專利名稱：一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
西尼羅病毒病是由西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)引起的傳染病，是一種人獸共患病。人類感染西尼羅病毒后并不互相傳播，通常為隱性感染.潛伏期為3 15天，大部分感染者癥狀輕微，伴有發(fā)熱，頭痛，喉嚨痛，背痛，肌肉疼痛，關(guān)節(jié)痛，疲勞，結(jié)膜炎，皮疹，淋巴結(jié)腫大，納差，腹痛，腹瀉及呼吸道癥狀等。對(duì)于老年人和兒童可能引起高熱(^ 40°C )，劇烈頭痛及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，如頸項(xiàng)強(qiáng)直，昏睡，昏迷，抽搐，麻痹等，甚至引起死亡。免疫學(xué)方法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)抗原或抗體主要有由雙抗原夾心測(cè)抗體、雙抗體夾心測(cè)抗原、競(jìng)爭(zhēng)法、間接法等。間接法測(cè)抗體的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合形成酶標(biāo)記抗體-抗體-固相抗原復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測(cè)定。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分析等領(lǐng)域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的建立和方法評(píng)價(jià)及優(yōu)化，以縮短檢測(cè)時(shí)間，降低方法的檢測(cè)成本。但是懸浮芯片方法是否能夠檢測(cè)人血清中的西尼羅抗體，其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種檢測(cè)血清中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，該芯片系統(tǒng)包括:芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，反應(yīng)后的溶液吸入到微細(xì)管檢測(cè)通道中，以使得每個(gè)編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。進(jìn)一步，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測(cè)抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每個(gè)反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測(cè)緩沖液。進(jìn)一步,所述編碼微球優(yōu)選為025號(hào)編碼微球。進(jìn) 一步，所述捕獲抗原優(yōu)選為西尼羅E蛋白。[0010]進(jìn)一步，所述待測(cè)抗體為血清樣品。進(jìn)一步，所述生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA優(yōu)選為BiOtin-羊抗兔和/或Biotin-SPA。進(jìn)一步，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親和素-藻紅蛋白。進(jìn)一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進(jìn)一步，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā)并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)和深入的研究，對(duì)西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測(cè)條件作了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點(diǎn):1、抗原包被量的改進(jìn)西尼羅E蛋白抗原的包被量是成功檢測(cè)的關(guān)鍵，本實(shí)用新型對(duì)包被微球的抗原包被量進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測(cè)效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的抗原包被量很低，本實(shí)用新型的抗原包被量為0.1 240 μ g/1.25 X IO6個(gè)編碼微球或0.02 960ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試，而傳統(tǒng)免疫學(xué)ELISA方法的包被量為I μ g/測(cè)試。2、生物素標(biāo)記的改進(jìn)
通常，標(biāo)記抗體需要使用過(guò)量的生物素。理論上講，在檢測(cè)過(guò)程中，過(guò)量的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗體連接，清洗時(shí)被抽濾掉，不會(huì)與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，偶爾遇到過(guò)檢測(cè)信號(hào)可能過(guò)高的現(xiàn)象，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此建議生物素標(biāo)記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍本實(shí)用新型的血清樣品西尼羅抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片定量檢測(cè)方法與經(jīng)典的免疫學(xué)ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果有著很好的吻合性(相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9293)。同時(shí)，懸浮芯片方法靈敏度為血清滴度4.9 X 10_6，其高于ELISA方法的檢測(cè)滴度7.8 X 10_5，靈敏度增高10倍以上；并且懸浮芯片方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍為4.9Χ 10_6 2Χ 10_2，其高于ELISA方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍(即7.8Χ10—5 2X10—2)1個(gè)數(shù)量級(jí)。4、方法的特異性本實(shí)用新型通過(guò)選用西尼羅E蛋白為包被抗原，以兔抗西尼羅抗體為待測(cè)抗體，以生物素化的羊抗兔為檢測(cè)抗體。本研究試驗(yàn)證明，在存在鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感Η5血清、兔抗土拉FopA多克隆抗體、兔抗登革熱NS3抗體等干擾抗體存在的條件下，本方法具有良好的特異性。5、樣品的檢測(cè)能力本實(shí)用新型評(píng)價(jià)了懸浮芯片方法對(duì)人血清的檢測(cè)能力。通過(guò)對(duì)人血清的檢測(cè)，初步證實(shí)了該方法在檢測(cè)人血清中西尼羅抗體的實(shí)用性。

:圖1為本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為025號(hào)微球包被西尼羅E蛋白檢測(cè)西尼羅抗體示意圖；[0028]圖3為蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為蛋白懸浮芯片與ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清的相關(guān)性。
具體實(shí)施方式
