本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及大豆類枯草桿菌蛋白酶基因（Gmsbt1.6-3）及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

絲氨酸蛋白酶(Serine protease)是一類功能域以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，通過對(duì)蛋白酶原的激活或抑制起調(diào)節(jié)因子的作用。絲氨酸蛋白酶是重要的蛋白水解酶，約有30個(gè)家族，分屬于六大類：糜蛋白酶、類枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶Ｃ、丙氨酸蛋白酶、阻遏蛋白LexA、三磷酸腺苷依賴型絲氨酸蛋白酶。其中，類枯草桿菌蛋白酶家族，是絲氨酸蛋白酶中最大的家族之一。

類枯草桿菌蛋白酶(Subtilisin-like protease)廣泛存在于細(xì)菌、真菌和寄生蟲等生物中。這類蛋白酶在結(jié)構(gòu)上具有典型的 Asp/Ser/His 催化結(jié)構(gòu)域，具有廣泛的生理學(xué)功能。研究表明，類枯草桿菌蛋白酶與病原性細(xì)菌、真菌的致病性相關(guān)，在真菌孢子形成過程中的蛋白質(zhì)充分降解及細(xì)胞自噬過程等方面起非常重要的作用。木麻黃中的cg12基因在根瘤形成早期受弗蘭克氏菌（Frankia）誘導(dǎo)表達(dá)，參與粗枝木麻黃和弗蘭克氏菌的共生過程。番茄P69B和P69C在丁香假單胞菌（Pseudomonas syrin-gae）感染和水楊酸（Salicylic acid）誘導(dǎo)下表達(dá)，P69E和P69F也參與對(duì)病原入侵的抵御。鐘云等以黃龍?。℉LB）侵染的紅橘根系為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)類枯草桿菌蛋白酶基因（CICLE-v10027863mg, CcSubtilisin）的表達(dá)上調(diào)達(dá)5.53倍，通過iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白水平上調(diào)3.9倍，研究表明該基因及其蛋白受 HLB侵染誘導(dǎo)，可能在柑橘宿主與黃龍病菌的互作中起重要作用。但關(guān)于大豆中類枯草桿菌蛋白酶基因的功能研究及與疫霉根腐病相互關(guān)系方面的研究目前還未有報(bào)道。

本研究通過基因工程技術(shù)，從大豆中分離克隆了大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并構(gòu)建該基因的植物過表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，通過對(duì)大豆植株的轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證新基因Gmsbt1.6-3的功能，為該基因的利用奠定了基礎(chǔ)，為抗大豆疫霉根腐病新品種的培育提供基因資源和基礎(chǔ)材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為提高植物的抗病性，而提供一種大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3。

大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；

它來源于大豆根系突變體材料M18；

大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3在培育抗疫霉根腐病植物品種的應(yīng)用；

所述的疫霉根腐病為大豆疫霉根腐??；

本發(fā)明提供了大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，它是從大豆根系突變體材料M18中分離克隆的大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，并構(gòu)建該基因的植物過表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，通過對(duì)大豆植株的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化植株具有抗疫霉根腐病的功能，為抗大豆疫霉根腐病新品種的培育提供基因資源和基礎(chǔ)材料。

附圖說明

圖 1 Gmsbt1.6-3基因核心片段的 PCR 擴(kuò)增電泳圖； M: DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1：PCR 產(chǎn)物；

圖2 Gmsbt1.6-3蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬；

圖3 Gmsbt1.6-3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹；

圖4 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建；A.植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的雙酶切；B. 目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增；

圖5 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證，A.雙酶切驗(yàn)證；B. PCR驗(yàn)證；

圖6 植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)；

圖7 植物干擾表達(dá)載體的構(gòu)建；A. 植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的雙酶切；B. 目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增；

圖8 植物干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證；A. 雙酶切驗(yàn)證；B. PCR驗(yàn)證；

圖9 植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)；

圖 10 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化；A：萌發(fā)階段； B：浸染后共培養(yǎng)階段；C：浸染后篩選培養(yǎng)階段；D：伸長培養(yǎng)階段；E：生根培養(yǎng)階段；F-G：移栽培養(yǎng)階段；

圖11 T0代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)；A.篩選標(biāo)記基因bar；B. 35S啟動(dòng)子；C. NOS終止子；

