一種細(xì)胞凍存液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種細(xì)胞凍存液。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)的傳代及日常維持過程中，在培養(yǎng)器具、培養(yǎng)液及各種準(zhǔn)備工作方面都 需大量的耗費(fèi)，而且細(xì)胞一旦離開活體開始原代培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變 化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍 存十分必要。
[0003] 目前，細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要是采用添加適量保護(hù)劑的 緩慢冷凍法來凍存細(xì)胞，如采用甘油或二甲基亞諷(DMSO)為保護(hù)劑，因?yàn)槿绻?xì)胞在不加 任何保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反 應(yīng)，如:細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高、導(dǎo)致pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性， 從而引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)素亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體 也易被破壞引起細(xì)胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物丟失。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷 凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。
[0004] 現(xiàn)有的凍存方案常采用10%DMS0+90%FBS的凍存方案去保存細(xì)胞，該方案能夠很 好的為動(dòng)物細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)胞經(jīng)短時(shí)間凍存再復(fù)蘇后仍能維持較高的活率。但是該 細(xì)胞凍存方案經(jīng)長時(shí)間凍存后細(xì)胞復(fù)蘇率較低，只有85%左右，直接制約凍存細(xì)胞的臨床 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液，使用本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液長時(shí)間凍 存后的細(xì)胞復(fù)蘇率較高。
[0006] 本發(fā)明提供一種細(xì)胞凍存液，包括W下體積分?jǐn)?shù)的組分：
[0007] 9~13%的二甲基亞諷，2~7%的人血清白蛋白，1~3 %的右旋糖酢，1~5%的葡 萄糖，余量為溶劑。
[000引優(yōu)選的，所述二甲基亞諷的體積分?jǐn)?shù)為10~12%。
[0009]優(yōu)選的，所述人血清白蛋白的體積分?jǐn)?shù)為3~6%。
[0010]優(yōu)選的，所述人血清白蛋白的體積分?jǐn)?shù)為4~5%。
[0011] 優(yōu)選的，所述右旋糖酢的體積分?jǐn)?shù)為1~3%。
[0012] 優(yōu)選的，所述右旋糖酢的體積分?jǐn)?shù)為1~2%。
[0013] 優(yōu)選的，所述右旋糖酢為右旋糖酢-40。
[0014] 優(yōu)選的，所述葡萄糖的體積分?jǐn)?shù)為2~3%。
[0015] 優(yōu)選的，所述溶劑為PBS緩沖溶液或生理鹽水。
[0016] 本發(fā)明提供一種細(xì)胞凍存液，包括W下體積分?jǐn)?shù)的組分:9~13%的二甲基亞諷，2 ~7%的人血清白蛋白，I~3%的右旋糖酢，I~5%的葡萄糖，余下為溶劑。本發(fā)明采用了人 血清白蛋白替代動(dòng)物血清作為細(xì)胞的營養(yǎng)來源，不僅避免了動(dòng)物來源病毒的污染，還能有 效的提供是成分多元的營養(yǎng)物質(zhì)，可被細(xì)胞直接吸收使用;此外，人血清白蛋白中含有大量 高分子的蛋白質(zhì)，可形成水化膜，降低在東村過程中形成的冰晶數(shù)量，可降低細(xì)胞的機(jī)械損 傷、死亡；而右旋糖酢可W很好的維持了滲透壓，在溫度下降的過程中，仍能維持良好的滲 透壓環(huán)境，避免了細(xì)胞因溫度下降，滲透壓改變而出現(xiàn)細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，從而提高了經(jīng)長時(shí) 間凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的凍存液在凍存1個(gè)月、6個(gè)月和12 個(gè)月后的細(xì)胞復(fù)蘇率分別為94~97%、91~98%和90~97%。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明提供一種細(xì)胞凍存液，包括W下體積分?jǐn)?shù)的組分：
[001引 9~13 %的二甲基亞諷，2~7 %的人血清白蛋白，1~3 %的右旋糖酢，1~5 %的葡 萄糖，余下為溶劑。
[0019] 使用本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液長時(shí)間凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇率較高。
[0020] 在本發(fā)明中，所述二甲基亞諷(DMSO)的體積分?jǐn)?shù)為9~13 %，優(yōu)選為10~12 %，更 優(yōu)選為10%。本發(fā)明對(duì)所述二甲基亞諷的來源沒有特殊的限制，采用常規(guī)的市售商品即可。
[0021] 在本發(fā)明中，所述人血清白蛋白化SA)的體積分?jǐn)?shù)為2~7%，優(yōu)選為3~6%，更優(yōu) 選為4~5%;本發(fā)明對(duì)所述人血清白蛋白的來源沒有特殊的限制，具體的，在本發(fā)明的實(shí)施 例中，可采用廣州醫(yī)藥公司提供的體積分?jǐn)?shù)為20%的人血清白蛋白。
