專利名稱：一種檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR方法，屬于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬鏈球菌(Str印tococcus suis, SS)呈世界性分布，多年來一直困擾養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，豬急性感染豬鏈球菌常表現(xiàn)為出血性敗血癥和腦膜炎，慢性感染則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、 心內(nèi)膜炎、淋巴結(jié)化膿。豬鏈球菌還是重要的人獸共患病病原，威脅人類的生命安全，人感染鏈球菌患中毒性休克和腦膜炎。豬鏈球菌血清型眾多。根據(jù)蘭氏(Lancefield)血清學(xué)分類，鏈球菌可分成A、B、C、 D、E、F、G、H、K、L、M、N、0、P、Q、R、S、T、U 等 19 個(gè)血清型，其中 C、D、E、L、R、S 等群鏈球菌可引起豬鏈球菌病，如C群的獸疫鏈球菌(S. zooepidemicus)和類馬鏈球菌(S. epuisimilis)、D 群的豬鏈球菌(S. suis)、R群的豬2型鏈球菌(S. suis subtype 2，SS2)。20世紀(jì)80年代我國(guó)流行的豬鏈球菌病臨床上多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，90年代由于C群鏈球菌疫苗免疫使病情有所緩解。1990年在我國(guó)廣東省首次發(fā)現(xiàn)豬群中有類似2型鏈球菌病，但未見人感染發(fā)病。1998-999年，江蘇省和浙江省先后兩次爆發(fā)豬2型鏈球菌病，上萬(wàn)頭豬發(fā)病，幾十位從業(yè)人員發(fā)生腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及中毒性出血性休克征、多臟器功能損害，從病人和病豬中分離出豬鏈球菌2型菌株，人源分離株與豬源分離株為同源株。2005年6月，四川省資陽(yáng)、 內(nèi)江等地近80例患者急性SS2感染，其中12例重癥患者死亡。目前我國(guó)流行的豬鏈球菌病以SS2為主。SS2存在復(fù)雜的致病機(jī)制。SS2菌株的致病性強(qiáng)弱與是否具有毒力因子密切相關(guān)。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SS2產(chǎn)生多種毒力因子，如溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外蛋白因子(EF)、溶血素 (SLY)、莢膜多糖(CPS)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(FBPS)、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、IgG結(jié)合蛋白(IBP)、精氨酸脫亞氨酶(AD)、二肽肽酶IV(DPP IV)等等。其中MRP、EF、SLY為三個(gè)最重要的毒力因子。我國(guó)兩次爆發(fā)的SS2均為MRP+EF+SLY+表型。報(bào)道的檢測(cè)SS2毒力因子的方法有PCR和多重PCR方法。Smith等利用莢膜生物合成基因CPS的基因序列建立了針對(duì)1、2、9型豬鏈球菌的型特異性PCR鑒定方法。馬清霞、 何孔旺、陸承平等設(shè)計(jì)并合成引物，建立了能同時(shí)檢測(cè)SS2的CPS、MRP、EF的多重PCR方法， 該法特異性強(qiáng)、敏感性高，可直接從臨床病料中檢測(cè)出SS2并能鑒定其毒力因子表型。何孔旺等用PCR方法檢測(cè)SS2的MRP和EF，敏感度可達(dá)100個(gè)細(xì)菌。EF、SLY兩種毒力因子為分泌性蛋白，分泌到胞外，可隨宿主的血液擴(kuò)散到宿主全身，可能對(duì)SS2自身的擴(kuò)散、對(duì)宿主全身性損傷、與其它病原微生物間的相互作用方面起到一定作用，有必要針對(duì)這兩個(gè)毒力因子的分子流行病學(xué)和遺傳變異情況加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。本發(fā)明根據(jù)公開的SS2的EF和SLY基因序列設(shè)計(jì)引物，建立多重PCR方法，通過一個(gè)PCR反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)SS2的EF和SLY基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR 方法，用于豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的快速、鑒別檢測(cè)。通過對(duì)Genbank中公開的SS2的EF和SLY基因序列比對(duì)，選取SS2的EF和SLY基因序列中的保守序列，用I^emier Primers 5.0軟件和Oligo 6. 0軟件設(shè)計(jì)引物。EF上游引物為5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘ ；EF 下游引物為5 ‘ -ACATTCTGACCACTCGCATC-3 ‘； 擴(kuò)增的SS2的EF片段大小為158bp ；SLY上游引物為5 ‘ -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3 ‘； SLY下游引物為5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘；擴(kuò)增的SLY片段大小為33^ρ。引物由上海生工生物工程有限公司合成。本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系為25ul體系，按順序加入以下試劑
Buffer2.5ul
Mg2+1.5ul
dNTPIul
EF上下游引物(10 X )各0.5ul
SLY上下游引物(IOX)各0.5ul
模板Iul
酶0.25ul