圖12 T1代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)；A.篩選標(biāo)記基因bar；B. 35S啟動(dòng)子；C. NOS終止子

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-3：轉(zhuǎn)基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉(zhuǎn)基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖13 T2代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)；A.篩選標(biāo)記基因bar；B. 35S啟動(dòng)子；C. NOS終止子

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-3：轉(zhuǎn)基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉(zhuǎn)基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖14 T2代Southern blot檢測(cè)；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P:陽性對(duì)照;CK:陰性對(duì)照(未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植株);1-3：轉(zhuǎn)基因陽性植株OEA1-OEA3；4-7：轉(zhuǎn)基因陽性植株IEA1-IEA4；

圖15 Gmsbt1.6-3基因在轉(zhuǎn)植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的植株中的相對(duì)表達(dá)量；

圖16 Gmsbt1.6-3基因在轉(zhuǎn)植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的植株中的相對(duì)表達(dá)量。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

大豆（Glycine max）品種吉農(nóng)18，大豆根系突變體材料M18，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心提供。

基因Gmsbt1.6-3的 cDNA 序列的克隆

使用TAKARA公司生產(chǎn)的RNAiso試劑盒從大豆M18苗期根系組織提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，根據(jù)RNA-seq測(cè)序結(jié)果序列，設(shè)計(jì)特異引物sbt，采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段并測(cè)序，試驗(yàn)所需PCR擴(kuò)增引物見表1。

表1 PCR引物序列

根據(jù)前期篩選得到的Gmsbt1.6-3序列片段設(shè)計(jì)擴(kuò)增長度為764bp 的特異引物sbt，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，得到一條與預(yù)期大小相同的核酸條帶（圖1），將 PCR 產(chǎn)物克隆至 PMD18-T 載體后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與 NCBI中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，未找到與目的基因相一致的已知序列，初步判斷克隆得到的基因?yàn)槲粗男禄?。通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)基因與序列號(hào)為XM_003553760.3的序列相比同源性最高，在98%覆蓋度水平上的一致性達(dá)到 98%，且與其他的Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6基因序列比對(duì)相似性較高，推測(cè)目標(biāo)基因是Glycine max subtilisin-like protease SBT1.6家族的成員之一，因此為該目標(biāo)基因命名為Gmsbt1.6-3。

實(shí)施例2Gmsbt1.6-3基因的生物信息學(xué)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將Gmsbt1.6-3基因全序列連入克隆載體pMD18-T Vector，對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。

利用在線分析程序ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對(duì)新基因序列進(jìn)行可能的開放閱讀框分析，通過 DNAMAN 軟件將新基因ORF翻譯成氨基酸序列；利用ProtParam軟件(http//www. web. expasy. org / protparam/ ) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)序列理論參數(shù)；利用SWISS-MODEL在線軟件構(gòu)建Gmsbt1.6-3基因的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)；利用Protscale軟件( http: / /web. expasy. org / /protscale /預(yù)測(cè)蛋白的親疏水性。

在 NCBI 網(wǎng)站中下載所有已知sbt基因序列，通過 DNAMAN 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多重比對(duì)，分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

通過在線分析程序 ORF FINDER對(duì)新基因Gmsbt1.6-3的核酸序列進(jìn)行分析，并預(yù)測(cè)理論上的編碼區(qū)的位置。分析結(jié)果表明，Gmsbt1.6-3基因理論上的開放閱讀框?yàn)?91可編碼197個(gè)氨基酸殘基。

ProtParam軟件分析其相對(duì)分子量為19731.98，理論等電點(diǎn)(PI) 為4.64，正電荷氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys) 為11，負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為17，分子式為C₈₅₉H₁₃₂₆N₂₃₄O₂₈₀S₁₀。氨基酸組分析表明: 甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）含量較高分別占14.3%、12.2%、11.2%?？偲骄杷笖?shù)Grand average of hydropathicity (GRAVY)為0.002。

利用ProMod version 3.70 軟件構(gòu)建Gmsbt1.6-3蛋白3D 立體結(jié)構(gòu)圖，其中含有類枯草桿菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化結(jié)構(gòu)域（圖2）。

