專利名稱：適用于多種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細(xì)胞大規(guī)模高密度培養(yǎng)過程中用于生產(chǎn)抗體、疫苗、基因重組蛋白等生物產(chǎn)品的無血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
動物細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)各類生物活性物質(zhì)如單克隆抗體、病毒疫苗、病毒載體、免疫調(diào)節(jié)因子、生長因子、特定腫瘤抗原以及各種基因重組蛋白質(zhì)藥物等，傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中通常需要添加一定量(5％-10％)的牛血清，血清中含有細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其它的營養(yǎng)物質(zhì)，可以極大地促進(jìn)細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的表達(dá)。
然而，血清的應(yīng)用也帶來很多缺點(diǎn)(1)血清易受病毒、支原體或其它病原體的污染；(2)不同批號血清間差異造成產(chǎn)品批次間的差異；(3)大量血清蛋白的存在增加了下游分離純化的難度，使其成本升高，回收率降低；(4)部分血清蛋白難以通過分離純化手段徹底去除，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的最終質(zhì)量。
為了克服血清所帶來的各種缺點(diǎn)，八十年代起就有許多研究者從事無血清培養(yǎng)基的研究開發(fā)工作，Darfler等開發(fā)了CITTL無血清培養(yǎng)基，它以DMEM/F12(1∶1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1.5mg/L的胰島素，3.0mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白，2nmol/L的睪酮，5mg/L的過氧化氫酶，1.5mg/L的β-甘油磷酸，0.5mg/L的二亞油酰磷脂膽堿，用于雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)；Murakami等開發(fā)了DMEM/F12-ITES無血清培養(yǎng)基，它是在DMEM/F12的基礎(chǔ)上添加了5mg/L的胰島素，2-35mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白，20μmol/L乙醇胺，1nmol/L亞硒酸鈉，該培養(yǎng)基被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。
另外，美國專利U.S.P.5,063,157所涉及的無血清培養(yǎng)基用于哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、蛋白胨、beta-D-xylopyranose derivative、硒和多胺，是一款低蛋白培養(yǎng)基；美國專利U.S.P.4,443,546則是另一款類似的低蛋白培養(yǎng)基；美國專利U.S.P.4,657,866涉及一種全部組分明確(chemical defined medium)的合成培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動物和人的一些細(xì)胞系；歐洲專利E.P.481,791公開一種用于CHO細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，它含有水、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、糖、氨基酸、鐵、生長因子和其它必需成分。
目前，已有大量的商業(yè)化無血清培養(yǎng)基被開發(fā)并應(yīng)用于各類動物細(xì)胞培養(yǎng)，如GIBCO公司用于雜交瘤細(xì)胞的CD Hybridoma培養(yǎng)基、Hybridoma-SFM培養(yǎng)基、PFHM-IIProtein-free培養(yǎng)基，用于CHO細(xì)胞的CD CHO培養(yǎng)基、CHO-s-SFMII培養(yǎng)基；SIGMA公司的Hybri-Max等等。
上述無血清培養(yǎng)基都有各自的優(yōu)點(diǎn)，大都能很好地支持細(xì)胞的生長，但同時它們也存在很多缺點(diǎn)(1)因價格昂貴，只適合實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模使用；而不適合大規(guī)模生物反應(yīng)器；(2)培養(yǎng)基沒有針對細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化，所支持的細(xì)胞密度較低，導(dǎo)致生產(chǎn)過程產(chǎn)率不高；(3)有些培養(yǎng)基雖然能很好地支持細(xì)胞生長，但往往會導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的能力降低，甚至喪失；(4)培養(yǎng)基對細(xì)胞有很高的特異性，通常一種培養(yǎng)基只適合一個細(xì)胞株或細(xì)胞系，而不適合其它的細(xì)胞株或細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題在于公開一種適用于多種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的適用于多種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基是以重量比為＝1∶1的DMEM和F12的為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、丙酮酸鈉白蛋白、β-巰基乙醇、微量元素、激素、必需氨基酸等成分；培養(yǎng)基DMEM和F12的組分在GIBCO或SIGMA公司產(chǎn)品目錄上均已公開，有關(guān)人員可參閱，本發(fā)明不再贅述，可采用商業(yè)化的產(chǎn)品，如GIBCO或SIGMA公司的產(chǎn)品；本發(fā)明最終形成的無血清培養(yǎng)基的組分和含量如下



本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備方法是十分簡單的，可采用常規(guī)的方法將上述組分溶解無熱源超純水即可制備而成。
本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于雜交瘤細(xì)胞、rCHO細(xì)胞、293細(xì)胞等細(xì)胞系或細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)和高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)。它具有以下優(yōu)點(diǎn)1.能支持多個細(xì)胞株或細(xì)胞系的生長；2.在細(xì)胞生長、產(chǎn)物表達(dá)方面與含血清培養(yǎng)基接近或相當(dāng)；3.支持細(xì)胞的長期傳代培養(yǎng)；
4.含有較低濃度的蛋白質(zhì)，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品的品質(zhì)；5.價格低廉，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；最重要的是，本發(fā)明所形成的無血清培養(yǎng)基適用于多個細(xì)胞株或細(xì)胞系的連續(xù)灌注培養(yǎng)，可獲得較高的細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度，能顯著提高生產(chǎn)過程效率和產(chǎn)品產(chǎn)率。


