專利名稱：一種新的檢測(cè)血清樣本中禽流感抗體的方法和產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的檢測(cè)血清樣本中禽流感抗體的定量檢測(cè)方法和產(chǎn), 其制備方法。
r及
背景技術(shù)：
禽流感病毒屬甲型流感病毒，甲型流感病毒多發(fā)于禽類， 一般來說，禽流 感病毒與人流感病毒存在受體特異性差異，禽流感病毒是不容易感染給人的。
個(gè)別造成人感染發(fā)病的禽流感病毒可能是發(fā)生了變異的病毒，但1997年香港禽
感病毒，其中6人死亡事件的發(fā)生，打破了人們對(duì)禽流感病毒的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)模式，研 究表明，感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、 H9N2、 H7N7，其中感染H5N1 的患者病情重，病死率高。
原或抗體主要有由雙抗原夾心測(cè)抗體、雙抗體夾心測(cè)抗原、竟?fàn)幏?、間接法等。 間接法測(cè)抗體的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相 應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標(biāo)記抗體與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)
合形成酶標(biāo)記抗體-抗體-固相抗原復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗體含量。
懸浮芯片(suspension array)^稱液相芯片，是20世紀(jì)70年代美國(guó)Luminex 公司研制出的新一代生物芯片技術(shù)，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細(xì)胞 儀作為檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模測(cè)定。目前，該技術(shù)已 廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、抗體篩選及受體與配體的識(shí)別分 析等領(lǐng)域。
目前發(fā)展的懸浮芯片主要是針對(duì)細(xì)胞因子的檢測(cè)。懸浮芯片是否能夠檢測(cè) 人血清中的禽流感抗體，其定量檢測(cè)能力如何，尚缺乏模型和評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種新的檢測(cè)血清中禽流感菌抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包 括編碼微球，作為包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗人IgG作為檢測(cè)抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩沖溶液，所述 編碼微球可選擇任意編號(hào)的編碼微球。
本發(fā)明提供上述檢測(cè)禽流感抗體的蛋白懸浮芯片的制備方法，其特征在于， 在相關(guān)緩沖溶液中，編碼微球用禽流感H5蛋白抗原包被、用生物素標(biāo)記的檢測(cè) 抗體為羊抗兔IgG和羊抗人IgG、用鏈親和素-藻紅蛋白作為信號(hào)檢測(cè)物。
本發(fā)明提供一種禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)方法，該方法采用間 接法檢測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)原理，其特征在于，在檢測(cè)過程中所有反應(yīng)可在96 孔濾板上或在微量離心管中進(jìn)行，其中包括下列步驟(1)每孔或管中加入含 有已包被捕獲抗原，即禽流感H5蛋白抗原的編碼微球的工作溶液，用清洗液清 洗；(2)加入待測(cè)血清樣品，孵育后清洗；(3 )加入用生物素化的檢測(cè)抗體， 孵育后清洗；(4)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加 入檢測(cè)緩沖液后混勻，(6 )用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值(即平均熒光強(qiáng)度) 并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果陰性或陽(yáng)性。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測(cè)方 法，其特征在于，該方法包括下列步驟(1)加入的陽(yáng)性;險(xiǎn)測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng) 4倍梯度倍比系列稀釋，(2)制作樣品濃度對(duì)應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線， (3 )用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程，(4 )可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線判定方 法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)方程計(jì)算出檢測(cè)樣品的濃度。
懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不 同比例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨(dú)特 的色彩編號(hào)，每顆微球大小約5.6pm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受體和配體識(shí)別分析等，并根據(jù)不同研究目的而標(biāo)定特定抗體、核酸 探針及各種受體探針。標(biāo)記探針的微球與待測(cè)物在96孔板中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后， 利用機(jī)器自動(dòng)將反應(yīng)液吸起并通過一微細(xì)管檢測(cè)通道，每次僅允許一個(gè)微球通 過檢測(cè)通道。檢測(cè)通道中設(shè)有兩道激光， 一道為紅色，激發(fā)微球基質(zhì)中的顏色， 識(shí)別微球分類編碼以確定檢測(cè)項(xiàng)目； 一道為綠色，激發(fā)凈艮告分子的顏色，記錄 信號(hào)強(qiáng)弱以檢測(cè)待測(cè)物的含量。當(dāng)待測(cè)樣本與特定微球的探針吸附在一起時(shí)， 兩道激光所激發(fā)的光都可被檢測(cè)到。而若樣本中不含該標(biāo)的物，則僅有微球中 的激發(fā)光可被檢測(cè)到。再通過機(jī)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)統(tǒng)計(jì)分析兩道激光所激發(fā)的微 球種類與數(shù)量，從而判定待測(cè)樣本中有幾種測(cè)試目標(biāo)物在其中，得知測(cè)試樣本 中有無待測(cè)病原存在，或同時(shí)存在有幾種至數(shù)十種病原。懸浮芯片技術(shù)由于利 用微球在溶液中反應(yīng)，克服了片膜芯片在大分子檢測(cè)時(shí)受表面張力、空間效應(yīng)等對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，同時(shí)利用激光檢測(cè)技術(shù)，大大提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確 性和重復(fù)性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。
本發(fā)明人經(jīng)過大量和深入的研究，對(duì)禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備及其
檢測(cè)條件作了實(shí)質(zhì)性的改進(jìn)和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點(diǎn)
1、 抗原包被量的改進(jìn)
禽流感H5蛋白的包被量是成功檢測(cè)的關(guān)鍵，本發(fā)明對(duì)包被微球的抗原包被 量進(jìn)行實(shí)質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測(cè)效果非常良好，并且包被懸浮芯片所需的 抗原包被量很低，本發(fā)明的抗原包被量為3-9ng/1.25xl(f個(gè)微球，即 6-24ng/2500-5000個(gè)微球/測(cè)試， 一般的ELISA方法抗原包被量為5pg/測(cè)試。
2、 生物素標(biāo)記的改進(jìn)
通常，標(biāo)記抗體需要使用過量的生物素。理i侖上講，在檢測(cè)過程中，過量 的生物素因未標(biāo)記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原連接，清洗時(shí)被抽 濾掉，不會(huì)與隨后加入的SA-PE反應(yīng)，不影響檢測(cè)。但在實(shí)際檢測(cè)過程中，偶 爾遇到過檢測(cè)信號(hào)可能過高的現(xiàn)象，出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此建議生物素標(biāo)記抗體后， 盡量去除多余的生物素。以標(biāo)記2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶液為 例，需加入10 mM生物素溶液約27 nL。
3 、 檢測(cè)的靈敏度及動(dòng)態(tài)范圍
本發(fā)明的血清樣品禽流感抗體的定量檢測(cè)方法和芯片與經(jīng)典的免疫學(xué) ELISA檢測(cè)方法相比，結(jié)果有著很好的吻合性(相關(guān)系數(shù)R、0.9863)。同時(shí)， 懸浮芯片方法靈敏度為檢測(cè)滴度4.767 x l(T6，高于ELISA方法的檢測(cè)滴度l(T5， 靈每文度提高IO倍以上；并且懸浮芯片方法動(dòng)態(tài);險(xiǎn)測(cè)范圍為2 x io-7~2 x i(r2，高 于ELISA方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍l(T5 ~10-2達(dá)1個(gè)數(shù)量級(jí)。
4、 方法的特異性
本發(fā)明通過選用禽流感H5蛋白為包被抗原，以兔抗禽流感H5N1抗體為待 測(cè)抗體，以生物素化的羊抗兔為4企測(cè)抗體。^研究試騶4正明，在存在鼠抗流感 NPIgG、兔抗結(jié)核血清、兔抗鼠疫菌F1抗原多克隆抗體、兔抗SARSIgG干擾 抗體存在條件下本方法具有良好的特異性。
5、 樣品的檢測(cè)能力
本發(fā)明評(píng)價(jià)了懸浮芯片方法對(duì)人血清的檢測(cè)能力。通過對(duì)人血清的檢測(cè)， 初步證實(shí)了該方法在4全測(cè)人血清中禽流感抗體的實(shí)用性。


