一種無動物源血清的細胞凍存液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞治療領(lǐng)域，特別涉及一種無動物源血清的細胞凍存液，所述的無動物源血清的細胞凍存液包含以下體積百分比成分：人血白蛋白5?15％、二甲基亞砜5?15％、羥乙基淀粉70?90％，該細胞凍存液不含動物血清，因此不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可能性，凍存復(fù)蘇后在用于繼續(xù)培養(yǎng)或臨床直接回輸，安全有效，制備方法簡單，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。細胞復(fù)蘇后的活性達到90％左右，細胞表型基本沒有變化，從而保持了細胞復(fù)蘇后的生理功能和生物學(xué)功能，本發(fā)明適用于單個核細胞及其他各類細胞的冷凍儲存。
【專利說明】
一種無動物源血清的細胞凍存液
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于細胞治療領(lǐng)域，特別涉及一種無動物源血清的細胞凍存液及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞凍存是細胞長期保存的方法之一，對供體的細胞深低溫保存可保持其活力和 功能，這樣在需要的時候再復(fù)蘇使用。無論對臨床還是基礎(chǔ)研究均具有重要的意義。影響細 胞凍存和復(fù)蘇活性的主要因素包括冷凍及復(fù)蘇的方式和冷凍劑的選擇。細胞凍存過程會顯 著改變細胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損傷的危險。為了將細胞凍存、 復(fù)蘇過程中細胞的損傷將至最低，必須進一步優(yōu)化化學(xué)和溫度操作過程。細胞在-70°C~_ 80°C凍存，細胞活性會伴隨著冷凍時間的延長迅速下降，在-196°C時細胞生物學(xué)幾乎停止， 因此要長期保存細胞，液氮溫度是最佳的存儲溫度，但需要在凍存前加入一種或一種以上 的凍存保護劑，在溶解后又將其去除。目前最常用的的凍存保護劑為二甲基亞砜(DMSO)和 甘油兩種，而甘油作為冷凍保護劑凍存的細胞存活率較低，DMSO可迅速投入細胞，提高細胞 膜對水的通透性，使水分在細胞凍結(jié)前透出細胞外形成冰晶，為細胞凍存最理想的冷凍保 護劑。由于高濃度DMSO對細胞有毒性，還必須添加其他液體成分，如血清、細胞培養(yǎng)基，以降 低DMSO的濃度，減少對細胞的傷害。
[0003 ]目前細胞凍存液中所使用的胎牛血清增加動物病原污染的可能性，比如歐洲多個 國家發(fā)生瘋牛病，其血清中含有導(dǎo)致瘋牛病的病毒，用于凍存細胞會導(dǎo)致此類病毒傳播。此 外，有研究表明長期與胎牛血清接觸的細胞會對溶液介質(zhì)中的胎牛血清發(fā)生內(nèi)吞，內(nèi)吞胎 牛血清后的干細胞有可能發(fā)生某些蛋白表達的變化，應(yīng)用于人體后有可能發(fā)生異種動物蛋 白引起的免疫反應(yīng)，不能直接用于臨床輸注。因此，中國藥品和食品質(zhì)量監(jiān)督管理局2003年 發(fā)布的《人體細胞治療臨床研究和質(zhì)量控制指導(dǎo)原則》明確指出，應(yīng)盡量避免使用動物血清 培養(yǎng)細胞。另外，細胞培養(yǎng)基因其成分復(fù)雜，與人體環(huán)境相差甚遠，為被臨床批準使用，也不 能直接臨床輸注，通常被科研機構(gòu)用來體外培養(yǎng)基凍存細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種無動物源血清的細胞凍存液，該細胞凍存液不含動物血 清，因此不會引入外源蛋白，降低了動物病原污染的可能性，凍存復(fù)蘇后在用于繼續(xù)培養(yǎng)或 臨床直接回輸，安全有效，制備方法簡單，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0005] -種無動物源血清的細胞凍存液包含以下體積百分比成分：
[0006] 人血白蛋白 5-15%
[0007] 二甲基亞砜 5-15%
[0008] 羥乙基淀粉 70-90%。
[0009] 所述人血白蛋白是藥典規(guī)定的人血白蛋白制品。
[0010] 所述的羥乙基淀粉為臨床應(yīng)用血液容器擴充劑，平均分子量為13萬，置換度為 0·4〇
[0011] 所述二甲基亞砜為臨床級細胞凍存滲透性保護劑。
[0012] 本發(fā)明的有益效果
[0013] (1)本發(fā)明的細胞凍存液能夠有效的保護細胞受冷凍損傷，而且避免了細胞培養(yǎng) 基、胎牛血清、人血漿等不安全成分，降低了動物病原污染的可能性，凍存復(fù)蘇后在用于繼 續(xù)培養(yǎng)或臨床直接回輸，安全有效，制備方法簡單，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
[0014] (2)細胞復(fù)蘇后的活性達到90%左右，細胞表型基本沒有變化，從而保持了細胞復(fù) 蘇后的生理功能和生物學(xué)功能，本發(fā)明適用于單個核細胞及其他各類細胞的冷凍儲存。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明：
[0016] 實施例1
[0017] 細胞培養(yǎng)（以細胞CIK為例）
