專利名稱：一種大豆自噬相關(guān)基因的克隆及其應(yīng)用的制作方法
一種大豆自噬相關(guān)基因的克隆及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體說是用分子生物學(xué)技術(shù)獲得一種大豆自噬相關(guān)基因，該基因的轉(zhuǎn)基因植株具有高產(chǎn)高效并耐低氮的性狀。
背景技術(shù)：
隨著世界人口的不斷增加，人們對糧食的需求量也不斷增加，但可耕種土地面積有限，因此，提高農(nóng)作物產(chǎn)量是避免爆發(fā)糧食危機的重要途徑。通常提高作物產(chǎn)量所采用的手段主要是增加化肥的施用，這不僅增加成本更污染環(huán)境。因此，選育出能夠高效利用土壤中有限營養(yǎng)而高產(chǎn)的作物新品種對解決糧食危機具有重大意義。獲得可以高效利用氮素營養(yǎng)的作物品種的途徑包括利用經(jīng)典遺傳學(xué)方法選育優(yōu)異的營養(yǎng)高效品種和利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法培育轉(zhuǎn)基因新材料的方法。優(yōu)異品種的選育周期長，見效慢；相比之下，轉(zhuǎn)基因技術(shù)更直接而快速。因此，利用基因工程技術(shù)，改造農(nóng)作物對土壤中養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)運能力以及利用效率已經(jīng)成為新世紀(jì)國際上農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的焦點課題。氮素是植物營養(yǎng)三要素之一。農(nóng)作物生長過程中需要從土壤中吸收大量氮，氮素的供應(yīng)直接控制著農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。大豆是全世界范圍廣泛栽培的主要農(nóng)作物之一， 也是我國重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物，同時又是我國供需矛盾最為突出的農(nóng)產(chǎn)品。大豆是需肥較多的作物，雖然大豆是固氮植物，但其生長所需的氮素只有三分之一來自固氮，另外三分之二來自土壤和肥料。氮肥既是提高大豆植株光合效率的保障，又是種子干物質(zhì)積累和成熟的限制因子之一，提高莖葉中的氮素含量對于大豆高產(chǎn)具有重要意義。氮肥對于灌漿期的高氮需求是不足的，糧食產(chǎn)量不僅僅依賴于在開花前的氮吸收，也依賴于種子成熟階段氮的再利用(Kichey等，2007)。植物對氮素的利用通過吸收、同化、轉(zhuǎn)運和再動員幾個步驟來完成(Masclaux-Daubresse等，2010)，提高氮再利用的效率具有從植物的營養(yǎng)器官重新利用氮來灌漿的的優(yōu)勢，這將有助于植物氮經(jīng)濟及減少開花后的外源氮需求，營養(yǎng)的回收再利用效率是作物產(chǎn)量的決定因素之一。細(xì)胞自噬是一種較新發(fā)現(xiàn)的、可以響應(yīng)營養(yǎng)缺乏等脅迫、并參與營養(yǎng)再動員的一個重要過程。Yoshimoto等Q004)發(fā)現(xiàn)氮饑餓能迅速引發(fā)植物自噬基因的表達(dá)，而自噬相關(guān)基因的突變會導(dǎo)致植物對營養(yǎng)脅迫耐受性的降低(Xiong等，2005 ；Thompson等，2005 ； Phillips等，2008)。通過在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬的過程包括自噬體的成核、延展、 自噬體與液泡或溶酶體的融合、自噬體內(nèi)物質(zhì)的降解等幾個步驟(Klionsky，2005)，在自噬體的成核及延展過程中，一個基因ATG8起著關(guān)鍵作用。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)大部分酵母自噬相關(guān)基因的同源基因。但目前為止，還沒有對大豆自噬相關(guān)基因的研究報道，也沒有報道研究植物自噬基因與植物產(chǎn)量的聯(lián)系。Hinchee等(1988)和McCabe (1988)獲得轉(zhuǎn)基因大豆后，相繼有成功轉(zhuǎn)化大豆的報道，但還沒有在高效利用氮素而產(chǎn)生高產(chǎn)效果的轉(zhuǎn)基因大豆獲得，這方面的基因克隆較少。 在理論研究方面，Martin等Q006)在玉米中過表達(dá)谷氨酰胺合成酶(GS)，使得轉(zhuǎn)基因植株GS活性提高，并提高了產(chǎn)量；Taylor等Q010)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AtPPDK的轉(zhuǎn)基因擬南芥可以延緩衰老，并提高了種子單粒重及含氮量。