滅菌水補(bǔ)足至25ul以上操作均在冰上進(jìn)行，所有試劑加完后，蓋蓋，低速離心(1500gXaiiin)，置PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明的PCR反應(yīng)條件為
95°C預(yù)變性 5min
94。C變性 lmin，55°C退火1 min; 72。C延伸40s;擴(kuò)增35個(gè)循環(huán) 72°C 延伸 IOmin
4°C 冷卻 forever電泳檢測(cè)條件為用0. 5X的TBE緩沖液配制濃度為2%的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，將電泳樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液按5 1比例混合后將樣品依次加入加樣孔中，上樣量6ul。打開電泳儀，180V恒壓電泳，使核酸樣品向正極泳動(dòng)。電泳結(jié)束后將凝膠置紫外-可見光凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果。本發(fā)明的步驟包括(1)冰上操作，按順序加入一定量的H20、Buffer、Mg2+、dNTP、引物、模板、酶等，蓋蓋，低速離心。(2)將上述25ul的反應(yīng)體系放到PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(3)瓊脂糖電泳檢測(cè)用0. 5 X的TBE緩沖液配制濃度為2%的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，將電泳樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液按5 1比例混合后將樣品依次加入加樣孔中，上樣量6-lOul。打開電泳儀，180V恒壓電泳，使核酸樣品向正極泳動(dòng)。 電泳后置紫外-可見光凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果。(4)判定標(biāo)準(zhǔn)如果電泳檢測(cè)出現(xiàn)158、338bp的目的條帶，則判定為EF和SLY基因檢測(cè)均為陽(yáng)性；如果沒有目的條帶，則判定為陰性。本發(fā)明具有靈敏度高、檢測(cè)效率高、通過一個(gè)PCR反應(yīng)即可快速檢測(cè)出豬鏈球菌2 型的EF、SLY基因。本發(fā)明的檢測(cè)靈敏度可達(dá)0. lng/ul。由于PCR儀的普及推廣，本發(fā)明具有實(shí)用性強(qiáng)、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。


附圖1多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果。目的條帶分子量分別為338bp和158bp， 分別對(duì)應(yīng)SLY和EF基因片段。泳道1為DNA Marker,泳道2為多重PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道3 為SLY基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道4為EF基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道5為陰性對(duì)照。附圖2多重PCR擴(kuò)增的靈敏度。泳道1-7的模板濃度依次為1、0. 1,0. 01,0. 001、 0.0001、0.00001、0.000001ng/ul，泳道8為陰性對(duì)照。泳道1、2中的目的條帶分子量分別為338bp和158bp，分別對(duì)應(yīng)SLY和EF基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果表明多重PCR檢測(cè)SLY和EF基因的靈敏度為0. lng/ul。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中公開的豬鏈球菌2型的EF、SLY基因序列，通過基因序列比對(duì)，選取保守序列，選取的EF、SLY的公開序列的GeneBank登錄號(hào)分別為DQ417121. 1、 DQ443530. 1。使用 Primer Premiers 5.0 和 Oligo 6 軟件自行設(shè)計(jì) EF、SLY 基因 PCR 引物， 引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。EF 上游引物為5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘ ；EF 下游引物為 5' -ACATTCTGACCACTCGCATC-3‘。擴(kuò)增的 EF 片段大小為 158bp。SLY 上游引物為5 ‘ -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3 ‘ ；SLY 下游引物為 5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘。擴(kuò)增的 SLY 片段大小為 338bp。實(shí)施例2細(xì)菌DNA的提取以豬鏈球菌2型HA9801株接種滅菌Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基，37°C過夜培養(yǎng)，取細(xì)菌液ImL, 12000rpm離心2min,沉淀用567 μ L的TE緩沖液(ρΗ8· 0)重懸，加入30 μ L 的10% SDS和3yL的20mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，37 °C水浴lh，加入IOOyL 5mol/ L的NaCl，充分混勻再加入80 μ L CTAB/NaCl溶液，混勻，65°C水浴lOmin，加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)混勻，12000rpm離心lOmin，吸取上清加入等體積的氯仿異戊醇04 1)混勻，12000rpm離心lOmin，吸取上清，加入0. 6體積的異丙醇，放入-20°C 20min,使DNA充分沉淀，12000rpm離心lOmin，沉淀用70%的乙醇洗滌2次，然后在室溫下干燥，使乙醇揮發(fā)，沉淀用25 μ LpH8. O的TE (不含DNA酶的胰RNA酶20 μ g/mL) 溶解。測(cè)定提取DNA溶液的濃度和純度。熒光PCR反應(yīng)時(shí)調(diào)整DNA的濃度，吸取適量DNA，使25ul的PCR反應(yīng)體系中模板含量為50-100ng。實(shí)施例3PCR方法的建立本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系為25ul體系，按順序加入以下試劑
