用于免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及現(xiàn)代生物技術(shù)之培養(yǎng)基研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種用于人免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合。
技術(shù)背景
[0002]隨著生物治療腫瘤技術(shù)的發(fā)展，生物治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療之后腫瘤治療的第四種治療方式。在腫瘤的生物治療中免疫細胞治療是重要的一環(huán)，近年來，免疫細胞治療已在臨床中顯示出了重要的應用價值。
[0003]所述免疫細胞治療包括腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、樹突狀細胞(DC)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的治療。其中，以自體細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)為主體的腫瘤過繼免疫治療已逐漸成為腫瘤生物治療中最活躍的應用與研究項目之一。
[0004]過繼免疫治療在實施過程中很重要的一個環(huán)節(jié)就是要通過免疫細胞的體外擴增，使免疫細胞數(shù)量符合臨床注劑量要求后輸給患者，達到生物治療的目的。由于生物治療的特殊性在于，是以免疫細胞作為治療藥物輸入患者體內(nèi)的，因此，體外擴增免疫細胞的安全性和質(zhì)量的穩(wěn)定性就顯得尤為重要。在免疫殺傷細胞的體外擴增過程中需要確保不能滲入任何可能會給患者生命帶來安全風險的物質(zhì)，例如異源病原菌和病毒。
[0005]常規(guī)的細胞培養(yǎng)是在有血清的體系中進行，異源血清的加入可能會增加異源感染的風險，這在臨床上是不允許的。使用無血清培養(yǎng)基，即采用血清替代物組合替代血清在細胞培養(yǎng)中的作用來進行無血清擴增，則正好能解決上述問題，因此，將無血清培養(yǎng)基用于免疫殺傷細胞的體外擴增就顯得尤為重要。由于無血清培養(yǎng)基相比于有血清培養(yǎng)體系成分更加明確，批次間質(zhì)量更加穩(wěn)定，且易于規(guī)?；苽浜凸芾?，易于規(guī)避異源物質(zhì)的干擾，其質(zhì)量的穩(wěn)定性和使用的安全性都會有大幅度提尚。
[0006]然而，由于血清組成復雜多樣，包含多種生長因子、蛋白、激素及其他小分子物質(zhì)，它們對免疫細胞體外擴增的作用也不盡相同。為此，研究血清中各種組分以及組分之間的相互作用對細胞增殖的影響，分析和發(fā)現(xiàn)其中對細胞生長增殖有顯著促進作用的關(guān)鍵物質(zhì)，通過科學實驗優(yōu)化其濃度范圍，制備出血清替代物，是建立無血清培養(yǎng)基的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。根據(jù)2012年由Sunghoon Jung, KrishnaM.Panchalingam, Lawrence Rosenberg和Leo A.Behie發(fā)表于Stem Cells Internat1nal期干丨J上的《Ex Vivo Expans1n of HumanMesenchymal Stem Cells in Defined Serum-Free Media》(用成分明確的無血清培養(yǎng)基體外擴增人間充質(zhì)干細胞)，2012，Stem Cells Internat1nal，細胞培養(yǎng)中所常用的胎牛血清的組成及其濃度范圍如下:
成分_濃度范圍
蛋白和多肽40?80mg/mL
白蛋白20?50 mg/mL
胎球蛋白10?20 mg/mL纖粘連蛋白1.0?10 yg/mL
球蛋白1.0?15mg/mL
蛋白酶抑制劑0.5?2.5mg/mLα I?抗胰蛋白酶α2?巨球蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白2.0?4.0mg/ml生長因子:
EGF，PDGF，IGF1 和2，1.0?100ng/mLFGF，IL?I，IL?6
氨基酸0.01?1.0μΜ
脂類2.0?10mg/mL
膽固醇10μΜ(3.8665mg/mL)
脂肪酸0.1?1.0μΜ
亞油酸0.01 ?0.1μΜ(0.0028 ?0.028mg/mL)
磷脂0.7?3.0mg/mL
碳水化合物1.0?2.0mg/mL
葡萄糖0.6?1.2mg/mL
氨基己糖0.6?1.2mg/mL
乳酸0.5?2.0mg/mL
丙酬酸2.0?10yg/mL
聚氨0.1?:LOyM
腐胺、亞精胺尿素170 ?300yg/mL
無機物0.14?0.16Μ
?丐4.0?7.0mM
氯ΙΟΟμΜ
鐵10?50μΜ
鉀5.0?15 mM
磷2.0?5.0 mM
砸Ο.ΟΙμΜ
鈉135?155 mM
鋅0.1?1.0μΜ
激素0.1?200ηΜ
氫化可的松10?200ηΜ
胰島素1.0?100ng/mL
三碘甲狀腺氨酸20 nM
甲狀腺素100 nM
維生素0.01?10yg/mL
維生素A10?100ng/mL 葉酸5.0?20ng/mL。
[0007]在上述胎牛血清的組分中，蛋白質(zhì)、生長因子、脂類、激素和聚氨等組分很少出現(xiàn)在普通的商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，而這些組分又是免疫細胞生長增殖所必須的關(guān)鍵組分。
[0008]在無血清培養(yǎng)基需要添加的蛋白質(zhì)類物質(zhì)中，最重要的是白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。所述白蛋白能與脂類、激素、維生素、金屬離子和生長因子等結(jié)合，起到調(diào)節(jié)上述物質(zhì)在無血清培養(yǎng)基中濃度和活性的作用。所述轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合是細胞獲取鐵元素的主要來源，而鐵離子在多種代謝途徑中起著重要的作用，其與氧的轉(zhuǎn)運、DNA的合成和電子轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
[0009]對于不同種類的細胞進行增殖需要添加的生長因子種類也是不盡相同的，例如在T淋巴細胞培養(yǎng)過程中是添加IL-2作為生長因子的。對于很多生長因子而言，它們不是直接被添加到初始培養(yǎng)基里的，而是在培養(yǎng)過程中另外添加的，因此，生長因子的作用可以不作為無血清培養(yǎng)基考慮的范圍。