搜索NCBI網(wǎng)站上植物已知的全部大豆sbt基因的氨基酸序列，利用DNAMAN軟件建立Gmsbt1.6-3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖2）。使用 Neighbor-Joining 統(tǒng)計(jì)法，根據(jù)各Gmsbt1.6-3蛋白的序列同源性將進(jìn)化分析結(jié)果分為三組，蛋白Gmsbt1.6-3與大豆Gmsbt1.6-1、Gmsbt1.6-2的同源性最高，遺傳距離最近，推測(cè)Gmsbt1.6-3有可能是大豆Gmsbt1.6基因家族中還未發(fā)現(xiàn)的新基因成員。

實(shí)施例3植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用限制性內(nèi)切酶BglII和PmlI對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，利用Seamless Assembly Clonng Kit試劑盒，將克隆得到的Gmsbt1.6-3全長基因替換3301上原有的GUS基因。構(gòu)建以Bar為篩選標(biāo)記，CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)目標(biāo)基因Gmsbt1.6-3的pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3植物過表達(dá)載體。

利用BglII和PmlI限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbt-over對(duì)克隆載體Pmd18-T- Gmsbt1.6-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小591bp的Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段（圖4），利用T4連接酶將Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301。

對(duì)構(gòu)建成功的植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，均得到與預(yù)期大小相符的Gmsbt1.6-3基因ORF全長片段591bp（圖5），對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，說明植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3構(gòu)建成功（圖6）。

采用同樣方法，將3301上原有的GUS基因替換為Gmsbt1.6-3正義+內(nèi)含子+Gmsbt1.6-3反義片段，構(gòu)建pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植物干擾表達(dá)載體。

利用BglII和PmlI限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2029bp的GUS基因片段；利用引物sbtZ、SSR、sbtF分別對(duì)克隆載體Pmd18-T-Gmsbt1.6-3和Pmd18-T-SSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為591bp的目的基因正義片段、205bp的SSR內(nèi)含子片段、和591bp的目的基因反義片段（圖7），利用無縫克隆連接酶將Gmsbt1.6-3正義片段、內(nèi)含子SSR和Gmsbt1.6-3反義片段同時(shí)連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，得到植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi。

對(duì)構(gòu)建成功的植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定。用BglII和PmlI雙酶切該質(zhì)粒，得到一條大小約為1387bp的sbtZ-SSR-sbtF干擾片段；分別對(duì)Gmsbt1.6-3正義片段、反義片段、SSR內(nèi)含子、進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增條帶都與預(yù)期大小相符，得到大小為591bp的Gmsbt1.6-3正義片段、205bp的SSR內(nèi)含子片段、591bp的Gmsbt1.6-3反義片段（圖8）。對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，說明植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi構(gòu)建成功（圖9）。

將構(gòu)建好的植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3和植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大豆材料M18。

實(shí)施例4轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

采用改良的CTAB法，從大豆葉片中提取基因組DNA，將其作為模板，以載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照，分別以篩選標(biāo)記基因bar、35S啟動(dòng)子和NOS終止子的特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)PCR檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。以純化的篩選標(biāo)記基因bar為模板制備探針，采用隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，雜交及檢測(cè)的其他步驟均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII試劑盒的說明書操作。

以大豆突變體材料M18作為受體，將構(gòu)建好的植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3和植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)，經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、伸長培養(yǎng)、生根、煉苗、移栽培養(yǎng)，獲得抗性轉(zhuǎn)化植株，并在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)和加代。

通過遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得抗性苗10株，其中4株為轉(zhuǎn)植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3的轉(zhuǎn)化植株，對(duì)篩選標(biāo)記Bar基因、35S啟動(dòng)子、NOS終止子三個(gè)外源片段進(jìn)行PCR檢測(cè)，均檢測(cè)為陽性的有3株，分別標(biāo)號(hào)OEA1-OEA3（OEA，over expression- agrobacterium-mediated method）。6株轉(zhuǎn)植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- Gmsbt1.6-3-RNAi的抗性植株中，均檢測(cè)為陽性的有4株，分別標(biāo)號(hào)IEA1-IEA4（IEA，interference expression- agrobacterium-mediated method）（圖11）。

將檢測(cè)為陽性的植株在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)至成熟，收獲籽粒，在溫室內(nèi)進(jìn)行加代，對(duì)T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，Gmsbt1.6-3基因過表達(dá)植株OEA1-OEA3、干擾表達(dá)植株IEA1-IEA4的T1代植株均檢測(cè)到了篩選標(biāo)記基因bar、35S啟動(dòng)子和NOS終止子（圖12）。

