專利名稱：一種檢測血清樣本中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測血清樣本中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)。
背景技術：
禽流感病毒屬甲型流感病毒，甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一般來說，禽流感病毒與 人流感病毒存在受體特異性差異，禽流感病毒是不容易感染給人的。個別造成人感染發(fā)病 的禽流感病毒可能是發(fā)生了變異的病毒，但1997年香港禽流感病毒首次突破種間障礙直 接感染人共有18位香港居民感染了 H5W亞型流感病毒，其中6人死亡事件的發(fā)生，打破 了人們對禽流感病毒的傳統(tǒng)認識模式，研究表明，感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、 H9N2、H7N7，其中感染H5W的患者病情重，病死率高。免疫學方法酶聯(lián)免疫實驗(ELISA)中利用抗原與抗體特異性反應來檢測抗原或 抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、競爭法、間接法等。間接法測抗體 的原理是特異性抗原結(jié)合到固相載體上，然后和待檢血清中的相應抗體結(jié)合形成免疫復合 物，洗滌后再加酶標記抗體與免疫復合物中的抗體結(jié)合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原 復合物，加底物顯色，判斷抗體含量。懸浮芯片(suspension array)也稱液相芯片，是20世紀70年代美國Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞儀作為檢測平 臺，對核酸、蛋白質(zhì)等生物分子進行大規(guī)模測定。目前，該技術已廣泛應用于免疫分析、核酸 研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分析等領域。目前發(fā)展的懸浮芯片主要是基于實驗室檢測方法的建立和方法評價及優(yōu)化，以縮 短檢測時間，降低方法的檢測成本。但是懸浮芯片是否能夠檢測人血清中的禽流感抗體，其 定量檢測能力如何，尚缺乏模型和評價。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種檢測血清中禽流感病毒抗體的蛋白懸浮芯片系 統(tǒng)，該芯片系統(tǒng)包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內(nèi)裝 有相關緩沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有032號編碼微球，編碼微球上包被有捕 獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標記的二抗和/或SPA、熒光信號檢測物， 懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，反應后的溶液吸入到微細管檢測通道 中，以使得每個編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色 及其上待測物的熒光信號，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的 測量結(jié)果。進一步，所述相關緩沖溶液包括用于所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述 編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素標記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每 個反應之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。進一步，所述捕獲抗原優(yōu)選為禽流感H5蛋白。[0009]進一步，所述待測抗體為血清樣品。進一步，所述生物素標記的二抗和/或SPA優(yōu)選為Biotin-羊抗兔IgG和/或 Biotin-SPA。 進一步，所述熒光信號檢測物為鏈親和素-藻紅蛋白。進一步，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。進一步，所述檢測激光包括用激發(fā)所述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分 類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發(fā)并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱 以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。經(jīng)過大量和深入的研究，對禽流感抗體的蛋白懸浮芯片制備及其檢測條件作了實 質(zhì)性的改進和創(chuàng)新，其具有下列優(yōu)點1、抗原包被量的改進禽流感H5蛋白的包被量是成功檢測的關鍵，本實用新型對包被微球的抗原包被 量進行實質(zhì)性優(yōu)化使血清樣本的檢測效果非常良好，并且包被蛋白懸浮芯片所需的抗原包 被量很低，本實用新型的禽流感H5蛋白抗原包被量為0. 1 100μ g/1. 25X106個編碼微 球或0. 02 400ng/2500 5000個微球/測試，而一般的ELISA試驗所需抗原的包被量為 Iyg/測試。