檢測血清樣品中抗藥物抗體的干擾抑制性免疫測定的制作方法
【專利說明】檢測血清樣品中抗藥物抗體的干擾抑制性免疫測定
[0001] 本文中報(bào)道了檢測來自用抗炎癥抗體治療的患者的血清樣品中抗藥物抗體的干 擾抑制性免疫測定及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 新治療性抗體的臨床開發(fā)需要通過適宜的測定評(píng)價(jià)其潛在免疫原性 (Kaliyaperumal,A.和Jing,S.,Curr.Pharm.Biotechnol. 10 (2009) 352-358)??顾幬锟贵w (ADA)檢驗(yàn)通常涉及雙滴度方案:(1)用于ADA檢測的測定和(2)用于表征ADA的測定。ADA 檢測測定包括篩查和特異性驗(yàn)證(驗(yàn)證性)測定。基于微量滴定板的酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)仍然是篩查ADA的最廣泛使用樣式,原因在于其高通量效率、相對簡單和高靈敏度 (Geng,D.等人,J.Pharm.Biomed.Anal. 39 (2005) 364-375)。ADAELISA最經(jīng)常以提供高度 選擇性、檢測全部同種型和泛物種ADA檢測能力的橋樣式設(shè)計(jì)(Mire-Sluis,A.R.等人,J. Immunol.Methods289(2004) 1-16)。
[0004] 已經(jīng)開發(fā)橋接ELSA并且用作抗IL6R抗體托珠單抗(tocilizumab)的篩查和驗(yàn)證 ADA測定(Stubenrauch,K.等人,Clin.Ther. 32 (2010) 1597-1609) 〇
[0005] Stubenrauch,K.等人報(bào)告了用于來自暴露于人抗體的小鼠的血清樣品中藥物 耐受性的一般抗藥物抗體測定(Anal.Biochem. 430 (2012) 193-199)。Bourdage,J.S.等 人報(bào)道雙抗原橋接免疫測定樣式對抗原包被濃度依賴性的影響和設(shè)計(jì)用于單克隆抗體 的免疫原性測定的意義(J.Pharm.Biochem.Anal. 39 (2005)685-690)。Mikulskis,A.等 人報(bào)道了溶液ELISA作為開發(fā)穩(wěn)健、藥物耐受性免疫原性測定支持藥物開發(fā)的選擇平臺(tái) (J.Immunol.Meth. 365 (2010) 38-49)。Pan,J.等人報(bào)道在兩種生物治療藥的免疫原性檢驗(yàn) 中 快速測定與ELISA方法的比較(J.Pharm.Tox.Meth. 63 (2010) 150-159) 〇
[0006] 在TO2009/077127中,報(bào)道了區(qū)分性測定。
[0007] Qiu,Z.J.等人報(bào)道了用于檢測自身免疫血清中人抗治療性抗體的基于生物 素-洋地黃毒甙的新型均相測定(J.Immunol.Meth. 362 (2010) 101-111)。
[0008] 發(fā)明簡沐
[0009] 本文中報(bào)道了橋接酶聯(lián)免疫吸附測定(橋接ELISA),所述測定可以用作為篩查、 驗(yàn)證和跟蹤測定用于檢測以治療性抗體治療的患者的含有血清的樣品中的抗藥物抗體 (ADA)。如果含有血清的樣品來自患有自身免疫疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA))的患者,則 如本文中報(bào)道的測定特別有用。
[0010] 如本文中報(bào)道的測定顯示在待分析樣品中治療性抗體的量方面改進(jìn)的耐受性 (ADAELISA的藥物耐受性增加)并且同時(shí)假陽性測定結(jié)果的數(shù)目減少。
[0011] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)采用如本文中報(bào)道的測定時(shí),由游離藥物和由類風(fēng)濕因子(RF)所致的 干擾可以最小化。
[0012] 如果樣品含有非所討論的抗藥物抗體的、能夠在免疫測定中干擾抗藥物抗體的檢 測并且,因此,將導(dǎo)致假陽性免疫測定結(jié)果的抗體,則這種測定特別有用。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中,如本文中報(bào)道的方法用于測定用于抗炎療法的藥物抗體的抗 藥物抗體。
[0014] 通過以下方面的協(xié)同性相互作用實(shí)現(xiàn)增加的藥物耐受性:1)增加生物素化的和 洋地黃毒甙化的捕獲和示蹤試劑的濃度;2)同時(shí),而不是順序孵育血清樣品與捕獲和示蹤 試劑;3)延長的孵育時(shí)間;4)使用均勻單偶聯(lián)的捕獲和示蹤試劑;和5)使用增加的血清基 質(zhì)含量。
[0015] 可以通過添加寡聚人免疫球蛋白G(IgG)作為添加物,抑制來自類風(fēng)濕因子的干 擾。
[0016] 如本文中報(bào)道的干擾抑制性ADA測定的藥物耐受性高于本領(lǐng)域已知的測定至少 10倍。
[0017] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是包含捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的用于檢測樣品 中針對藥物抗體的抗藥物抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定,其中
[0018] a)捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體以多于0.5μg/ml的濃度使用,
[0019] b)將樣品同時(shí)與捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育4至24小時(shí),
[0020] c)將捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體經(jīng)由單個(gè)賴氨酸殘基衍生,
[0021] d)樣品包含7. 5%或更多的血清,和
[0022] e)用捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育之前,向樣品添加寡聚人IgG。