如圖1至圖5所示，本實(shí)用新型一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測(cè)儀3和計(jì)算機(jī)4，其中，芯片基體I為96孔濾板或者微量離心管，其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球(圖中未示)，編碼微球上包被有西尼羅E蛋白，用于捕獲待檢測(cè)血清樣品中的待測(cè)抗體，如果樣品中有西尼羅抗體，西尼羅抗體與編碼微球上的西尼羅E蛋白結(jié)合，再加入帶有生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA，形成編碼微球-西尼羅E蛋白-西尼羅抗體-二抗/SPA-生物素復(fù)合物，最后加入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結(jié)合，形成編碼微球-西尼羅E蛋白-西尼羅抗體-二抗/SPA-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復(fù)合物，通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀對(duì)藻紅蛋白熒光信號(hào)的檢測(cè)來(lái)達(dá)到對(duì)血清樣品中西尼羅抗體的檢測(cè)，如果血清樣品中沒有西尼羅抗體，包被有西尼羅E蛋白的編碼微球不會(huì)與后面加入的生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合，最后通過(guò)懸浮芯片檢測(cè)儀器進(jìn)行檢測(cè)時(shí)無(wú)熒光信號(hào)或應(yīng)該信號(hào)非常弱。上述芯片系統(tǒng)中，編碼微球在微球稀釋液，待測(cè)抗體在樣品稀釋液中，生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA在抗體稀釋液中，熒光信號(hào)檢測(cè)物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測(cè)儀檢測(cè)時(shí)編碼微球復(fù)合物在檢測(cè)緩沖液中，每步結(jié)合之后均用微球清洗液洗滌微球，使得沒有結(jié)合的物質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球,包覆不同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn) 生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5.6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后，利用機(jī)器自動(dòng)將反應(yīng)液吸起并通過(guò)一微細(xì)管檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通過(guò)檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中設(shè)有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色，識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目；一道為綠色，激發(fā)報(bào)告分子的顏色，記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定微球的探針吸附在一起時(shí)，兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測(cè)到。再通過(guò)機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本中有無(wú)待測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。本實(shí)用新型一種檢測(cè)血清樣本中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，通過(guò)下面的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說(shuō)明，但本實(shí)用新型不以任何方式受該實(shí)施例的限定。一、材料1.蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液:[0037](I)PBS 緩沖液(pH7.4):NaCl 137mmol/L ；KC1 2.7mmol/L ；Na2HPO41OmmoI/L ；KH2P042mmol/Lo 用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2P04。用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至IL0分裝后在15psi (1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過(guò)濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(pH7.4) ,0.05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2PO4:3g NaH2PO4, 5N NaOH 1.5mL，定容于 250mL，pH
6.2ο(4)微球包被緩沖液 0.05Μ MES，pH 5.0:2.44g MES，5N NaOH0.15mL，定容于250mLo(5)微球保存液PBS-TBN:PBS,0.1%BSA,0.02% TWEEN,0.05%疊氮化物，pH 7.4。(6)微球封閉液 PBS-BN:PBS,1% BSA,0.05%疊氮化物，ρΗ7.4。(7)檢測(cè)緩沖液:PBS，I % BSA, ρΗ7.4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7.4。。(9)微球稀釋液:PBS，I % BSA, ρΗ7.4。(10)樣品稀釋液 PVX:PBS,0.5% PVA,0.8% PVP ；(11) SA-PE 稀釋液:PBS (ρΗ7.4)，I % BSA。2.抗原與抗 體本實(shí)用新型所使用的抗原為西尼羅E蛋白，可購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物流行病研究所。本實(shí)用新型所使用檢測(cè)抗體為兔抗西尼羅IgG，可購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物流行病研究所，檢測(cè)抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，所述的羊抗兔IgG可購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司、SPA可購(gòu)自Sigma公司。二、待測(cè)樣品的制備1、目標(biāo)分析物樣品的制備目標(biāo)分析物為兔抗西尼羅IgG，干擾樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣品是目標(biāo)檢測(cè)物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗登革熱NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，_4°C保存。兔抗西尼羅IgG的儲(chǔ)備液滴度為0.08。比較實(shí)驗(yàn)中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測(cè)。將待分析的兔抗西尼羅IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度樣品，以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè)的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1: 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻后，作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測(cè)。實(shí)施例1、檢測(cè)西尼羅抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實(shí)用新型米用的025號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，編碼微球用于標(biāo)記可以捕獲西尼羅抗體的西尼羅E蛋白抗原，即利用西尼羅E蛋白包被微球。Α、編碼微球的活化[0061]取100μ L(l.25X 106個(gè))編碼微球到1.5mL離心管中，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的EDC(50mg/mL)，再加入10 μ L新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150 μ L的PBS (ρΗ7.4)，震蕩后，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7.4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原西尼羅E蛋白抗原I 50 μ g加入到活化后的編碼微球中，用PBS緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時(shí)。14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L的微球保存液洗滌編碼微球，16000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150 μ L的微球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計(jì)數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(0.10mm；l/400mm2)在普通顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)Xio4X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。2、檢測(cè)物標(biāo)記生物素A、生物素的標(biāo)記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì)算好體積的生物素加入到待標(biāo)記物溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時(shí))，過(guò)柱脫鹽后分裝，-20°C凍存?zhèn)溆?。B、抗體的用量`以標(biāo)記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ I。實(shí)施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分別以1μ g、2y g、4y g>6 μ g>8 μ g>10 μ g>12 μ g>16 μ g>20 μ g、24y g 的量包被100 μ L編碼為025號(hào)的微球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以I 24 μ g/1.25X IO6個(gè)編碼微球或