2、生物素標記的改進通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量的生物素 因未標記上抗體而不被微球上結(jié)合捕獲抗體的抗原聯(lián)接，清洗時被抽濾掉，不會與隨后加 入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶爾遇到過檢測信號可能過高的現(xiàn) 象，因此建議生物素標記抗體后，盡量去除多余的生物素。以標記ang/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約27 μ L。3、檢測的靈敏度及動態(tài)范圍本實用新型的血清樣品禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測方法與經(jīng)典的免疫 學ELISA檢測方法相比，結(jié)果有著很好的吻合性(相關系數(shù)R2 = 0.9863)。同時，懸浮芯片 方法靈敏度為檢測滴度4. 767 X 10-6，高于ELISA方法的檢測滴度10_5，靈敏度提高10倍 以上；并且懸浮芯片方法動態(tài)檢測范圍為2X 10-7 2Χ 10-2，高于ELISA方法動態(tài)檢測范 圍10-5 10-2達1個數(shù)量級。4、方法的特異性本實用新型通過選用禽流感Η5蛋白為包被抗原，以兔抗禽流感H5W抗體為待測 抗體，以生物素化-羊抗兔IgG為檢測物。本研究試驗證明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗 結(jié)核血清、兔抗鼠疫菌Fl抗原多克隆抗體、兔抗SARS IgG等干擾抗體存在條件下本方法具 有良好的特異性。5、樣品的檢測能力本實用新型評價了蛋白懸浮芯片方法對人血清的檢測能力。通過人血清的檢測， 初步證實了該方法在檢測人血清中禽流感抗體的實用性。

圖1為本實用新型結(jié)構(gòu)示意圖；[0026]圖2為032號微球包被禽流感H5蛋白檢測兔抗禽流感H5W血清示意圖；圖3為蛋白懸浮芯片方法檢測兔抗禽流感H5W血清劑量-反應標準曲線。圖4 =ELISA方法檢測兔抗禽流感H5W血清標準曲線圖；圖5 蛋白懸浮芯片與ELISA方法檢測兔抗禽流感H5W血清的相關性。
具體實施方式
如圖1至圖5所示，本實用新型一種檢測血清樣本中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片 系統(tǒng)，包括芯片基體1、加液系統(tǒng)2、懸浮芯片檢測儀3和計算機4，其中，芯片基體1為96孔 濾板或者微量離心管，其內(nèi)裝有相關緩沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有編碼微球 (圖中未示)，編碼微球上包被有禽流感H5蛋白，用于捕獲待檢測血清樣品中的待測抗體， 如果樣品中有禽流感抗體，禽流感抗體與編碼微球上的禽流感蛋白結(jié)合，再加入帶有生物 素標記的二抗和/或SPA,形成編碼微球-禽流感H5蛋白-禽流感抗體-二抗/SPA-生物 素復合物，最后加入鏈親和素-藻紅蛋白，鏈親和素與生物素結(jié)合，形成編碼微球-禽流感 H5蛋白-禽流感抗體-二抗/SPA-生物素-鏈親和素-藻紅蛋白復合物，通過懸浮芯片檢 測儀對藻紅蛋白熒光信號的檢測來達到對血清樣品中禽流感抗體的檢測，如果血清樣品中 沒有禽流感抗體，包被有禽流感H5蛋白的編碼微球不會與后面加入的生物素標記的二抗 和/或SPA、鏈親和素-藻紅蛋白結(jié)合，最后通過懸浮芯片檢測儀器進行檢測時無熒光信號 或應該信號非常弱。上述芯片系統(tǒng)中，編碼微球在微球稀釋液，待測抗體在樣品稀釋液中，生物素標記 的二抗和/或SPA在抗體稀釋液中，熒光信號檢測物在SA-PE稀釋液中，懸浮芯片檢測儀檢 測時編碼微球復合物在檢測緩沖液中，每步結(jié)合之后均用清洗液洗滌微球，使得沒有結(jié)合 的物質(zhì)清除體系。懸浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的紅光及紅外光發(fā)色劑，而產(chǎn)生100種不同比例顏色，作為100種獨特的色彩編號，每顆 微球大小約5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受體和配體識別分 析等，并根據(jù)不同研究目的而標定特定抗體、核酸探針及各種受體探針。標記探針的微球與 待測物在96孔板中進行反應。反應后，利用機器自動將反應液吸起并通過一微細管檢測通 道，每次僅允許一個微球通過檢測通道。檢測通道中設有兩道激光，一道為紅色，激發(fā)微球 基質(zhì)中的顏色，識別微球分類編碼以確定檢測項目；一道為綠色，激發(fā)報告分子的顏色，記 錄信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時，兩道激光 所激發(fā)的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有微球中的激發(fā)光可被檢測到。 再通過機器與計算機自動統(tǒng)計分析兩道激光所激發(fā)的微球種類與數(shù)量，從而判定待測樣本 中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數(shù) 十種病原。懸浮芯片技術由于利用微球在溶液中反應，克服了片膜芯片在大分子檢測時受 表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用激光檢測技術，大大提高了樣品檢測 的準確性和重復性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。