[0023] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是包含捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的用于檢測類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎患者的樣品中針對藥物抗體的抗藥物抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定,其中
[0024] a)在酶聯(lián)免疫吸附測定中捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體具有0.5μg/ml或更大 的濃度,
[0025] b)將樣品同時(shí)與捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育0. 5至24小時(shí),
[0026] c)捕獲藥物抗體是捕獲藥物抗體和特異性結(jié)合對的第一組分的1:1綴合物并且 示蹤藥物抗體是示蹤藥物抗體和可檢測標(biāo)記物的1:1綴合物,
[0027] d)樣品包含1 %或更多的血清,和
[0028] e)用捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育之前,向樣品添加寡聚人IgG。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施方案中,樣品包含5%或更多的血清。在一個(gè)實(shí)施方案中,樣品包含 7. 5%或更多的血清。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中,樣品包含抗藥物抗體和類風(fēng)濕因子。
[0031] 在一個(gè)實(shí)施方案中,藥物抗體是治療炎性疾病的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中,治療炎 性疾病的抗體是治療自身免疫疾病的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中,自身免疫疾病是類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎或青少年關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎或Castleman病。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中,藥物抗體是治療癌癥的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗體用于治 療骨髓瘤或漿細(xì)胞瘤。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中,藥物抗體是針對IL-6受體的抗體(抗IL6R抗體)、或針對 IGF-1受體的抗體(抗IGF1R抗體)、或針對IL-13受體1α的抗體(抗IL13R1α抗體)、 或針對0x40L的抗體(抗0x40L抗體)、或針對腫瘤壞死因子α的抗體(抗TNFα抗體)。 在一個(gè)實(shí)施方案中,藥物抗體是抗IL6R抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中,抗IL6R抗體是托珠單抗。 [0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體綴合至固相。在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗 體綴合至固相是經(jīng)由特異性結(jié)合對實(shí)施的。在一個(gè)實(shí)施方案中,特異性結(jié)合對(第一組 分/第二組分)選自鏈霉親和素或抗生物素蛋白/生物素、或抗體/抗原(參見,例如, Hermanson,G.T.等人,BioconjugateTechniques,AcademicPress, 1996)、或凝集素 / 多 糖、或類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、或激素/激素受體、或酶/底物、或IgG/蛋白A和/或蛋 白G。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體綴合至生物素(作為特異性結(jié)合對的第一組 分)。在這種情況下,經(jīng)由固定化的抗生物素蛋白或鏈霉親和素實(shí)施綴合至固相。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中,示蹤藥物抗體綴合至可檢測標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中,示蹤 藥物抗體經(jīng)由特異性結(jié)合對綴合至可檢測標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方案中,特異性結(jié)合對(第 一組分/第二組分)選自鏈霉親和素或抗生物素蛋白/生物素、或抗體/抗原(參見,例如, Hermanson,G.T.等人,BioconjugateTechniques,AcademicPress, 1996)、或凝集素 / 多 糖、或類固醇/類固醇結(jié)合蛋白、或激素/激素受體、或酶/底物、或IgG/蛋白A和/或蛋 白G。