將檢測(cè)為陽性的T1代植株在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)至成熟，收獲籽粒，在溫室內(nèi)進(jìn)行加代，對(duì)T2代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，Gmsbt1.6-3基因過表達(dá)植株OEA1-OEA3、干擾表達(dá)植株IEA1-IEA4的T2代植株均檢測(cè)到了篩選標(biāo)記基因bar、35S啟動(dòng)子和NOS終止子（圖13）。

對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行southern雜交檢測(cè)，選用HindⅢ限制性內(nèi)切酶，對(duì)外源篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行Southern雜交分析，檢測(cè)外源基因在大豆M18的整合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化事件的準(zhǔn)確性。雜交結(jié)果顯示PCR檢測(cè)為陽性的7株轉(zhuǎn)基因植株均有明顯的雜交信號(hào)，且雜交帶的大小、位置互不相同（圖14），說明外源基因bar已經(jīng)整合到大豆的基因組中，且整合形式均為單拷貝。

實(shí)施例5接菌處理后對(duì)大豆Gmsbt1.6-3基因相對(duì)表達(dá)量的影響

采用“下胚軸侵染法”對(duì)轉(zhuǎn)化陽性材料進(jìn)行疫霉根腐病的接菌處理，鑒定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)大豆種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。選擇生長初期的大豆植株，對(duì)生真葉長出至完全平展后，接種大豆疫霉根腐病病原菌，接種后對(duì)傷口進(jìn)行保濕處理7天，溫度控制在20-25℃、濕度保持在90%以上。接種后5天，提取大豆的根部組織總 RNA，對(duì)目的基因Gmsbt1.6-3進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè)。

溫室內(nèi)種植T2代轉(zhuǎn)基因陽性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4，幼苗期通過“下胚軸侵染法”接種大豆疫霉根腐病病菌。接菌后進(jìn)行保濕處理，環(huán)境溫度控制在20-25℃，濕度保持在90%以上，接菌處理5天后，提取根部組織總RNA，對(duì)目的基因Gmsbt1.6-3進(jìn)行Real-time PCR測(cè)定。采用2^-ΔΔCT法計(jì)算數(shù)據(jù)，分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

在大豆根部中，設(shè)定對(duì)照植株M18未侵染疫霉根腐病菌的Gmsbt1.6-3表達(dá)量為1，其他轉(zhuǎn)化材料及其他處理的表達(dá)水平都對(duì)比于這個(gè)設(shè)定值。如圖15所示，未接菌條件下，轉(zhuǎn)植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3的Gmsbt1.6-3基因相對(duì)表達(dá)量分別為2.56、3.0467、2.81，都明顯高于對(duì)照M18。接種大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相對(duì)表達(dá)量有顯著增加，Gmsbt1.6-3基因在對(duì)照M18植株中的相對(duì)表達(dá)量上升到了2.8867，在轉(zhuǎn)植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3中，分別為5.2、6.123、5.243。說明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)。

未接菌條件下，與對(duì)照植株M18相比，轉(zhuǎn)植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi的陽性植株Gmsbt1.6-3基因的相對(duì)表達(dá)量都受到了明顯的抑制，IEA1-IEA4植株中Gmsbt1.6-3基因分別被抑制了37.33%、57.67%、50.67%、33.67%。接種大豆疫霉根腐病病原菌5天后，各植株的Gmsbt1.6-3基因相對(duì)表達(dá)量有顯著增加，對(duì)照M18植株中該基因的相對(duì)表達(dá)量上升到了2.563，轉(zhuǎn)植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株的干擾效果受病原菌侵染影響有所下降，Gmsbt1.6-3基因在陽性植株IEA1-IEA4中分別被抑制了23%、37%、22.667%、16%，進(jìn)一步說明Gmsbt1.6-3基因受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)（圖16）。

實(shí)施例6轉(zhuǎn)化植株的抗病性鑒定

采用“下胚軸侵染法”對(duì)轉(zhuǎn)化陽性材料進(jìn)行疫霉根腐病的接菌處理，鑒定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)大豆種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。選擇生長初期的大豆植株，對(duì)生真葉長出至完全平展后，接種大豆疫霉根腐病病原菌，接種后對(duì)傷口進(jìn)行保濕處理7天，溫度控制在20-25℃、濕度保持在90%以上。接種后5天，調(diào)查轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照受體品種的死亡率。株系或品種有 70%或以上的植株死亡則為感病(susceptible，S)；70%或以上植株正常生長則為抗病(resistant，R)；31%-69%植株死亡的株系或品種為中抗 (moderately resistant，MR)。