Buffer2.5ul
Mg2+1.5ul
dNTPIul
EF上下游引物(IOX)各0.5ul
SLY上下游引物(10 X )各0.5ul
模板Iul
酶0.25ul
滅菌水補(bǔ)足至25ul以上操作均在冰上進(jìn)行，所有試劑加完后，蓋蓋，低速離心(1500gXaiiin)，置PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。本發(fā)明的PCR反應(yīng)條件為
95°C預(yù)變性 5min
94°C變性 lmin，55°C退火1 min; 72°C延伸40s;擴(kuò)增35個(gè)循環(huán) 72°C 延伸 IOmin
4°C 冷卻 forever電泳檢測(cè)條件為用0. 5 X的TBE緩沖液配制濃度為2%的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，將電泳樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液按5 1比例混合后將樣品依次加入加樣孔中。 上樣量6ul。打開電泳儀，180V恒壓電泳，使核酸樣品向正極泳動(dòng)。電泳結(jié)束后置凝膠紫外-可見光凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)如果電泳檢測(cè)出現(xiàn)158、338bp的目的條帶，則判定為EF和SLY基因PCR 檢測(cè)均為陽(yáng)性；如果沒有目的條帶出現(xiàn)，則判定為EF和SLY基因PCR檢測(cè)陰性。實(shí)驗(yàn)需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果見附圖1。實(shí)施例4靈敏度檢測(cè)取豬鏈球菌2型HA9801菌株的菌液lmL，離心，取沉淀，提取細(xì)菌DNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度。用滅菌雙蒸水將細(xì)菌DNA以10倍倍比稀釋成10—1、10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7,10_8、10_9、10-1°不同濃度梯度。取每個(gè)稀釋度的DNA作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后，用2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，以PCR法能檢測(cè)出的最低模板濃度作為本發(fā)明方法的靈敏度。檢測(cè)結(jié)果表明，提取的細(xì)菌DNA的濃度為2000ng/ul，純度適合進(jìn)行PCR檢測(cè)。當(dāng)模板濃度大于0. lng/ul時(shí)，PCR檢測(cè)產(chǎn)物電泳檢測(cè)出現(xiàn)兩條目的條帶；當(dāng)模板濃度小于0. lng/ul時(shí)，PCR檢測(cè)產(chǎn)物電泳檢測(cè)未出現(xiàn)兩條目的條帶。標(biāo)明本發(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度為0. lng/ul。結(jié)果見附圖2。實(shí)施例5特異性檢測(cè)分別挑取大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、鴨疫里默氏桿菌等菌株單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)Mh，分別取Iml菌液，離心取菌體，提取細(xì)菌DNA。以豬鏈球菌2型HA9801株的細(xì)菌DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。用本發(fā)明建立的PCR方法擴(kuò)增上述各菌株的細(xì)菌DNA，驗(yàn)證本發(fā)明方法的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明方法的特異性強(qiáng)。PCR擴(kuò)增大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、鴨疫里默氏桿菌等細(xì)菌的DNA及雙蒸水時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)均未出現(xiàn)158、338bp的目的條帶；而豬鏈球菌2型的陽(yáng)性對(duì)照PCR擴(kuò)增后電泳檢測(cè)到 158、338bp的目的條帶，與EF、SLY基因的目的條帶大小一致，標(biāo)明本發(fā)明只能特異性地 PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型的EF、SLY基因。實(shí)施例6重復(fù)性試驗(yàn)取三個(gè)不同培養(yǎng)批次的豬鏈球菌2型HA9801株37°C 20小時(shí)培養(yǎng)菌液1ml，提取細(xì)菌DNA。用本發(fā)明方法對(duì)每個(gè)批次的樣品重復(fù)檢測(cè)三次，驗(yàn)證本方法的重復(fù)性。以豬鏈球菌2型HA9801株的細(xì)菌DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果表明，三個(gè)批次的樣品重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果一致，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次的結(jié)果也一致，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)都出現(xiàn)出大小與目的條帶一致的擴(kuò)增片段。