0.2 96ng/2500 5000個(gè)微球/測(cè)試,包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，包被西尼羅E蛋白抗原的025號(hào)微球均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000)，說(shuō)明優(yōu)化的懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于西尼羅抗體的檢測(cè)。2、生物素化檢測(cè)物的優(yōu)化本實(shí)用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧基活性的生物素,例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，經(jīng)質(zhì)控過(guò)程檢測(cè)效果比較，本實(shí)驗(yàn)中Sulfo-NHS-生物素標(biāo)記檢測(cè)物檢測(cè)效果較好，檢測(cè)效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說(shuō)明書所述的方法。本實(shí)用新型人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1: 500稀釋作為檢測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)兔血清中的西尼羅抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果；2mg/mL生物素化的檢測(cè)物Biotin-SPA以1: 2500稀釋作為檢測(cè)人血清中西尼羅抗體的檢測(cè)物，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化檢測(cè)物Biotin-SPA可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果。實(shí)施例3、懸浮芯片樣品制備、檢測(cè)及結(jié)果判定1、待測(cè)樣品制備用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配置為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定檢測(cè)過(guò)程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過(guò)程如下:I)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化檢測(cè)物，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分 析數(shù)據(jù)。3、檢測(cè)結(jié)果判定根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)用新型定義蛋白質(zhì)懸浮芯片方法檢測(cè)西尼羅抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即Cutoff值為=MFI (空白對(duì)照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢測(cè)結(jié)果高于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為西尼羅抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè)結(jié)果低于LOD對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為西尼羅抗體檢測(cè)結(jié)果陰性。實(shí)施例4、懸浮芯片對(duì)西尼羅蛋白抗原特異性檢測(cè)應(yīng)用懸浮芯片檢測(cè)方法分別對(duì)兔抗西尼羅IgG、鼠抗登革熱IgG、兔抗禽流感H5血清、兔抗土拉FopA多克隆抗體、兔抗登革熱NS3抗體、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例3中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗西尼羅IgG為陽(yáng)性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說(shuō)明本實(shí)用新型所建立的西尼羅抗體的懸浮芯片檢測(cè)方法與其它測(cè)試抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。實(shí)施例5、懸浮芯片定量檢測(cè)模型的建立1、兔抗西尼羅IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗西尼羅IgG標(biāo)準(zhǔn)品由滴度為0.08以4倍倍比梯度稀釋至滴度為3.125X 10_7成系列濃度樣品。2、劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表滴度，Y軸代表懸浮芯片儀檢測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖2中兔抗西尼羅血清的滴度分別為:S1:3.125X10' S2:1.25X10' S3:5Χ1(Γ6，S4:2X 1(T5，S5:8.0XlO-5, S6:3.12X 1θΛ S7:1.25X 1(T3，S8:5X 1(T3，S9:2X 1(T2，SlO:0.08。懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合兔抗西尼羅IgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:[0098]FI = -2.07898+(13723.6+2.07898) / [1+(Conc/0.141595)37795Ja 7153133、懸浮芯片檢測(cè)兔抗西尼羅IgG的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本實(shí)用新型即蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗西尼羅IgG的最低檢測(cè)限即血清滴度為:0.000035。本實(shí)用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗西尼羅IgG濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨之遞增，當(dāng)兔抗西尼羅IgG滴度度超過(guò)0.08時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值開始進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明樣品中的待檢物濃度過(guò)高，需要將樣品稀釋后再檢測(cè)。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本實(shí)用新型即懸浮芯片定量檢測(cè)兔抗西尼羅血清的動(dòng)態(tài)范圍為8.0X 10_5 0.08。實(shí)施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)西尼羅血清的比較