使用假設(shè)測(cè)驗(yàn)對(duì) T2代轉(zhuǎn)基因陽性株系OEA1-OEA3和IEA1-IEA4疫霉根腐病抗病性鑒定所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)死亡率鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陽性株系OEA1-OEA3對(duì)疫霉菌 1 號(hào)生理小種抗性水平較受體對(duì)照品種顯著提高，其中OEA2株系的接種死亡率最低，為30%，達(dá)到了抗性水平；OEA1、OEA3株系的抗性水平同對(duì)照CK都一樣，都是中感水平，但接種死亡率分別為36.67%和40%，顯著低于對(duì)照，說明轉(zhuǎn)植物過表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3的陽性植株OEA1-OEA3對(duì)大豆疫霉根腐病根腐病的抗性得到了顯著的提高（表2）。

相反的，轉(zhuǎn)基因陽性株系IEA1-IEA4對(duì)疫霉菌 1 號(hào)生理小種抗性水平較受體對(duì)照品種顯著降低，其中IEA3株系的接種死亡率最高，為76.67%，其次是IEA2為73.33%，都達(dá)到了感病水平；IEA1、IEA4株系的抗性水平同對(duì)照CK都一樣，都是中感水平，但接種死亡率分別為63.33%和66.67%，顯著高于對(duì)照，說明轉(zhuǎn)植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301-Gmsbt1.6-3-RNAi植株IEA1-IEA4對(duì)大豆疫霉根腐病根腐病的抗性受到了明顯的抑制。

本試驗(yàn)采用RT-PCR的方法，從大豆苗期根系的cDNA中成功分離克隆了一個(gè)新的大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3，該基因在結(jié)構(gòu)上具有類枯草桿菌蛋白酶家族典型的 Asp/Ser/His 催化結(jié)構(gòu)。研究表明，類枯草桿菌蛋白酶在結(jié)構(gòu)上雖然有相似性，但在其表達(dá)和功能上存在差異。在擬南芥中，SDD1在氣孔前體細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，與調(diào)節(jié)氣孔密度的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)；ALE1基因在種子萌發(fā)過程中特異表達(dá)，與擬南芥胚發(fā)育過程中的角質(zhì)層形成和表皮分化時(shí)信號(hào)肽的產(chǎn)生有關(guān)；AIR3在側(cè)根形成過程中表達(dá)，參與調(diào)控側(cè)根原基數(shù)量；Ara12在角果、莖及葉片中表達(dá)，參與植株形態(tài)建成。在番茄中，P69A 在除根和花之外的所有植物器官中表達(dá)且與細(xì)胞延伸相關(guān)；P69D除不在根中表達(dá)外，在其他器官中都有表達(dá)，與細(xì)胞分裂、延伸相關(guān)。大豆中，SCS1在種皮中表達(dá)量最高，與厚壁組織的分化有關(guān)；SLP-1在處于發(fā)育期種子的種皮中表達(dá)，而SLP-2主要在發(fā)芽種子的子葉中表達(dá)，這兩個(gè)基因都參與種子萌發(fā)。粗枝木麻黃中，cg12在根瘤形成早期受弗蘭克氏菌（Frankia）誘導(dǎo)表達(dá)，參與粗枝木麻黃和弗蘭克氏菌的共生過程。

本研究通過在大豆植株中對(duì)Gmsbt1.6-3基因進(jìn)行過量表達(dá)和干擾表達(dá)，鑒定新基因功能。接種大豆疫霉根腐病病原菌，進(jìn)行熒光定量PCR分析結(jié)果表明，大豆類枯草桿菌蛋白酶基因Gmsbt1.6-3受大豆疫霉根腐病病原菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)，該基因在大豆抗病反應(yīng)中的作用及調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

<110> 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 大豆類枯草桿菌蛋白酶基因及應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

aagtggaagg gccactgcgt tgctgctaaa gactttcccc ccacctcctg caaccggaaa 60

ctcatcggag ctcgctactt ctgcgctggc tacgaagcca ccaacggcaa aatgaacgac 120

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