[0018] 使用淋巴細胞分離液密度梯度離心分離外周血單個核細胞，或者復(fù)蘇凍存的單個 核細胞。生理鹽水500g離心5分鐘，去除上清液。計數(shù)細胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基配成l*106/ml細 胞懸液。按每孔2ml培養(yǎng)基細胞懸液加入6孔板中，每組3個平行孔。第一天加入1000IU/ml的 INF-r，放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后加入50ng/ml CD3單抗和500IU/ml的IL-2。以 后每隔48小時，補加相應(yīng)培養(yǎng)基和500IU/ml的IL-2,計數(shù)至l*106/ml細胞濃度。共培養(yǎng)14天 觀察細胞形態(tài)，并檢測Hd時CIK細胞表型，活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0019] 實施例2
[0020] 按體積比，將5 %的HSA與85%的HES和10 %的DMSO混勻，制得細胞凍存液1，于4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 將實施例1中擴增的CIK細胞以濃度5 XioVml的濃度叢懸與上述凍存液1中，放程 序降溫盒置_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0022] 在凍存后的1月、3月、6月和1年后，37°C水浴復(fù)蘇的細胞。培養(yǎng)5d后檢測細胞表型 與活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0023] 實施例3
[0024] 按體積比，將10%的HSA與80%的HES和10%的DMSO混勻，制得細胞凍存液1，于4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 將實施例1中擴增的CIK細胞以濃度5 X IOVml的濃度叢懸與上述凍存液2中，放程 序降溫盒置_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0026] 在凍存后的1月、3月、6月和1年后，37°C水浴復(fù)蘇的細胞。培養(yǎng)5d后檢測細胞表型 與活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0027] 實施例4
[0028] 按體積比，將20%的HSA與70%的HES和10%的DMSO混勻，制得細胞凍存液1，于4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 將實施例1中擴增的CIK細胞以濃度5X IOVml的濃度叢懸與上述凍存液3中，放程 序降溫盒置_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0030] 在凍存后的1月、3月、6月和1年后，37°C水浴復(fù)蘇的細胞。培養(yǎng)5d后檢測細胞表型 與活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0031] 對比例1
[0032] 按體積比，將90%的胎牛血清和10%的DMSO混勻，制得細胞凍存液4，于4°C保存?zhèn)?用。
[0033]將實施例1中擴增的CIK細胞以濃度5 X IOVml的濃度叢懸與上述凍存液4中，放程 序降溫盒置_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0034] 在凍存后的1月、3月、6月和1年后，37°C水浴復(fù)蘇的細胞。培養(yǎng)5d后檢測細胞表型 與活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0035] 對比例2
[0036] 體積比，將10 %的HAS、80 %的HES、5 %的DMSO和5 %甘油混勻，制得細胞凍存液5， 于4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 將實施例1中擴增的CIK細胞以濃度5X IOVml的濃度叢懸與上述凍存液5中，放程 序降溫盒置_80°C超低溫冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存。
[0038] 在凍存后的1月、3月、6月和1年后，37°C水浴復(fù)蘇的細胞。培養(yǎng)5d后檢測細胞表型 與活率。具體檢測結(jié)果如表1所示。
[0039] 表 1
[0042]由上表所示本發(fā)明的無動物源血清的細胞凍存液對細胞的活率和表型有更好的 效果，當(dāng)按體積比，將10%的HSA與80%的HES和10%的DMSO混勻時，效果達到最好。
【主權(quán)項】
1. 一種無動物源血清的細胞凍存液，其特征在于，所述的無動物源血清的細胞凍存液 包含以下體積百分比成分： 人血白蛋白 5-15% 二甲基亞砜 5-15% 羥乙基淀粉 70-90%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物源血清的細胞凍存液，其特征在于:所述人血白蛋白是 藥典規(guī)定的人血白蛋白制品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物源血清的細胞凍存液，其特征在于:所述的羥乙基淀粉 為臨床應(yīng)用血液容器擴充劑，平均分子量為13萬，置換度為0.4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物源血清的細胞凍存液，其特征在于:所述二甲基亞砜為 臨床級細胞凍存滲透性保護劑。
【文檔編號】A01N1/02GK105941389SQ201610288434
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】苗嘉奕, 衛(wèi)培培, 王曉明
【申請人】上海安集協(xié)康生物技術(shù)股份有限公司