本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人脂肪干細(xì)胞凍存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是近年來(lái)從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有可迅速擴(kuò)增、不易衰老等一般干細(xì)胞的特點(diǎn)。人脂肪干細(xì)胞即人體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能。adscs呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。細(xì)胞周期分析顯示g0/g1期的細(xì)胞占69％，s期占24％，g2/m期占8％。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2-3天細(xì)胞增殖i倍。多次傳代(10-20代)后，細(xì)胞增殖速度無(wú)明顯減慢，在傳代6次后細(xì)胞群體中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，第15代細(xì)胞群體中衰老細(xì)胞約占15％。
由于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，原代細(xì)胞鋪滿的時(shí)間約2周以上，達(dá)到一定的數(shù)量需要3周左右。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代容易發(fā)生自發(fā)分化，失去其多向分化的潛能。所以為保證實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，必須隨時(shí)提供大量的實(shí)驗(yàn)或組織工程用的種子細(xì)胞。因此，對(duì)于細(xì)胞的需求非常強(qiáng)烈?，F(xiàn)在，將生產(chǎn)好的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，使用時(shí)再幾種解凍使用也是常規(guī)的使用模式。然而現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞凍存使用的凍存液有含血清和無(wú)血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，無(wú)血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢(shì)。低溫保存干細(xì)胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護(hù)。常用到的細(xì)胞保護(hù)劑還有羥乙基淀粉0es)、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對(duì)凍存的干細(xì)胞造成不可逆的損傷。為獲得來(lái)源方便的神經(jīng)干細(xì)胞，開(kāi)展有效的神經(jīng)干細(xì)胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長(zhǎng)期低溫保存人脂肪干細(xì)胞的方法對(duì)于促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的研宄和應(yīng)用具有重大意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人脂肪干細(xì)胞冷凍保存液以及相應(yīng)的制備方法及使用方法。
紅果黃肉楠是一種小喬木，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，該植物中具有能夠耐寒冷的物質(zhì)存在，因此，申請(qǐng)人通過(guò)高通量篩選獲得了相應(yīng)的具有耐寒的多肽，因此，申請(qǐng)人嘗試將其加入到冷凍保存液中，用于保存細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種人脂肪干細(xì)胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成：其特征是冷凍存液中含有:0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-32任一所示。所述多肽有申請(qǐng)人通過(guò)前期的大量的基因庫(kù)篩選得到，所述多肽具有保護(hù)細(xì)胞免受損傷的功能。其名稱分別為kats-1、kats-2、kats-3、kats-4、kats-5、kats-6、kats-7、kats-8、kats-9、kats-10、kats-11、kats-12、kats-13、kats-14、kats-15、kats-16、kats-17、kats-18、kats-19、kats-20、kats-21、kats-22、kats-23、kats-24、kats-25、kats-26、kats-27、kats-28、kats-29、kats-30、kats-31、kats-32，其依次對(duì)應(yīng)于seqidno：1-32。
在本發(fā)明的細(xì)胞的凍存液中，海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來(lái)傷害對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是多肽，還具有保護(hù)細(xì)胞免受凍存時(shí)冰結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
本發(fā)明還提供了一種人脂肪干細(xì)胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。
本發(fā)明還提供了一種人脂肪干細(xì)胞凍存方法，包括以下步驟:
a.凍存液制備:制備所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；
b.細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的人脂肪細(xì)胞一瓶，0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；
c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；
d.細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次。所述細(xì)胞懸浮濃度為108細(xì)胞/ml-1010細(xì)胞/ml。
本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的人脂肪干細(xì)胞凍存液，復(fù)蘇細(xì)胞存活率可達(dá)97％以上，較使用常規(guī)細(xì)胞凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒(méi)有細(xì)胞的損耗。
本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液可以長(zhǎng)期保存干細(xì)胞，細(xì)胞活性不發(fā)生變化，保證了細(xì)胞生物學(xué)活性。
本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，操作簡(jiǎn)單可行，價(jià)格適宜，具有較好的實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1多肽的制備
取紅果黃肉楠葉片5g，清洗干凈，絞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量8000iu/g葉片，酶解溫度47℃，ph值7.5，酶解時(shí)間1.5h，酶解完成后90℃滅酶10min；滅酶后的物料過(guò)濾除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4％活性炭吸附脫色，用葡聚糖g-50(sephadexg-50)進(jìn)行多肽分離，20mmol/lhcl溶液洗脫，流速1.3ml/分鐘，分別收集不同時(shí)間段的洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液至ph7.0，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，經(jīng)大孔樹(shù)脂da201-c脫鹽處理后，真空濃縮，上清液冷凍干燥備用；經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)，回收小分子量的條帶，其中經(jīng)過(guò)功能驗(yàn)證，共得到32個(gè)小肽的序列具有穩(wěn)定人脂肪干細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)，保持干細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)的功效。根據(jù)色譜柱中不同的峰值分離時(shí)間，可以批量獲得相應(yīng)的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如seqidno：1-32所示。分別命名為kats-1～32。
實(shí)施例2人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：1所示。
實(shí)施例3人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：2所示。
實(shí)施例4人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：3所示。
實(shí)施例5人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：4所示。
實(shí)施例6人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：5所示。
實(shí)施例7人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：6所示。
實(shí)施例8人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：7所示。
實(shí)施例9人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：8所示。
實(shí)施例10人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：9所示。
實(shí)施例11人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：10所示。
實(shí)施例12人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：11所示。
實(shí)施例13人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：12所示。
實(shí)施例14人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：13所示。
實(shí)施例15人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：14所示。
實(shí)施例16人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：15所示。
實(shí)施例17人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：16所示。
實(shí)施例18人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：17所示。
實(shí)施例19人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：18所示。
實(shí)施例20人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：19所示。
實(shí)施例21人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：20所示。
實(shí)施例22人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：21所示。