因為大豆的轉(zhuǎn)化效率低、操作流程繁瑣， 通過大規(guī)模獲得轉(zhuǎn)基因大豆來篩選有高產(chǎn)高效價值的轉(zhuǎn)基因作物不易實現(xiàn)，而模式植物擬南芥的轉(zhuǎn)化相對比較簡單，同時擬南芥的生長周期相對較短，更易進(jìn)行高產(chǎn)高效性狀的分析，因此，克隆大豆中的潛在高產(chǎn)高效基因并轉(zhuǎn)化擬南芥，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中完成篩選成為一種評價有育種價值的基因有效手段，為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)高效的轉(zhuǎn)基因大豆提供依據(jù)。總之，獲得大豆高產(chǎn)高效基因?qū)τ谔岣咦魑飳I養(yǎng)的高效利用效率及作物產(chǎn)量， 解決糧食危機并減少由化肥施用引起的環(huán)境污染具有重要意義，而克隆潛在的高產(chǎn)高效基因并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，在模式植物擬南芥中進(jìn)行功能分析來篩選高產(chǎn)高效基因則是尋找大豆高產(chǎn)高效基因的有效手段。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是通過在模式植物擬南芥中的功能分析，篩選到潛在的大豆高產(chǎn)高效基因，既避免了通過多種基因分別轉(zhuǎn)化大豆來篩選基因的復(fù)雜流程，同時也為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)高效的轉(zhuǎn)基因大豆提供了依據(jù)。本發(fā)明第一次克隆了大豆自噬相關(guān)基因，并證明該基因具有轉(zhuǎn)基因作物育種價值，將該基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，有潛力獲得可以高效利用土壤中有限的營養(yǎng)而提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因作物新品種。本發(fā)明在NCBI中尋找擬南芥AtATG8c基因在大豆中的同源基因(GenBank AK246026. 1，目前只已知序列信息，無相關(guān)功能研究等)，該基因全長799bp，本發(fā)明選擇該基因的開放讀碼框(ORF)序列命名為GmATGSc (大豆自噬相關(guān)基因)，長度為360bp。該基因核酸序列選自(a)如序列表1所示的核酸序列；(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。作為具體應(yīng)用的實例，本發(fā)明提供了一種大豆自噬相關(guān)基因GmATGSc的克隆方法，具體操作步驟如下第一、以大豆cDNA為模板，用PCR方法擴增大豆自噬相關(guān)基因GmATGSc ；第二、回收PCR擴增產(chǎn)物；第三、將上述第二步回收的擴增產(chǎn)物，與pMD-18T載體(購自Takara公司)在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)；第四、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；第五、通過抗性篩選，獲得該GmATGSc基因的陽性TA克隆。本發(fā)明同時提供了一種該GmATGSc基因的應(yīng)用，S卩利用獲得的自噬相關(guān)基因 GmATG8c,構(gòu)建獲得由CaMV35S啟動子驅(qū)動基因GmATG8c表達(dá)的構(gòu)建(即“CaMV35S啟動子-GmATGSc”)，并進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，從而獲得基因組中含有可在植物中組成型表達(dá)含有以上所述核酸序列基因的轉(zhuǎn)基因植株。操作過程如下所述應(yīng)用中的雙元表達(dá)載體“CaMV35S啟動子-GmATGSc”的構(gòu)建方法，包括如下步驟第一、用Nco I/BstP I雙酶切含有基因GmATG8c的TA克隆質(zhì)粒，回收GmATG8c基因片段；
第二、用NcoI/BstPI雙酶切pCAMBIA1301 (購自CAMBIA公司)質(zhì)粒，回收大的載體片段(其中含有CaMV35S啟動子的編碼序列)；第三、混合上述第一步得到的GmATG8c基因片段和第二步得到的pCAMBIA 1301 載體片段，在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)，完成在pCAMBIA 1301載體上的“CaMV35S啟動子-GmATG8c” 構(gòu)建。其中所設(shè)計的GmATGSc基因的PCR擴增引物如下，其中上游引物引入了 Nco I酶切位點，下游引物引入了 BstP I酶切位點上游引物5，-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3，下游引物5，-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3，。