本實用新型一種檢測血清樣本中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，通過下面的具 體實施方式作進一步說明，但本實用新型不以任何方式受該實施例的限定。一、材料[0035]1.蛋白懸浮芯片的相關緩沖液(I)PBS 緩沖液(pH7. 4) :NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HP04 10mmol/L ； KH2P04 2mmol/L。用 800mL 蒸餾水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl，1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04。 用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，加水至1L。分裝后在15psi (1. 05kg/cm2)高壓蒸汽20分 鐘，或過濾除菌，保存于室溫。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化緩沖液 IOOmM NaH2P04 :3g NaH2P04,5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被緩沖液 0· 05M MES，pH 5. 0 2. 44g MES，5N NaOHO. 15mL，定容于 250mLo(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%疊氮化物，pH 7. 4。(6)微球封閉液 PBS-BN :PBS, 1% BSA,0. 05%疊氮化物，ρΗ7· 4。(7)檢測緩沖液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。(8)抗體稀釋液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀釋液PBS，1 % BSA, ρΗ7· 4。(10)樣品稀釋液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(Il)SA-PE 稀釋液PBS(pH7. 4),1% BSA。2.抗原與抗體本實用新型所使用抗原重組禽流感病毒H5蛋白，其可購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。本實用新型所使用待測抗體為兔抗禽流感H5W血清，其可購自中國疾病預防控 制中心病毒病預防控制研究所，檢測抗體為生物素化羊抗兔IgG和生物素化SPA，羊抗兔 IgG和SPA，其可購自北京欣經(jīng)科生物有限公司。二、待測樣品的制備1、目標分析物樣品的制備目標分析物為兔抗禽流感H5W IgG,干擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是目 標檢測物外的其它抗體或其它蛋白質(zhì)，包括兔抗結(jié)核血清、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W 血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。將上述待分析樣品均溶于樣品稀釋液液中， 4°C保存。抗禽流感H5m IgG的儲備液濃度為0. ang/mL。比較實驗中，相同樣品用于ELISA 和蛋白懸浮芯片的檢測。將待分析的兔抗禽流感H5W IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度 樣品，以繪制樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低于檢測的敏感度，高濃 度樣品應使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)。2、人血清樣本的處理將人血清樣本用樣品稀釋1 10稀釋，例如人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻后，作為待檢樣品進行蛋白懸浮芯片方法的檢測。實施例1、檢測禽流感抗體的蛋白懸浮芯片的制備1、捕獲抗原包被編碼微球本實用新型采用的032號編碼微球購自美國Bio-Rad公司，編碼微球用于標記可 以捕獲禽流感抗體的禽流感Η5蛋白抗原，即利用禽流感Η5蛋白包被微球。[0059]A、編碼微球的活化取100 μ L (1. 25X106個)032編碼微球到1. 5mL離心管中，14000 Xg離心，小心 吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球清洗緩沖液懸浮，震蕩并超聲后14000Xg離心， 小心吸出并棄去上清液。加入100 μ L的微球活化緩沖液，接著先加入10 μ L新鮮配置的 EDC (50mg/mL)，再加入IOyL新鮮配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震蕩30秒后用鋁箔包 裹，在室溫震搖20分鐘。加入150μ L的PBS(pH7. 4)，震蕩后，14000Xg離心，小心吸出并 棄去上清液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)懸浮編碼微球。B、用抗原包被編碼微球取捕獲抗原禽流感Η5蛋白抗原1 50 μ g加入到活化后的032編碼微球中，用PBS 緩沖液定容至500 μ L，室溫震搖2小時。14000 X g離心，小心吸出并棄去上清液。