[0010]激素中最重要的是胰島素和氫化可的松。胰島素可與細胞上的胰島素受體結(jié)合后促進RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細胞的凋亡。氫化可的松可以抑制由巨噬細胞釋放的有毒性的氧自由基和蛋白酶，也可以抑制由單核細胞釋放的有毒的超氧化物自由基的生成。
[0011]脂類中的脂肪酸、膽固醇和磷脂參與細胞膜結(jié)構(gòu)的合成，是細胞生長必不可少的營養(yǎng)成分。脂肪酸中包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。飽和脂肪酸如棕櫚酸、月桂酸、豆蔻酸等，不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸和亞麻酸等。磷脂包括磷脂酰膽堿(卵磷脂)和磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)，膽堿和乙醇胺分別是合成二者的單體物質(zhì)。
[0012]聚氨包括腐胺、精胺和亞精胺，這些物質(zhì)可作為激素信號通路的第二信使，調(diào)節(jié)細胞滲透壓，影響細胞的生長增殖和細胞功能。
[0013]除了這些關(guān)鍵成分外，還有小分子物質(zhì)，如α-硫代甘油和β-巰基乙醇，也是調(diào)節(jié)細胞生長代謝的重要組分。
[0014]但是研究發(fā)現(xiàn)，只是簡單地將上述成分組合在一起并不能有效支持細胞的生長增殖。這是由于上述蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)的種類或者部分成分濃度并不適宜此類細胞的生長增殖或者其本身可能會有抑制作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合，它組分明確，可添加到不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，能支持免疫殺傷細胞的體外高效擴增，具有高效性和普適性。
[0016]本發(fā)明通過科學的實驗設(shè)計方法-部分因子實驗設(shè)計和響應面分析，經(jīng)多次實驗重復，從眾多候選物中逐步分析優(yōu)化，最終篩選出數(shù)種可支持免疫細胞體外高效擴增的血清替代物組合。
[0017]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。
[0018]—種用于免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合，其特征在于，其成分組成包括:胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白、乙醇胺、α-硫代甘油、亞麻酸、膽固醇。
[0019]可選的，所述各成分添加到常規(guī)培養(yǎng)基中的最終濃度為，單位毫克/升: 胰島素0.5?20mg/L;
轉(zhuǎn)鐵蛋白0.69?22mg/L;
牛血清白蛋白3000?6000mg/L;
乙醇胺0.61 ?2.44mg/L;
α_ 硫代甘油5.41?10.82mg/L;
亞麻酸0.5?5.0mg/L;
膽固醇0.8?20mg/L。
[0020]進一步，在所述血清替代物組合基礎(chǔ)上能再添加檸檬酸銨鐵、β_甘油磷酸二鈉和腐胺;所述檸檬酸銨鐵、甘油磷酸二鈉和腐胺添加到常規(guī)培養(yǎng)基中的最終濃度為(單位毫克/升):檸檬酸銨鐵0.46?2.3mg/L ； β-甘油磷酸二鈉300?1500mg/L ；腐胺0.25?I.25mg/L0
[0021 ] 一種用于免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合，其特征在于，其各種成分添加到常規(guī)培養(yǎng)基中的最終濃度為，單位mg/L:
胰島素0.5?20mg/L;
轉(zhuǎn)鐵蛋白0.69?22mg/L;
牛血清白蛋白3000?6000mg/L;
乙醇胺0.61 ?2.44mg/L;
α_ 硫代甘油5.41?10.82mg/L;
亞麻酸0.5?5.0mg/L;
膽固醇0.8?20 mg/L；
檸檬酸銨鐵0.46?2.3mg/L;
甘油磷酸二鈉 300?1500mg/L;
腐胺0.25?1.25mg/L。
[0022]本發(fā)明用于免疫殺傷細胞體外擴增的血清替代物組合的積極效果是:
(I)組分明確，有利于免疫細胞的體外擴增，能促進腫瘤的生物治療，尤其是體細胞治療的進行。
[0023]( 2 )研究還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的血清替代物組合，可加入到不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基中，能支持免疫細胞的高效增殖。
[0024](3)實驗證明:本發(fā)明的血清替代物組合具有高效性和普適性，容易配制、成本可控，容易實施和推廣應用。
【附圖說明】
[0025]附圖1為實施例1細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0026]附圖2為實施例2細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0027]附圖3為實施例3細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0028]附圖4為實施例4細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0029]附圖5為實施例5細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0030]附圖6為實施例6細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0031 ]附圖7為實施例7細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0032]附圖8為實施例8細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0033]附圖9為實施例8所擴增的細胞中各類免疫細胞的比例圖。
[0034]附圖10為實施例9細胞擴增倍數(shù)的比較圖。
[0035]附圖11為實施例9所擴增的細胞中各類免疫細胞的比例圖。
[0036]附圖12為實施例9對腫瘤細胞K562的殺傷活性的比較圖。
[0037]附圖13為實施例10細胞擴增倍數(shù)的比較圖。