所述應(yīng)用中的“CaMV35S啟動子-GmATG8c”構(gòu)建在轉(zhuǎn)基因植株中組成型表達(dá)，操作過程如下擬南芥轉(zhuǎn)化的具體方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花苞浸泡法(Clough與Bent，1998)， 獲得的種子經(jīng)過30mg/L潮霉素抗性篩選，生長正常的抗性植株轉(zhuǎn)土培養(yǎng)；采用基因組PCR 的方法檢測基因GmATG8c的表達(dá)。作為具體應(yīng)用的實例，本發(fā)明提供了一種在轉(zhuǎn)基因擬南芥中篩選高產(chǎn)高效基因的方法。操作過程如下第一、分別將野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥種子消毒后鋪于1/2MS培養(yǎng)基中，長日照 (16h光照/8h黑暗)22°C垂直板培養(yǎng)9天；第二、選取生長狀態(tài)一致的野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗移至營養(yǎng)土中長日照(1 光照/8h黑暗)22°C培養(yǎng)；第三、持續(xù)觀察野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型并記錄；第四、待植物種子完全成熟后，分別單株收獲種子，稱量出單株產(chǎn)量，并比較野生型與轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量差別。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果目前植物高產(chǎn)高效基因研究較少，而大豆中的自噬相關(guān)基因目前還沒有研究報道，本發(fā)明第一次克隆出大豆自噬相關(guān)基因GmATG8c，構(gòu)建出由CaMV 35S啟動子驅(qū)動基因 GmATGSc表達(dá)的雙元表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥及在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的功能分析發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下，35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥營養(yǎng)生長較野生型旺盛，蓮座更大， 生物量提高，說明轉(zhuǎn)基因植株對土壤中營養(yǎng)的利用效率提高；同時轉(zhuǎn)基因擬南芥單株產(chǎn)量明顯提高，暗示大豆自噬相關(guān)基因GmATGSc為潛在的大豆高產(chǎn)高效基因，具有重大育種價值，因此，本發(fā)明獲得了一個具有應(yīng)用于高產(chǎn)高效大豆育種潛力的基因GmATGSc，這為后續(xù)在大豆中過表達(dá)自噬相關(guān)基因GmATGSc，獲得具有高產(chǎn)高效性狀潛力的轉(zhuǎn)基因大豆新品種提供了基礎(chǔ)，將該基因轉(zhuǎn)入作物中，可能獲得可以高效利用土壤中有限營養(yǎng)并提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因作物新品種，這將有助于解決糧食危機，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，并減少由施用化肥引起的環(huán)境污染，因此，本發(fā)明具有重要應(yīng)用價值。

圖1是;35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR鑒定；泳道M :plus2000 Marker ；泳道1 15 各潮霉素抗性擬南芥植株的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；泳道16 野生型擬南芥植株的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；泳道17 :35S-GmATG8c質(zhì)粒為模板的PCR的正對照；泳道18 =H2O為模板的PCR的負(fù)對照。圖2是35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型對照組擬南芥在4周苗齡時的蓮座表型圖；上排為35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥；下排為野生型對照組擬南芥。圖3是35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型對照組擬南芥對低氮脅迫的耐受性比較圖，A是缺氮培養(yǎng)M天的野生型擬南芥，B是缺氮培養(yǎng)M天的35S-GmATG8c轉(zhuǎn)基因擬南芥。