用500 μ L 的PBS緩沖液洗一次，14000 Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入250 μ L的封閉緩沖液 懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗滌編碼微球，16000Xg離心，小心吸出并棄去上清液。最后用150yL的微 球保存液懸浮編碼微球，于4°C避光保存?zhèn)溆?。C、包被微球的計數(shù)吸取適量微球，稀釋后，用血球計數(shù)板(0. IOmm ；l/400mm2)在普通顯微鏡下計數(shù)。 根據(jù)公式(每個大格數(shù)X104X稀釋倍數(shù)X體積(mL))計算微球數(shù)量。2、檢測抗體標記生物素A、生物素的標記分別配制好濃度為IOmM生物素溶液和^iig/mL的待標記抗體溶液，將計算好體積 的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小時)，過柱脫鹽后分 裝，-20°C凍存?zhèn)溆?。B、抗體的用量以標記2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液為例，需加入IOmM生物素溶液約 27 μ 1。實施例2、蛋白懸浮芯片制備法條件的優(yōu)化1、微球包被抗原包被量的選擇分另Ij以 1μ g、5y g、10y g、15y g、20y g、25y g、30y g、35y g、40y g、45y g、 50 μ g、100 μ g的量包被100 μ L編碼為032號的微球。經(jīng)檢測效果比較，以1 50 μ g/1. 25 X 106個編碼微球即0. 2 200ng/2500 5000個微球/包被效果最好，顯微鏡 下計數(shù)后避光冷藏保存待用。如圖1所示，包被禽流感H5蛋白抗原的032號微球均落在其 正確檢測區(qū)域內(nèi)，并且獲得高信噪比結(jié)果(MFI值遠大于2000)，說明優(yōu)化的蛋白懸浮芯片 檢測系統(tǒng)可成功用于禽流感抗體的檢測。2、生物素化抗體的優(yōu)化本實用新型分別用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基 活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體，經(jīng)質(zhì)控過程檢 測效果比較，本實驗中Sulfo-NHS-生物素標記檢測抗體檢測效果較好，檢測效果的方法采 用本領域的常規(guī)方法或安裝制造商的產(chǎn)品說明書所述的方法。本實用新型人經(jīng)過試驗驗證，發(fā)現(xiàn)ang/mL生物素化的羊抗兔抗體以1 250稀釋作為檢測抗體進行檢測兔血清中禽流感抗體，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測抗體Bio-羊抗 兔抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化SPA以1 2500稀釋作 為檢測人血清中禽流感抗體，檢測結(jié)果顯示生物素化檢測抗體Bio-SPA可獲得高檢測值和 低背景值的檢測效果。實施例3、樣品的制備、檢測及結(jié)果判定1、待測樣品制備用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮芯片檢測。2、樣品的檢測及結(jié)果判定檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用蛋白懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、檢測結(jié)果判定根據(jù)試驗研究結(jié)果與相關研究報道，本實用新型定義蛋白懸浮芯片方法檢測禽流 感抗體的最低檢出限(L0D值)為檢測熒光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測物濃度。其中， Cutoff的定義是采用空白對照樣品(Blank)熒光檢測信號MFI均值加3倍標準差(SD)，即 Cutoff值為=MFI (空白對照)+3倍標準差。若檢測結(jié)果高于Cutoff對應熒光強度值則判 定為禽流感抗體檢測結(jié)果陽性；若檢測結(jié)果低于Cutoff對應熒光強度值則判定為禽流感 抗體檢測結(jié)果陰性。實施例4、蛋白懸浮芯片對禽流感H5蛋白抗原的特異性試驗應用蛋白懸浮芯片檢測方法分別對兔抗結(jié)核IgG、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG、兔抗禽流感H5W血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等進行檢測，根據(jù)實施例3 中檢測結(jié)果判定標準，僅兔抗禽流感H5m IgG為陽性，其余干擾抗體或蛋白均為陰性。說 明本實用新型所建立的禽流感抗體的蛋白懸浮芯片檢測方法與其它測試抗體均不發(fā)生交 叉反應或非特異反應。實施例5、對血清樣品中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片定量檢測1、兔抗禽流感H5W IgG標準曲線樣品制備用樣品稀釋液將兔抗禽流感H5W IgG標準品由20 μ g/mL以4倍倍比梯度稀釋至 19Ip g/mL成系列濃度樣品。2、劑量-反應標準曲線的繪制按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，并根據(jù)蛋白懸浮芯片系統(tǒng)檢 測結(jié)果繪制劑量-反應標準曲線(如圖3所示)。