛋白的方法產(chǎn)生的第三多個(gè)載有鋅的蛋白片段，并且其中所述第一鋅結(jié)合蛋白、第二 鋅結(jié)合蛋白、以及第三鋅結(jié)合蛋白中的每一個(gè)選自由α -2-HS-糖蛋白、α -1-酸性糖蛋白、 α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋白組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述第一多個(gè)載有鋅的蛋白片 段的平均分子量在約0. 3千道爾頓至約50千道爾頓的范圍內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段的平均分 子量在約0. 4千道爾頓至約3千道爾頓的范圍內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有大于 50千道爾頓的載有鋅的蛋白片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述組合物基本上沒(méi)有大于3千道爾頓的載 有鋅的蛋白片段。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物以單位劑型，其中，所述 哺乳動(dòng)物是人并且單位劑量是至少約1. 4mgo
17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物以每日劑型，其中，所述 哺乳動(dòng)物是人并且每日劑量可達(dá)約3. 5g。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物可通過(guò)以下制備方法來(lái)獲得，所述制備 方法包括以任一次序的下列步驟使鋅結(jié)合血清或乳蛋白或其片段與螯合劑接觸；使所述蛋白或其片段與鋅離子接觸；以及片段化所述蛋白或進(jìn)一步片段化其片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的組合物，進(jìn)一步包括使所述蛋白或其片段與載體、賦形劑、 或稀釋劑接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的組合物，其中，所述螯合劑是EDTA或EGTA或EDTA和 EGTA的混合物，并且所述螯合劑的濃度為約5mM至約25mM。
21.根據(jù)權(quán)利要求18至20中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述制備方法進(jìn)一步包括除 去所述螯合劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的組合物，其中，除去所述螯合劑包括過(guò)濾或滲析。
23.根據(jù)權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述制備方法進(jìn)一步包括除 去未結(jié)合于任何蛋白的過(guò)量的鋅。
24.根據(jù)權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述制備方法進(jìn)一步包括使 所述鋅結(jié)合蛋白片段與大于50千道爾頓的分子分離。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的組合物，其中，所述鋅結(jié)合蛋白片段分離自大于3千道爾頓 的分子。
26.根據(jù)權(quán)利要求18至25中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，使所述蛋白與鋅接觸采用了 在約ImM至500mM乙酸鋅范圍內(nèi)的鋅。
27.根據(jù)權(quán)利要求18至沈中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述蛋白用蛋白酶片段化。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的組合物，其中，所述蛋白酶是木瓜蛋白酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求18至觀中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述鋅結(jié)合血清或乳蛋白選 自α-2-HS-糖蛋白、α-l-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及甲胎蛋 白。
30.根據(jù)權(quán)利要求18至四中任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述血清或乳蛋白是哺乳動(dòng) 物血清或乳蛋白。
31.一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中抑制胰島素受體信號(hào)活性的組合物，包括第一鋅結(jié) 合蛋白的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段，所述組合物可通過(guò)包括以任一次序的下列步驟的方 法來(lái)獲得片段化所述第一鋅結(jié)合蛋白；以及使所述鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。
32.一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽濃度的組合物，包括第一 鋅結(jié)合蛋白的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段，所述組合物可通過(guò)包括以任一次序的下列步驟 的方法來(lái)獲得片段化所述第一鋅結(jié)合蛋白；以及使所述鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。
33.一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中降低血清TNF-α濃度的組合物，包括第一鋅結(jié)合蛋 白的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段，所述組合物可通過(guò)包括以任一次序的下列步驟的方法來(lái) 獲得片段化所述第一鋅結(jié)合蛋白；以及使所述鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。
34. 一種用于在哺乳動(dòng)物受試者中降低血清甘油三酯濃度的組合物，包括第一鋅結(jié)合 蛋白的第一多個(gè)載有鋅的蛋白片段，所述組合物可通過(guò)包括以任一次序的下列步驟的方法 來(lái)獲得片段化所述第一鋅結(jié)合蛋白；以及 使所述鋅結(jié)合蛋白或其片段與鋅離子接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了組合物和方法，用于增加血清抗氧化劑水平、降低氧化性化學(xué)物質(zhì)的血清水平、抑制胰島素受體信號(hào)活性、降低甘油三酯水平、增加血清生長(zhǎng)激素釋放肽(葛瑞林，ghrelin)水平、以及降低血清TNF-α水平。提供的組合物包含例如來(lái)源于血清或乳汁的載有鋅的、片段化蛋白的混合物。以治療有效量，例如降低在哺乳動(dòng)物受試者中的氧化應(yīng)激水平給予組合物。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102105160SQ200980128864
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者門(mén)·赫為·特賽 申請(qǐng)人:安普瑞克斯生物工程公司