圖1: 032號(hào)孩i球包被禽流感H5蛋白檢測(cè)禽流感抗體示意圖2:蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)兔抗禽流感H5N1抗體的劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖3: ELISA方法4企測(cè)兔抗禽流感H5N1血清標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4:蛋白質(zhì)懸浮芯片與ELISA方法才企測(cè)兔抗禽流感H5N1血清的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及的檢測(cè)禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備方法、檢測(cè)及定量方法 通過下面的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步i兌明，^f旦本發(fā)明不以任何方式受該實(shí)施例的 限定。
一、材料
1. 蛋白懸浮芯片的相關(guān)緩沖液
(1 ) PBS纟爰沖'液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7mmol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4。用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝后 在15psi (1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存于室溫。
(2)微球清洗液PBS (pH7.4) ， 0.05% TWEEN國(guó)20。
(3 )孩t球活化緩沖液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04, 5N NaOH 1.5 mL, 定容于250mL, pH6.2。
(4 )微球包被緩沖液0.05 M MES， pH 5.0: 2.44 g MES， 5N NaOH 0.15 mL， 定容于250mL。
(5 )微球保存液PBS-TBN: PBS， 0.1%BSA， 0.02% TWEEN， 0.05%疊氮 化物，pH7.4。
(6) 孩t球封閉液PBS-BN: PBS， 1%BSA, 0.05%疊氮化物，pH7.4。
(7) 檢觀'J緩沖液PBS, 1%BSA, pH7.4。 (8 )抗體稀釋液PBS, pH7.4。
(9) 微球稀釋液PBS， 1%BSA, pH7.4。
(10) 樣品稀釋液PVX: PBS， 0.5%PVA, 0.8%PVP;
(11 )生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS， 0.1%BSA, 0.02% TWEEN-20, 0.05%NaN3， pH7.4)。
(12) SA-PE稀釋液:PBS (pH7.4) ， 1%BSA。
2. 抗原與抗體本發(fā)明所使用抗原重組禽流感病毒H5蛋白作為檢測(cè)抗原。 本發(fā)明所使用待測(cè)抗體為兔抗禽流感H5N1血清，4企測(cè)抗體可為生物素化 羊抗兔IgG和生物素化羊抗人IgG。 二、待測(cè)樣品的制備
1、 目標(biāo)分析物樣品的制備
目標(biāo)分析物為兔抗禽流感H5N1 IgG，干護(hù)L樣品或作為方法特異性測(cè)試的樣 品是目標(biāo)檢測(cè)物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括兔抗結(jié)核血清、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將 上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液中，fC保存。兔抗禽流感H5N1 IgG的儲(chǔ)備 液濃度為0.2mg/mL 。比較實(shí)驗(yàn)中，相同樣品用于ELISA和懸浮芯片的檢測(cè)。
將待分析的兔抗禽流感H5N1 IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同 濃度樣品，以繪制樣品檢測(cè)劑量-反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中幾個(gè)樣品濃度低于檢測(cè) 的敏感度，高濃度樣品應(yīng)使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)。
2、 人血清樣本的處理
將人血清樣本用樣品稀釋1: 10稀釋，例如人血清樣本5jiL加樣品稀釋液 50pL混勻后，作為待檢樣品進(jìn)行懸浮芯片方法的檢測(cè)。
實(shí)施例l、檢測(cè)禽流感抗體的蛋白質(zhì)懸浮芯片的制備 1、捕獲抗原包被編碼微球
本發(fā)明采用的032號(hào)編碼微球購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，編碼微球用于標(biāo)記 可以捕獲禽流感抗體的禽流感H5蛋白抗原，即利用禽流感H5蛋白包被微球。
A、 編碼微球的活化