其中，X軸代表抗體的濃度(ng/mL)，Y軸 代表懸浮芯片儀檢測的熒光值(MFI)。每個數(shù)據(jù)代表3次的檢測結(jié)果平均值，坐標軸以對 數(shù)-對數(shù)關系設定，圖2中兔抗禽流感H5W血清的濃度(ng/mL)分別為做4倍比稀釋范圍 為:S1 :0. 004，S2 :0. 0162，S3 :0. 647，S4 :0. 259，S5 :1. 04，S6 :4. 14，S7 :16. 56，S8 :66. 25，S9 :265, SlO :1060ο蛋白懸浮芯片系統(tǒng)根據(jù)檢測結(jié)果擬合兔抗禽流感H5W血清劑量-反應標準曲線 方程為FI = -1. 31918+(13360. 5+1. 31918)/[1+(Conc/3. 93328)^ 957367]0'9536893、本實用新型蛋白懸浮芯片法檢測血清中兔抗禽流感H5migG的靈敏度和動態(tài) 范圍根據(jù)最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本實用新型即蛋白懸浮芯片方 法檢測兔抗禽流感H5NlIgG的靈敏度為0. 0015ng/mL (Cutoff = 8. 6213，MFI (空白對照) =6. 5，標準差=0. 7071)。本實用新型定義最高檢出限為使編碼微球的結(jié)合位點處于飽和狀態(tài)的檢測物濃 度。根據(jù)標準曲線隨著兔抗禽流感H5migG濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞增，當兔 抗禽流感H5migG濃度超過0. 05mg/mL時，抗原抗體的免疫反應未達到飽和狀態(tài)，MFI值還 沒進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度還沒達到使MFI值飽和的濃度，需要高濃度的樣 品再檢測。因此，根據(jù)最低檢出限與最高檢出限可以判定本發(fā)明即蛋白懸浮芯片定量檢測 兔抗禽流感H5m IgG的動態(tài)范圍為48. 828 50000ng/mL。實施例6、蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法檢測禽流感抗體的比較1、生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測方法作為對比，生物素-親和素ELISA采用包括下列步驟1)向普通ELISA微孔板每孔加入50yL用PBS緩沖液稀釋的禽流感H5蛋白 5-50μ g，4°C靜止過夜；2)加入封閉液，在37°C封閉2小時；3)洗液洗3次，拍干；4)加入檢測樣品，每孔50 μ L，室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍干；5)加入適量生物素化檢測抗體，每孔50 μ L，室溫放置30分鐘；洗液洗3次，拍干；6)加入適量SA/HRP (辣根酶標記鏈霉親和素)，50 μ L/孔，室溫放置3分鐘；洗液 洗3次，拍干；7)加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50 μ L/孔，室溫放置10 分鐘；8)用 2M H2SO4 終止反應;9)應用酶標儀測讀A450nm數(shù)值。2、樣品的蛋白懸浮芯片檢測方法采用間接法測抗體的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板上進 行。1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，洗液洗滌并用真空泵抽濾2次；2)加入50μ L檢測樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并抽濾3次；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化抗體，混勻后室溫避光 震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾3次；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌并真空泵抽 濾3次；[0119]5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值并分析數(shù)據(jù)。3、兩種檢測方法的靈敏度和動態(tài)范圍及相關性的比較制備的相同一組兔抗禽流感H5W血清樣品用樣品稀釋液10倍比稀釋同時應用蛋 白懸浮芯片和ELISA方法進行檢測。繪制ELISA方法檢測兔抗禽流感H5W血清的標準曲 線(圖中橫坐標為樣品濃度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數(shù)-對數(shù)關系)，并與蛋白懸浮 芯片方法結(jié)果進行比較。根據(jù)兩種方法標準曲線蛋白懸浮芯片方法如圖2所示的靈敏度為 4. 767 X 10-6(血清滴度)，線性檢測范圍2X10-7 2X10-2 ；ELISA方法如圖3所示的靈 敏度為105(血清滴度)，線性檢測范圍10-5 10-2?？梢缘贸鼋Y(jié)論檢測相同兔抗禽流感 H5N1血清樣品，蛋白懸浮芯片方法比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度，即高10倍；并且 具有更寬的動態(tài)檢測范圍，即高2個數(shù)量級。另外，如圖4所示，將兩種方法檢測結(jié)果在10-5 10-2范圍內(nèi)進行比較可以判定 蛋白懸浮芯片方法與ELISA方法有良好的相關性，相關系數(shù)為0. 9863。