實(shí)施例23人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：22所示。
實(shí)施例24人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：23所示。
實(shí)施例25人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：24所示。
實(shí)施例26人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：25所示。
實(shí)施例27人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：26所示。
實(shí)施例28人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：27所示。
實(shí)施例29人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：28所示。
實(shí)施例30人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：29所示。
實(shí)施例31人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：30所示。
實(shí)施例32人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：31所示。
實(shí)施例33人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml，其中所述多肽的序列如seqidno：32所示。
實(shí)施例34人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
將0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用dmem培養(yǎng)基定容至100ml。
實(shí)施例35比較例
以cn102550542b中授權(quán)的無(wú)血清凍存液作為對(duì)照凍存液。
實(shí)施例36凍存液的效果驗(yàn)證
以上實(shí)施例2-34及比較例所制備的細(xì)胞凍存液，分別按照下述方法進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞凍存過(guò)程:
培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的人脂肪干細(xì)胞，其細(xì)胞密度約6*109個(gè)/ml，加入ph7.0的pbs洗細(xì)胞表面一次。
將細(xì)胞用0.20％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實(shí)施例1-33和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無(wú)菌的凍存管內(nèi)；
冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個(gè)月，8個(gè)月。每組3個(gè)重復(fù)。
細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果如下：
由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的凍存液，特別適合于人脂肪干細(xì)胞的凍存培養(yǎng)，具有較好的細(xì)胞保護(hù)活性。
實(shí)施例37干細(xì)胞抗原檢測(cè)
脂肪干細(xì)胞具有多種特異性抗原和受體，主要有3、13、d29、34、45、cd49e、cd59、cd73、cd90、cd105、hla-abc等。
取實(shí)施例36凍存4個(gè)月的脂肪干細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，用1:1的2.5％的胰蛋白酶溶液和0.0296edta溶液混合消化，用含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs洗滌后制成每100ul含有1*1o6個(gè)單細(xì)胞懸液，等分為7份，分別加入7個(gè)eppendorf管中并編號(hào)，一號(hào)管加入共20μl的fitcmouseiggl、apc_cy7mouseigg2b和染色緩沖液用于檢測(cè)由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景作為對(duì)照，其他試管分別加入cd29、cd34、44、45、105、hla.dr單克隆抗體各20μl，每管分別加入細(xì)胞懸液100μl(含1*106個(gè)細(xì)胞)，室溫孵育25min，用含1％bsa的pbs洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析結(jié)果:流式細(xì)胞儀分析人脂肪干細(xì)胞六種表面抗原29，34，44，cd45，cd105和hla.dr,結(jié)果表明使用實(shí)施例2-34培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)胞具有人脂肪干細(xì)胞特性。hla.dr陰性，排除該類細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
實(shí)施例38成脂誘導(dǎo)及檢測(cè)
由于脂肪干細(xì)胞具有多向分化能力，在一定的條件下對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，能夠得到特定功能的已分化的細(xì)胞。
取實(shí)施例36凍存4個(gè)月的脂肪干細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入地塞米松，使用通用的方法對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)。通過(guò)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，所有的凍存的干細(xì)胞均可以向脂肪細(xì)胞分化，并且基本上全部都分化為脂肪細(xì)胞，具有較高的活性。這充分說(shuō)明，凍存后的脂肪干細(xì)胞仍然保留原始的細(xì)胞活性。
以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改變和改進(jìn)，這些都屬于發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
〈110〉李倩
〈120〉一種人脂肪干細(xì)胞用的細(xì)胞凍存液
〈160〉32
〈210〉1
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-1
lmshcqmhephcpaigvw
〈210〉2
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-2
isrwetriengvfhnpgy
〈210〉3
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-3
yceqqnhrtcdavgkliq
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-4
gwmmcidpimpgmqamqk
〈210〉5
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-5
prrsmryrrlawsqslpf
〈210〉6
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-6
qdsrifrkwiqgqsyyqf
〈210〉7
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-7
gdilrpknfyrwskadvg
〈210〉8
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-8
fqhcnyqyemslwaeqcy
〈210〉9
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-9
rkttkrkckggeqgrqa
〈210〉10
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-10
vlydnrpwqsarqser
〈210〉11
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-11
disygnrrsggfksega
〈210〉12
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-12
cdigrgpascditvqi
〈210〉13
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-13
pwsitpimcrrgrrifs
〈210〉14
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-14
rhwampnqcrqcyhnf
〈210〉15
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-15
amqdkaesflldlkssew
〈210〉16
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-16
irtwrlcgcnirhmfig
〈210〉17
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-17
rvtqniwnwqltilqc
〈210〉18
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-18
emfkvkndvtwysyqwgs
〈210〉19
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-19
qfqhlgwqvdrnmrekd
〈210〉20
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-20
rmnaqledkltflmie
〈210〉21
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-21
kgsrpwrpfqgpmrdid
〈210〉22
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-22
eqeplhppqhghqsts
〈210〉23
〈211〉18
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-23
kcnpqsmvhtedwqpyyw
〈210〉24
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-24
aastghamhyqeffnga
〈210〉25
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-25
ndsdwisgsfdeqnhq
〈210〉26
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-26
rgsiagqgrdtwdmlgp
〈210〉27
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-27
ccqwytrtvqrmrprt
〈210〉28
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-28
qqehsqpshlqstigcr
〈210〉29
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-29
talsrfwhmepshrrf
〈210〉30
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-30
setkgqfrtgrhtqagq
〈210〉31
〈211〉16
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-31
psrgypcdwgdvqppw
〈210〉32
〈211〉17
〈212〉prt
〈213〉人工序列
〈400〉kats-32
gvtfqcmnngiiqtyeq