取100|iL ( 1.25xl()6個(gè))編碼微球到1.5mL離心管中，14000 x g離心，小 心吸出并棄去上清液。加入100pL的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000 xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100jxL的微球活化緩沖液，接著先加入 lO[iL新鮮配置的EDC ( 50mg/mL)，再加入10pL新鮮配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150|iL的 PBS (pH7.4),震蕩后，14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入100pL 的PBS (pH7.4)懸浮編碼微球。
B、 用抗原包凈皮編碼孩O求
取捕獲抗原禽流感H5蛋白抗原4-50嗎加入到活化后的編碼微球中，用PBS 緩沖液定容至500(aL,室溫震搖2小時(shí)。14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。用500pL的PBS緩沖液洗一次，14000xg離心，小心吸出并棄去上清液。 加入250|iL的封閉緩沖液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 x g離心， 小心吸出并棄去上清液。加入500pL的微球保存液洗滌編碼孩i球，16000 x g離 心，小心吸出并棄去上清液。最后用150pL的微球保存液懸浮編碼微球，于4。C 避光保存?zhèn)溆谩?br> C、包被微球的計(jì)數(shù)
吸取適量微球，稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板(0.10mm; 1/400mm、在普通顯微鏡 下計(jì)數(shù)。根據(jù)公式(每個(gè)大格數(shù)xlO、稀釋倍數(shù)x體積(mL))計(jì)算微球數(shù)量。 2、檢測(cè)抗體標(biāo)記生物素
A、 生物素的標(biāo)記
分別配制好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標(biāo)記抗體溶液，將計(jì) 算好體積的生物素加入到待標(biāo)記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小 時(shí))，過柱脫鹽后分裝，-20°。凍存?zhèn)溆谩?br> B、 抗體的用量
以標(biāo)記2 mg/mL的IgG (分子量150，000) 1 mL溶液為例，需加入IO mM生物 素溶液約27 |il。
實(shí)施例2、懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化
1、 微球包被抗原包被量的選擇
分另'J以lpg、 3fig、 6jag、 9pg、 12pg、 15pg、 20|ig的量包4皮lOO(iL編石馬為 027號(hào)的孩i球。經(jīng)檢測(cè)效果比較，以6jag/1.25xl06個(gè)微球即12-24ng/2500~5000 個(gè)微球/測(cè)試包被效果最好，顯微鏡下計(jì)數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖l所示， 包被禽流感H5蛋白抗原的032號(hào)微球均落在其正確檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信 噪比結(jié)果(MFI值遠(yuǎn)大于2000),說明優(yōu)化的懸浮芯片檢測(cè)系統(tǒng)可成功用于禽 流感纟元體的檢測(cè)。
2、 生物素化抗體的優(yōu)化
本發(fā)明分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰肼(hydrazide)-生物素和羧 基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體， 經(jīng)質(zhì)控過程檢測(cè)效果比較，本實(shí)驗(yàn)中羧基活性的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體檢測(cè)效果 較好，檢測(cè)效果的方法采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說明書所述 的方法。本發(fā)明人經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2mg/mL生物素化的羊抗兔抗體以1: 250稀 釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)兔血清中禽流感抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物素化4企測(cè)抗 體Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果；2mg/mL生物素化的 抗體羊抗人以l: 2500稀釋作為檢測(cè)人血清中禽流感抗體，檢測(cè)結(jié)果顯示生物 素化檢測(cè)抗體Bio-羊抗人抗體可獲得高檢測(cè)值和低背景值的檢測(cè)效果。
實(shí)施例3、樣品的制備、檢測(cè)及結(jié)果判定
1、 待測(cè)樣品制備
用樣品稀釋液將待測(cè)樣本配置為不同濃度樣本進(jìn)行蛋白懸浮芯片檢測(cè)。
2、 樣品的檢測(cè)及結(jié)果判定
檢測(cè)過程全部反應(yīng)均在96孔濾板上進(jìn)行，檢測(cè)過程如下
1) 每孔加入50|iL含相應(yīng)編碼孩t球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50 檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽
濾；
3) 加入50 ]iL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4) 加入50jiL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 加入125(xL的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。
3、 檢測(cè)結(jié)果判定
根據(jù)試驗(yàn)研究結(jié)果與相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明定義蛋白懸浮芯片方法檢測(cè)禽 流感抗體的最低檢出限(LOD值)為檢測(cè)熒光強(qiáng)度臨界值(Cutoff)對(duì)應(yīng)的檢測(cè) 物濃度。其中，Cutoff的定義是采用空白對(duì)照樣品(Blank)熒光檢測(cè)信號(hào)MFI 均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD )，即Cutoff值為=MFI(空白對(duì)照)+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。若檢 測(cè)結(jié)果高于Cutoff對(duì)應(yīng)焚光強(qiáng)度值則判定為禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；若檢測(cè) 結(jié)果低于Cutoff對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度值則判定為禽流感抗體檢測(cè)結(jié)果陰性。
實(shí)施例4、懸浮芯片對(duì)禽流感H5蛋白抗原的特異性試驗(yàn)
應(yīng)用懸浮芯片^r測(cè)方法分別對(duì)兔抗結(jié)核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)實(shí)施例3中檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，僅兔抗禽流感H5NlIgG為陽(yáng)性，其 余干擾抗體或蛋白均為陰性。說明本發(fā)明所建立的禽流感抗體的懸浮芯片檢測(cè) 方法與其它測(cè)試抗體均不發(fā)生交叉反應(yīng)或非特異反應(yīng)。
實(shí)施例5、對(duì)血清樣品中禽流感抗體的懸浮芯片定量檢測(cè)
1 、兔抗禽流感H5NlIgG標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備
用樣品稀釋液將兔抗禽流感H5N1 IgG標(biāo)準(zhǔn)品由20(ig/mL以4倍倍比梯度 稀釋至191pg/mL成系列濃度樣品。
2 、劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
按照實(shí)施例3中的檢測(cè)方法檢測(cè)上述系列濃度樣品，并根據(jù)懸浮芯片系統(tǒng) 檢測(cè)結(jié)果繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體的濃度 (ng/mL) , Y軸代表懸浮芯片儀檢測(cè)的熒光值(MFI)。每個(gè)數(shù)據(jù)代表3次的 檢測(cè)結(jié)果平均值，坐標(biāo)軸以對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系設(shè)定，圖2中鼠抗禽流感H5N1血清的 濃度(ng/mL)分別為Sl: 0.191， S2: 0.763， S3: 3,052， S4: 12.207， S5: 48.828， S6: 195.312， S7: 781.25， S8: 3125.0， S9: 12500.0 ， S10: 50000.0。
懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果擬合兔抗禽流感H5NlIgG劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程為
FI = -1.31918 + (13360.5 + 1.31918) / [1 + (Cone / 3.93 3 28)-0 957367]0 953689
3、本發(fā)明懸浮芯片法檢測(cè)血清中兔抗禽流感H5NlIgG的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍
根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本發(fā)明即蛋白質(zhì)懸浮芯片 方法;險(xiǎn)測(cè)兔抗禽流感H5NlIgG的靈每文度為0.0015ng/mL ( Cutoff =8.6213 ， MFI (空白對(duì)照)=6.5,標(biāo)準(zhǔn)差=0.7071 )。
本發(fā)明定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)的檢測(cè)物濃 度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線隨著兔抗禽流感H5NlIgG濃度的升高，其對(duì)應(yīng)的MFI值也隨 之遞增，當(dāng)兔抗禽流感H5NlIgG濃度達(dá)到0.05mg/mL時(shí)，抗原抗體的免疫反應(yīng) 即將達(dá)到飽和狀態(tài)，MFI值也將進(jìn)入平臺(tái)期，說明樣品中的待檢物濃度還可以 更高，需要將高濃度樣品再檢測(cè)。