具體實施方式實施例1 大豆自噬相關(guān)基因GmATG8c的克隆第一、以大豆cDNA為模板利用PCR方法擴增360bp的GmATGSc基因，回收擴增產(chǎn)物并進(jìn)行TA克隆。(I)PCR擴增目的片段根據(jù)已知的大豆自噬相關(guān)基因GmATGSc的序列設(shè)計特異引物，在上游引物中引入 NcoI酶切位點，在下游引物中引入BstPI酶切位點。上游引物5，-ATTTCGCCATGGCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC-3，(引入Nco I 切點)下游引物5’-GATTTGGGTCACCTATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC-3’(引入 BstPI 切占)用Trizol法提取擬大豆RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行 PCR擴增，制備GmATG8c基因片段。PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1. 一種大豆自噬相關(guān)基因—/iat，其核酸序列選自(a)如序列表1所示的核酸序列；(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85%以上的同源性的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所設(shè)計的基因PCR擴增引物如下，其中上游引物中引入了 Afc0 I酶切位點，下游引物中引入了 fe爐I酶切位點上游引物5，- ATTTCG^rggCCAAAACCTCCTTCAAGCTTC -3，下游引物5，- GATTTG^TOCrrATTTACAGAAGTTAACATGCATTATGC -3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，從大豆cDNA中克隆獲得該―爪階基因， 具體操作步驟如下(1)以大豆cDNA為模板，用PCR方法擴增GmATGSc基因；(2)回收PCR擴增產(chǎn)物；(3)將上述(2)步回收的擴增產(chǎn)物，與PMD-18T載體在連接酶催化下進(jìn)行連接反應(yīng)；(4)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；(5)通過抗性篩選，獲得該GmATGSc基因的陽性TA克隆。
4.一種權(quán)利要求1所述的大豆自噬相關(guān)基因的應(yīng)用，其特征在于，利用獲得的大豆自噬相關(guān)基因GmATG8c，構(gòu)建獲得由CMfF ^裕啟動子驅(qū)動該GmATG8c基因表達(dá)的雙元表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化，從而獲得基因組中含有可在植物中組成型表達(dá)含有以上所述核酸序列基因的轉(zhuǎn)基因植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，將CaMV啟動子驅(qū)動該基因表達(dá)的構(gòu)建轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，已獲得該基因組成型異源表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出高效利用營養(yǎng)的能力，在全營養(yǎng)培養(yǎng)條件下35^--7 ^過表達(dá)植株蓮座增大，同時植株產(chǎn)量明顯提高，具有高產(chǎn)高效特性；在缺氮培養(yǎng)條件下，^5^--7 ^轉(zhuǎn)基因擬南芥對低氮脅迫的耐受性更強。
全文摘要
一種大豆自噬相關(guān)基因的克隆及其應(yīng)用。該基因核酸序列如序列表1所示，它是大豆細(xì)胞自噬相關(guān)基因GmATG8c，在大豆細(xì)胞中自噬體的形成過程中起重要作用。本發(fā)明克隆了大豆中的ATG8c基因，構(gòu)建出由CaMV35S啟動子驅(qū)動該GmATG8c基因表達(dá)的雙元表達(dá)載體，并采用花苞浸泡法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。得到的轉(zhuǎn)基因植株營養(yǎng)生長更旺盛，同時植株產(chǎn)量得到明顯提高，而且轉(zhuǎn)基因擬南芥對低氮脅迫的耐受性更強。說明該GmATG8c基因有應(yīng)用于大豆新品種選育的潛力，本發(fā)明為獲得高產(chǎn)高效的轉(zhuǎn)基因大豆提供了基因資源，具有重要應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/29GK102212530SQ20111012312
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月13日 公開號201110123127.9
發(fā)明者夏銅梅, 王寧寧, 龔清秋 申請人:南開大學(xué)