[0022] 在本發(fā)明中，所述右旋糖酢的體積分?jǐn)?shù)為1~3%，更優(yōu)選為1~2% ;所述右旋糖酢 優(yōu)選包括右旋糖酢-40(即低分子右旋糖酢），所述低分子右旋糖酢可W很好的維持了滲透 壓，在溫度下降的過程中，仍能維持良好的滲透壓環(huán)境，避免了細(xì)胞因溫度下降，滲透壓改 變而出現(xiàn)細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。本發(fā)明對(duì)所述右旋糖酢的來源沒有特殊的限制，具體的，在本發(fā) 明的實(shí)施例中，可采用廣州醫(yī)藥公司提供的體積分?jǐn)?shù)為6%的右旋糖酢-40,規(guī)格為SOOmL/ 袋。
[0023] 在本發(fā)明中，所述葡萄糖的體積分?jǐn)?shù)為1~5%;本發(fā)明對(duì)所述葡萄糖的來源沒有 特殊的限制，優(yōu)選采用廣州醫(yī)藥公司提供的體積分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖注射液。
[0024] 在本發(fā)明中，所述右旋糖酢溶液包括溶劑，所述溶劑可W是PBS緩沖溶液或生理鹽 水，本發(fā)明對(duì)所述PBS緩沖溶液和生理鹽水的來源沒有特殊的限制。
[0025] 在本發(fā)明中，所述細(xì)胞凍存液優(yōu)選按照W下方法制備得到：
[0026] 將體積分?jǐn)?shù)為6%的右旋糖酢-40溶液與體積分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖注射液混合均 勻，配制得到右旋糖酢溶液，所述右旋糖酢溶液中右旋糖酢的體積分?jǐn)?shù)為0.1~3% ;
[0027] 將二甲基亞諷、體積分?jǐn)?shù)為20%的人血清白蛋白和所述右旋糖酢溶液加入溶劑 中，得到細(xì)胞凍存液，所述細(xì)胞凍存液中含9~13%的二甲基亞諷，2~7%的人血清白蛋白， 1~3%的右旋糖酢和1~5%的葡萄糖。
[00%]在本發(fā)明中，所述人血清白蛋白、二甲基亞諷、葡萄糖、右旋糖酢和溶劑的來源和 用量與上述技術(shù)方案中人血清白蛋白、二甲基亞諷、葡萄糖、右旋糖酢和溶劑的來源和用量 一致，在此不再寶述。
[0029]本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液可用于凍存多種類型的人體細(xì)胞，如人體肝細(xì)胞、人體 免疫細(xì)胞、人體腫瘤細(xì)胞或人體成體細(xì)胞，具體的，在本發(fā)明的實(shí)施例中，可采用W下類型 和來源的人體細(xì)胞：
[0030] 按照文獻(xiàn)：田霖，孫彼放，劉海波.人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與生物學(xué)特征.《中國 組織工程研究》，2012，16(32): 5946-5952中的方法獲取ADSCS原代細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲 取的P3~P5的細(xì)胞。
[0031] 按照文獻(xiàn):李艷琪，王洪一.人廝帶源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的改進(jìn).《中國組 織工程研究》，2014，18(10): 1609-1614中的方法中的方法獲取UC-MSC原代細(xì)胞，經(jīng)過傳代 培養(yǎng)，獲取的P3~P5的細(xì)胞。
[0032] 按照文獻(xiàn):陳丹，王小東種分離人外周血單核細(xì)胞方法的分離.《天津醫(yī)科大學(xué) 學(xué)報(bào)》，2014.6:483-485中的方法獲取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC);
[0033] 從暨南大學(xué)生命科學(xué)院獲取腫瘤細(xì)胞K562、化60細(xì)胞；
[0034] 按照文獻(xiàn)王玲玲，馬峰，張玉成.人成纖維細(xì)胞的體外分離、純化培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定. 《中國老年學(xué)雜志》，2012，32:1215-1216.中的方法獲取成纖維細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，獲取 P3~P5的細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明分別將上述細(xì)胞凍存后，于1個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月將細(xì)胞復(fù)蘇，結(jié)果表明， 凍存12個(gè)月后復(fù)蘇的細(xì)胞活率均在90% W上。在本發(fā)明中，所述細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的方法為 本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法。
[0036] 本發(fā)明提供一種細(xì)胞凍存液，包括W下體積分?jǐn)?shù)的組分:9~13%的二甲基亞諷，2 ~7%的人血清白蛋白，1~3%的右旋糖酢，1~5%的葡萄糖，余下為溶劑。本發(fā)明提供的細(xì) 胞凍存液具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0037] 本發(fā)明通過優(yōu)化細(xì)胞凍存方案，盡可能避免細(xì)胞在凍存過程中因冰晶形成而導(dǎo)致 細(xì)胞大量死亡；
[0038] 優(yōu)化了凍存體系，細(xì)胞在復(fù)蘇后可直接回輸至人體；
[0039] 不添加動(dòng)物來源的血清，避免了動(dòng)物來源的病毒污染；
[0040] 本發(fā)明中的凍存液可用于多種細(xì)胞類型，如干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，成體細(xì) 胞等。
[0041] 為了進(jìn)一步說明本發(fā)明，W下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種細(xì)胞凍存液進(jìn)行詳 細(xì)描述，但不能將其理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