因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即懸浮芯片定量檢測(cè) 兔抗禽流感H5N1 IgG的動(dòng)態(tài)范圍為48.828 ~ 50000ng/mL。
實(shí)施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測(cè)禽流感抗體的比較1、 生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測(cè)方法
作為對(duì)比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟
1) 向普通ELISA微孔板每孔加入50(iL用PBS緩沖液稀釋的禽流感H5蛋 白5-50ng， 4。C靜止過夜；
2) 加入封閉液，在37。C封閉2小時(shí)；
3) 洗液洗3次，拍干；
4) 加入檢測(cè)樣品，每孔50jxL，室溫;改置40分鐘；洗液洗3次，拍干；
5) 加入適量生物素化檢測(cè)抗體，每孔50jaL,室溫力t置30分鐘；洗液洗3次， 拍干；
6) 加入適量SA/HRP (辣根酶標(biāo)記鏈霉親和素)，50nL/孔，室溫放置3分 鐘；洗液洗3次，拍干；
7) 加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50pL/孔，室溫 放置IO分鐘；
8) 用2M H2S04終止反應(yīng)；
9) 應(yīng)用酶標(biāo)4義測(cè)讀A450nm數(shù)值。
2、 樣品的懸浮芯片檢測(cè)方法
采用間接法測(cè)抗體的免疫學(xué)檢測(cè)模式，檢測(cè)過程中全部反應(yīng)均在96孔濾板 上進(jìn)行。
1) 每孔加入50pL含相應(yīng)編碼孩i球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵才由濾2
次；
2) 加入50 檢測(cè)樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽 濾3次；
3) 加入50 適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵才由濾3次；
4) 加入50|iL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。用清洗液洗滌并真 空泵抽濾3次；
5) 加入125pL的檢測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；
6) 用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。
3、 兩種檢測(cè)方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍及相關(guān)性的比較
制備的相同一組兔抗禽流感H5N1血清樣品用樣品稀釋液IO倍比稀釋同時(shí) 應(yīng)用懸浮芯片和ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。繪制ELISA方法檢測(cè)兔抗禽流感H5N1血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖中橫坐標(biāo)為樣品濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，坐標(biāo)軸取對(duì)數(shù)-對(duì)數(shù)關(guān)系)，并與懸浮芯片方法結(jié)果進(jìn)行比較。
根據(jù)兩種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線懸浮芯片方法如圖2所示的靈敏度為4.767xl(T6 (血清滴度)，線性檢測(cè)范圍2xl(T7 2xl{r2; ELISA方法如圖3所示的靈壽丈度 為10-5 (血清滴度)，線性檢測(cè)范圍l(T5~10-2。可以得出結(jié)論檢測(cè)相同兔抗禽 流感H5N1血清樣品，蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測(cè)靈敏度， 即高10倍；并且具有更寬的動(dòng)態(tài);險(xiǎn)測(cè)范圍，即高2個(gè)數(shù)量級(jí)。
另外，如圖4所示，將兩種方法檢測(cè)結(jié)果在10-5~10-2范圍內(nèi)進(jìn)行比較可以 判定蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9863。
實(shí)施例7、 Ajfc清樣品的檢測(cè)
1、 人血清樣品的準(zhǔn)備
將人血清樣品用樣品稀釋液1: 10稀#(人血清樣本5|iiL加樣品稀釋液50|uL 混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測(cè)。
2、 人血清樣品的4企測(cè)
l傳孔加入50pL含相應(yīng)編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽
濾；
2) 加入50 待檢測(cè)人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液 洗滌并4由濾；
3) 加入50 pL適當(dāng)濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻 后室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；