實施例7、人血清樣品的檢測1、人血清樣品的準備將人血清樣品用樣品稀釋液1 10稀釋(人血清樣本5 μ L加樣品稀釋液50 μ L 混勻)后用于蛋白懸浮芯片檢測。2、人血清樣品的檢測1)每孔加入50 μ L含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌并用真空泵抽濾；2)加入50 μ L待檢測人血清樣品，混勻后室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌并 抽濾；3)加入50 μ L適當濃度的用抗體稀釋液稀釋后的生物素化羊抗人抗體，混勻后室 溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌并真空泵抽濾；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室溫避光震搖10分鐘。洗液洗滌并真空泵抽濾；5)加入125 μ L的檢測緩沖液，經(jīng)蝸旋重懸混勻；6)用懸浮芯片系統(tǒng)讀取MFI數(shù)值，根據(jù)標準曲線，確定待檢測人血清中禽流感抗 體的濃度。經(jīng)過多次重復試驗，生物素化SPA稀釋比例選用1 2500稀釋，SA-PE稀釋比例 選用1 300稀釋，經(jīng)過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值與其標準差的3倍之 和為作為判斷陰陽性的界值，即C utoff值為2觀6，換算為濃度值是0. 68ng/mL，檢測得到 的MFI值如果大于2286，即血清中的禽流感抗體濃度過高，可視為禽流感抗體陽性可能被 禽流感病毒感染，如果MFI值小于2286，即血清中的登革熱抗體濃度低于0. 68ng/mL可判斷 為禽流感抗體陰性，未感染禽流感病毒或禽流感病毒隱性攜帶者。
權(quán)利要求1.一種檢測血清樣本中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，該芯片系統(tǒng)包 括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，其中，芯片基體內(nèi)裝有相關緩沖溶液和 待測抗體，相關緩沖液中設置有032號編碼微球，編碼微球上包被有捕獲抗原，加液系統(tǒng)依 次向芯片基體中加入生物素標記的二抗和/或SPA、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括 微細管檢測通道和檢測激光，反應后的溶液吸入到微細管檢測通道中，以使得每個編碼微 球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的熒光信 號，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述相關緩沖溶液包括用于 所述待測抗體稀釋的樣品稀釋液、稀釋所述編碼微球所用的微球稀釋液、稀釋所述生物素 標記的二抗和/或SPA所用的抗體稀釋液、每個反應之后洗滌編碼微球所用的微球清洗液、 SA-PE稀釋液、檢測緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述捕獲抗原優(yōu)選為禽流感 H5蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述待測抗體為血清樣品。
5.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述生物素標記的二抗和/或 SPA優(yōu)選為Biotin-羊抗兔和/或Biotin_SPA。
6.如權(quán)利要求2所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述熒光信號檢測物為鏈親 和素-藻紅蛋白。
7.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述芯片基體為96孔濾板或者微量離心管。
8.如權(quán)利要求1所述的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，其特征在于，所述檢測激光包括用激發(fā)所 述編碼微球基質(zhì)中的顏色、識別編碼微球分類編碼以確定檢測項目的紅色激光，用于激發(fā) 并識別待測分子的顏色信號、記錄信號強弱以檢測所述待測抗體的含量的綠色激光。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測血清中禽流感抗體的蛋白懸浮芯片系統(tǒng)，包括芯片基體、加液系統(tǒng)、懸浮芯片檢測儀和計算機，芯片基體內(nèi)裝有相關緩沖溶液和待測抗體，相關緩沖液中設置有編碼微球，編碼微球上包被捕獲抗原，加液系統(tǒng)依次向芯片基體中加入生物素標記的二抗和/或SPA、熒光信號檢測物，懸浮芯片檢測儀包括微細管檢測通道和檢測激光，編碼微球依次通過微細管檢測通道，檢測激光激發(fā)并識別編碼微球的顏色及其上待測物的顏色，計算機與懸浮芯片檢測儀相連，并記錄、分析懸浮芯片檢測儀的測量結(jié)果。懸浮芯片技術利用微球在溶液中反應，利用激光檢測技術，提高了樣品檢測的準確性和重復性，具有優(yōu)于片膜芯片的操作簡便、重復性好等特點。
文檔編號G01N33/543GK201903543SQ20102062844
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者孫肖紅, 徐寶梁, 楊宇, 楊永莉, 王靜 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院