1、生物素-親和素ELISA(BAS-ELISA)檢測(cè)方法作為對(duì)比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟:1)向普通ELISA微孔板每孔加入50 μ L用PBS緩沖液稀釋的西尼羅E蛋白1-50 μ g，4°C靜止過(guò)夜；2)加入封閉液，在37°C封閉2小時(shí)；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測(cè)樣品，每孔50 μ L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測(cè)物，每孔50 μ L，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP (辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素)，50 μ L/孔，室溫放置3分鐘；洗液洗3次,拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50 μ L/孔，室溫放置10分鐘；8)用 2Μ H2SO4 終止反應(yīng)；9)應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)讀A450nm數(shù)值。2、樣品的懸浮芯片檢測(cè)方法采用間接法測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)模式，檢測(cè)過(guò)程中全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行。I)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50 μ L檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽濾3次；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、兩種檢測(cè)方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍及相關(guān)性的比較制備的相同一組兔抗西尼羅血E蛋白血清樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時(shí)應(yīng)用懸浮芯片和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。繪制ELISA方法檢測(cè)兔抗西尼羅血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖中橫坐標(biāo)為樣品滴度，縱坐標(biāo)為吸光度值，坐標(biāo)軸取對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系)，并與懸浮芯片方法結(jié)果進(jìn)行比較。根據(jù)兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線:懸浮芯片方法如，靈敏度為4.9X 10_6(血清滴度)，線性檢測(cè)范圍4.9 X 10_6 2 X 10_2 ；ELISA方法如圖3所示，靈敏度為7.8 X 10_5 (血清滴度)，線性檢測(cè)范圍7.8X10_5 2X10_2?？梢缘贸鼋Y(jié)論:檢測(cè)相同西尼羅兔血清樣品，蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測(cè)靈敏度，即高10倍；并且具有更寬的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，即高I個(gè)數(shù)量級(jí)。另外，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果在10_6 10_2范圍內(nèi)進(jìn)行比較，如圖4所示可以判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.964。實(shí)施例7、人血清樣品的檢測(cè)1、人血清樣品的準(zhǔn)備將人血清用樣品稀釋液1: 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測(cè)。2、人血清樣品的檢測(cè)
·[0130]I)每孔加入50 μ L含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測(cè)人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化SPA，混勻后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待檢測(cè)人血清中西尼羅抗體的濃度。經(jīng)過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)，生物素化SPA稀釋比例選用1: 2500稀釋，SA-PE稀釋比例選用1: 300稀釋，經(jīng)過(guò)對(duì)94份人血清的檢測(cè)，所得的MFI值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和為作為判斷陰陽(yáng)性的界值，即Cutoff值為1103，檢測(cè)得到的MFI值如果大于1103，即血清中的西尼羅濃度過(guò)高，可視為西尼羅抗體陽(yáng)性可能被西尼羅病毒感染，如果MFI值小于1103，即血清中的西尼羅抗體濃度低正常值可判斷為西尼羅抗體陰性，未感染西尼羅病毒或西尼羅病毒隱性攜帶者。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)血清中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，該芯片系統(tǒng)包括:芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，其中，芯片基體用于承載待測(cè)抗體及其內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球，編碼微球?yàn)?25號(hào)編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，反應(yīng)后的溶液吸入到微細(xì)管檢測(cè)通道中，以使得每個(gè)編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述相關(guān)緩沖溶液包括用于所述待測(cè)抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每個(gè)反應(yīng)之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測(cè)緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲抗原為西尼羅E蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述待測(cè)抗體為血清樣品。
5.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA 為 Biotin-羊抗兔和 / 或 Biotin-SPA。
6.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光信號(hào)檢測(cè)物為鏈親和素-藻紅蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述 的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
8.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測(cè)激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識(shí)別編碼微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目的紅色激光，用于激發(fā)并識(shí)別待測(cè)分子的顏色信號(hào)、記錄信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)所述待測(cè)抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種檢測(cè)血清中西尼羅抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測(cè)儀和計(jì)算機(jī)，芯片基體內(nèi)裝有相關(guān)緩沖溶液和待測(cè)抗體，相關(guān)緩沖液中設(shè)置有編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標(biāo)記的二抗和/或SPA、熒光信號(hào)檢測(cè)物，懸浮芯片檢測(cè)儀包括微細(xì)管檢測(cè)通道和檢測(cè)激光，編碼微球依次通過(guò)微細(xì)管檢測(cè)通道，檢測(cè)激光激發(fā)并識(shí)別編碼微球的顏色及其上待測(cè)物的顏色，計(jì)算機(jī)與懸浮芯片檢測(cè)儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測(cè)儀的測(cè)量結(jié)果。懸浮芯片技術(shù)利用微球在溶液中反應(yīng)，利用激光檢測(cè)技術(shù)，提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK203133083SQ201020269890
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者王靜, 楊永莉, 孫肖紅, 楊宇, 胡孔新, 徐寶梁, 張樂 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院