[0037] 在一個(gè)實(shí)施方案中,示蹤藥物抗體綴合至洋地黃毒甙(作為可檢測標(biāo)記物)。在這 種情況下,經(jīng)由針對洋地黃毒甙的抗體實(shí)施連接至可檢測標(biāo)記物。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體在酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 中具有約〇. 5μg/ml至約10μg/ml的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體和示蹤藥物 抗體具有多于〇. 5μg/ml至小于10μg/ml的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體和示 蹤藥物抗體具有約1μg/ml至約5μg/ml的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體和示 蹤藥物抗體具有約1. 4μg/ml至約1. 8μg/ml的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中,捕獲藥物抗體 和示蹤藥物抗體具有約1. 45μg/ml至約1. 6μg/ml的濃度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,捕 獲藥物抗體和示蹤藥物抗體具有約1. 5μg/ml的濃度。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間是至少6小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間是至少 12小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間是至少16小時(shí)。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間是最多24小時(shí)。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間在4小時(shí)和24小時(shí)之間。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育 時(shí)間在6小時(shí)和24小時(shí)之間。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間在12小時(shí)和24小時(shí)之間。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,孵育時(shí)間在12小時(shí)和20小時(shí)之間。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間 在14小時(shí)和18小時(shí)之間。在一個(gè)實(shí)施方案中,孵育時(shí)間是約16小時(shí)。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中,樣品包含1%至20%的血清。在一個(gè)實(shí)施方案中,樣品包含約 10 %的血清。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中,將寡聚人IgG添加至終濃度10μg/mL至1000μg/mL。在一個(gè) 實(shí)施方案中,將寡聚人IgG添加至終濃度15μg/mL至500μg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中,將寡 聚人IgG添加至終濃度20μg/mL至250μg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中,將寡聚人IgG添加至 終濃度25μg/mL至100μg/mL。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,將寡聚人IgG添加至終濃度約 50μg/mL〇
[0044] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是包含捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體的用于檢測類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎患者的樣品中針對藥物抗體的抗藥物抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定,其中
[0045] a)在酶聯(lián)免疫吸附測定中捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體具有約1. 5μg/ml的濃 度,
[0046] b)將樣品同時(shí)與捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育14至16小時(shí),
[0047] c)捕獲藥物抗體是經(jīng)由捕獲藥物抗體的賴氨酸殘基的捕獲藥物抗體和生物素的 1:1綴合物并且示蹤藥物抗體是經(jīng)由示蹤藥物抗體的賴氨酸殘基的示蹤藥物抗體和洋地黃 毒甙的1:1綴合物,
[0048] d)樣品包含1 %至20%的血清,并且
[0049] e)用捕獲藥物抗體和示蹤藥物抗體孵育之前,向樣品添加寡聚人IgG至終濃度 25μg/mL至 100μg/mL,
[0050] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是寡聚人IgG在抗藥物抗體ELISA中捕獲類風(fēng)濕因子的 用途。
[0051 ] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是治療患有疾病的個(gè)體的方法,所述方法包括向該個(gè)體 施用有效量的治療性抗體(藥物)并且用如本文中報(bào)道的測定確定抗藥物抗體的存在。
[0052] 如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是治療患有炎性疾病的個(gè)體的方法,所述方法包括向該 個(gè)體施用有效量的抗IL6R抗體(藥物)并且用如本文中報(bào)道的測定確定抗-抗IL6R抗體 的抗體(抗藥物抗體)的存在。
[0053] 在一個(gè)實(shí)施方案中,炎性疾病是自身免疫疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中,自身免疫疾病 選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎或Castleman病。
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