批間檢測(cè)的變異系數(shù)(CV% )為1. 50%，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次的變異系數(shù)(CV% )為1. 14%。 結(jié)果表明本發(fā)明方法具有良好的重復(fù)性，從而保證了檢測(cè)數(shù)據(jù)的可比性。實(shí)施例7SS2分離株的EF、SLY基因檢測(cè)取2008-2010年間本單位自行分離、保存的19株SS2分離菌，挑取固體培養(yǎng)基保存的各菌株的單菌落，T-H肉湯中37°C靜置培養(yǎng)對(duì)小時(shí)，提取細(xì)菌DNA。用本發(fā)明方法檢測(cè)各分離株的EF、SLY基因。以HA9801株的DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以滅菌蒸餾水為陰性對(duì)照。多重PCR檢測(cè)結(jié)果表明，19株SS2分離株及陽(yáng)性對(duì)照的DNA的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)均呈陽(yáng)性，而陰性對(duì)照未檢測(cè)到目的條帶，19株SS2分離株的EF、SLY基因陽(yáng)性率均為100%。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的多重 PCR方法，分別針對(duì)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因設(shè)計(jì)PCR引物，胞外蛋白因子基因EF的上游引物為5 ‘ -GAAGAAGAACCCAAGGAACC-3 ‘，下游引物為 5 ‘ -ACATTCTGACCACTCGCATC-3 ‘，擴(kuò)增的EF片段大小為；溶血素基因SLY的上游引物為5' -TTCCGATTTCGTATTCAACC-3‘，下游引物為5' -AACTGTTCTCCACCACTCCC-3‘，擴(kuò)增的SLY片段大小為338bp，引物與Buffer、模板、酶等試劑構(gòu)成PCR反應(yīng)體系，PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明用于豬鏈球菌2型EF和SLY基因的快速、鑒別檢測(cè)。
2.權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)體系為25ul體系，按順序加入以下試劑Buffer2.5ulMg2+1.5uldNTPIulEF上下游引物(IOX)各0.5ulSLY上下游引物(IOX)各0.5ul模板Iul酶0.25ul滅齒水補(bǔ)足至25ul上述操作冰上進(jìn)行，所有試劑加完后，蓋蓋，低速離心(1500gX aiiin)，置PCR儀上進(jìn)行 PCR反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 5min94°C變性 1 min, 55°C退火1 min; 72°C延伸40s;擴(kuò)增35個(gè)循環(huán) 72°C 延伸 IOmin 4°C 冷卻 forever
4.本發(fā)明的步驟包括(1)冰上操作，按順序加入一定量的吐0、8吐作1~、1%2+、(1^1\引物、模板、酶等，蓋蓋，低速離心；(2)將上述25ul的反應(yīng)體系放到PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)瓊脂糖電泳檢測(cè)用0.5 X的TBE緩沖液配制濃度為2%的瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽中，加入電泳液，將電泳樣品與溴酚藍(lán)上樣緩沖液按5 1比例混合后將樣品依次加入加樣孔中。上樣量6ul。打開電泳儀，180V恒壓電泳，使核酸樣品向正極泳動(dòng)。電泳后置紫外-可見光凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果；(4)判定標(biāo)準(zhǔn)如果電泳檢測(cè)出現(xiàn)158、338bp的目的條帶，則判定為EF和SLY基因檢測(cè)均為陽(yáng)性；如果沒有目的條帶，則判定為陰性。PCR實(shí)驗(yàn)需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；本發(fā)明方法的靈敏度高(達(dá)0. lng/ul)，檢測(cè)效率高，通過一個(gè)PCR反應(yīng)即可快速檢測(cè)出豬鏈球菌2型的EF、SLY基因。由于PCR儀的普及推廣，本發(fā)明具有實(shí)用性強(qiáng)、檢測(cè)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子EF和溶血素基因SLY的多重PCR方法。根據(jù)GenBank公開的豬鏈球菌2型EF、SLY基因保守序列，分別設(shè)計(jì)、合成1對(duì)特異引物，優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了同時(shí)檢測(cè)豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因的多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法能夠快速、鑒別檢測(cè)出豬鏈球菌2型胞外蛋白因子和溶血素基因。
文檔編號(hào)C12R1/46GK102242195SQ20111012307
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日
發(fā)明者張琳, 張秀美, 朱麗萍, 楊少華, 胡北俠, 許傳田, 陸承平, 陳正濤, 顏世敢 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所