4) 加入50pL的SA-PE，混勻后室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌并真空泵 抽濾；
5) 力口入125pL的^r測(cè)緩沖液，經(jīng)蝸S走重懸混勻；
6) 用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定待^r測(cè)人血清中禽 流感抗體的濃度。
經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)，生物素化羊抗人IgG稀釋比例優(yōu)選用1: 2500稀釋， SA-PE稀釋比例優(yōu)選用1: 300稀釋，通過對(duì)94份人血清的檢測(cè)，所得的MFI 值的均值與其標(biāo)準(zhǔn)差的3倍之和為作為判斷陰陽(yáng)性的界值，即C utoff值為2286, 換算為濃度值是0.68ng/mL，檢測(cè)得到的MFI值如果大于2286,即血清中的禽 流感抗體濃度超過0.68ng/mL可一見為禽流感抗體陽(yáng)性可能^皮禽流感病毒感染，如果MFI值小于2286,即血清中的禽流感抗體濃度低于0.68ng/mL可判斷為禽流 感抗體陰性，未感染禽流感病毒。
權(quán)利要求
1、一種采用蛋白懸浮芯片檢測(cè)血清樣品中禽流感抗體的間接免疫學(xué)定量檢測(cè)方法，其特征在于，檢測(cè)過程中全部反應(yīng)可在96孔濾板或者微量離心管中進(jìn)行，該方法包括下列步驟(1)包被微球的捕獲抗原為禽流感H5蛋白抗原，(2)向孔入加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測(cè)血清樣品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的檢測(cè)抗體，孵育后清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育后清洗；(6)加入檢測(cè)緩沖液后混勻；(7)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取平均熒光強(qiáng)度(MFI)數(shù)值并分析數(shù)據(jù)判定檢測(cè)結(jié)果。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用生物素標(biāo)記的羊抗人IgG 作為檢測(cè)抗體，并且其與抗原禽流感H5蛋白組合組成間接法檢測(cè)體系。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的包被孩i球的捕獲抗原 禽流感H5蛋白抗原用量為3-9pg /1.25x106個(gè)編碼《效球或 6 24ng/2500"5000個(gè)微球/測(cè)試。
4、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法中的標(biāo)記沖企測(cè)抗體 羊抗人IgG的生物素為羧基活性的生物素。
5、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的檢測(cè)抗 體Bio-羊抗人IgG以1: 2500稀釋作為檢測(cè)抗體進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)。
6、 一種定量檢測(cè)血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片方法，其特征在 于，該方法包括下列步驟(1 )加入的陽(yáng)性檢測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋 為4倍；(2 )將系列稀釋樣品在懸浮芯片系統(tǒng)中沖全測(cè)讀取對(duì)應(yīng)熒光值(MFI); (3 )制作樣品濃度對(duì)應(yīng)MFI值的劑量-反應(yīng)曲線； (4)用分析軟件擬合劑量-反應(yīng)曲線和方程；(5 )未知濃度樣品可根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線和方程判斷未知樣本中禽流感抗 體的濃度其特征在于，加入的陽(yáng)性;險(xiǎn)測(cè)樣品為兔抗禽流感H5N1 IgG。
7、 一種檢測(cè)血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片，該芯片包括編碼 微球，作為包被微球抗原是禽流感H5蛋白抗原，生物素標(biāo)記的羊抗人IgG 作為檢測(cè)抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩沖溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的檢測(cè)血清樣本中禽流感抗體的定量檢測(cè)方法和產(chǎn)品及其制備方法。本發(fā)明的方法檢測(cè)能力好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、動(dòng)態(tài)范圍寬，并建立了以禽流感抗體為代表的病毒抗體蛋白質(zhì)懸浮芯片檢測(cè)的開放性檢測(cè)模式化平臺(tái)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101533023SQ20091008300
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者孫肖紅, 宇 楊, 楊永莉, 靜 王, 胡孔新 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院