圖1為HB58雜交瘤細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)的細(xì)胞生長與產(chǎn)物表達(dá)曲線。
圖2為CHO細(xì)胞連續(xù)灌注培養(yǎng)的細(xì)胞生長與產(chǎn)物表達(dá)曲線。
圖3為批培養(yǎng)中293細(xì)胞的生長曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基可用于雜交瘤細(xì)胞的高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成成分如下



將上述組分混合并溶解無熱源超純水，即可獲得培養(yǎng)基。
將HB58雜交瘤細(xì)胞(從ATCC獲得)在本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中傳代適應(yīng)后，在BF-2(德國B.BRAUN公司)2升生物反應(yīng)器中接種，接種密度2.0×105cells/ml，培養(yǎng)56小時后開始灌注，灌注速率為0.5(1/day)，灌注培養(yǎng)基即為本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)至200小時后細(xì)胞密度維持在1.2×107cells/ml左右，單克隆抗體濃度維持在500mg/L左右(見圖1)，與普通培養(yǎng)基批培養(yǎng)的結(jié)果相比，細(xì)胞密度和單抗?jié)舛染岣?倍以上。圖中，曲線1為活細(xì)胞密度，曲線2為總細(xì)胞密度，曲線3為單抗表達(dá)量。
實(shí)施例2本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基可用于rCHO細(xì)胞的高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成成分如下



將rCHO細(xì)胞(rCHO SS3 A2，表達(dá)人抗凝血因子III)在本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中傳代適應(yīng)后，在B.BRAUN 2升生物反應(yīng)器中接種，接種密度2.0×105cells/ml，培養(yǎng)40小時后開始灌注，灌注速率為0.58(1/day)，灌注培養(yǎng)基即為本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)至255小時后細(xì)胞密度維持在0.9-1.0×107cells/ml左右，產(chǎn)物濃度維持在350-380U/L左右(見圖2)，與普通培養(yǎng)基批培養(yǎng)的結(jié)果相比，細(xì)胞密度和單抗?jié)舛确謩e提高6倍和5倍。圖中，曲線4為活細(xì)胞密度，曲線總細(xì)胞密度，曲線6為產(chǎn)物表達(dá)量。
實(shí)施例3本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基可用于293細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)基的組成成分如下



將293細(xì)胞在本發(fā)明所述的無血清培養(yǎng)基中傳代適應(yīng)后，在B.BRAUN 2升生物反應(yīng)器中接種進(jìn)行批培養(yǎng)，接種密度為2.45×105cells/ml，由圖3可以看出細(xì)胞的生長幾乎看不到遲滯期，接種后即進(jìn)入指數(shù)生長期，平均比生長速率為0.46day-1，最大活細(xì)胞密度為11.0×105cells/ml。圖中，曲線7為活細(xì)胞密度，曲線8為活細(xì)胞比例。
權(quán)利要求
1.一種適用于多種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，是以重量比為1∶1的DMEM和F12的為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、丙酮酸鈉、白蛋白、β-巰基乙醇、微量元素、激素和必需氨基酸等成分組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所說的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中所含的組分和含量參照SIGMA公司產(chǎn)品目錄中公布的配方。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，微量元素選自Mn和/或Mo和/或Ni和/或Se和/或Si和/或Sn和/或V。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，激素選自氫化可的松、地塞米松、雌二醇或孕酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所添加的必需氨基酸包括精氨酸、門冬氨酸、門冬酰氨、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于，最終形成的培養(yǎng)基組分和含量如下
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于，用于雜交瘤細(xì)胞、rCHO細(xì)胞或293細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于多種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。其特點(diǎn)是以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在其基礎(chǔ)上添加了多種生長因子、激素、必需氨基酸和和微量元素，具有(1)能支持多個細(xì)胞株或細(xì)胞系的生長；(2)在細(xì)胞生長、產(chǎn)物表達(dá)方面與含血清培養(yǎng)基接近或相當(dāng)；(3)支持細(xì)胞的長期傳代培養(yǎng)；(4)含有較低濃度的蛋白質(zhì)，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品的品質(zhì)；(5)價格低廉，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。最重要的是，本發(fā)明所形成的無血清培養(yǎng)基適用于多個細(xì)胞株或細(xì)胞系的連續(xù)灌注培養(yǎng)，可獲得較高的細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度，顯著提高生產(chǎn)過程效率和產(chǎn)品產(chǎn)率。
文檔編號C12N5/06GK1778902SQ200510030198
公開日2006年5月31日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者譚文松, 朱明龍, 周燕, 華平, 牛紅星 申請人:華東理工大學(xué)