專利名稱：一種檢測血清中丙肝病毒抗體的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體來說涉及一種檢測血清中丙肝病毒抗體的方法。
背景技術：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒引起的，較乙型肝炎更為嚴重的一種傳染性疾病，容易轉化為肝硬化和肝癌。診斷丙型肝炎的檢測方法主要有兩種一種是利用PCR擴增法檢測丙肝病毒RNA，另外一種是檢測丙肝病毒抗體。目前臨床多采用酶聯免疫方法檢測丙肝病毒抗體，首先利用包被在檢測板孔內的抗人IgG抗體捕獲丙肝病毒抗體，利用細菌、酵母或昆蟲細胞株來表達重組抗原，將抗原與 HRP等酶類交聯，利用HRP標記后的抗原與丙肝病毒抗體之間產生特異性親和反應，通過 HRP顯色系統(tǒng)來檢測和反映抗體水平。但此類方法靈敏度和特異性均不高，同時也僅能應用于丙肝病毒抗體的定性檢測，無法反映丙肝病毒抗體隨病程的變化情況，不能很好地指導臨床的診療工作。

發(fā)明內容
本發(fā)明公開了一種檢測血清中丙肝病毒抗體的方法，該方法同時也適用于其他液體如血漿、細胞裂解液中丙肝病毒抗體的檢測。為實現本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案來檢測血清中丙肝病毒抗體。步驟1.將克隆得到的丙肝病毒基因和報告基因片段亞克隆到帶有標簽蛋白基因的真核表達載體的多克隆位點處。步驟2.將重組質粒轉染入哺乳動物細胞株進行表達，并利用標簽蛋白抗體純化得到報告基因蛋白和抗原的融合蛋白。步驟3.將純化后的融合蛋白與待測血清常溫或37°C孵育1小時，加入protein A/G免疫磁珠常溫孵育1小時。步驟4.利用磁力吸附捕獲抗原、抗體及protein A/G的復合物，加入報告基因底物進行反應，檢測報告基因的激活水平，來反映抗體含量。其中，所述病毒基因可以為全長基因，也可以為部分基因片段或嵌合基因片段，也可以為人工進化得到的優(yōu)化后的基因片段。上述方案中所述報告基因為不超過3個的熒光素酶或熒光蛋白或β-內酰胺酶基因的串聯體，每兩個基因之間可以由Gly和kr的短肽隔開。上述方案中所述標簽蛋白基因是指包括His、FLAG、V5、Myc, MBP, GST等常用標簽蛋白對應的基因片段。上述步驟2中所述轉染入哺乳動物細胞株進行融合蛋白表達，可選取瞬時轉染表達，也可以通過抗性篩選建立穩(wěn)定表達株的方法來實現融合蛋白的表達。上述步驟3，4中所述加入protein A/G免疫磁珠捕獲抗原抗體復合物的方法僅針對于待測抗體屬IgA、IgG類抗體，其他類抗體則需要采取其他方法進行捕獲。
上述步驟4中所述加入報告基因底物是針對熒光素酶或β -內酰胺酶而言，對于所選報告基因如為熒光蛋白時，則可以以特定波長的光激發(fā)后來檢測在發(fā)射波長處的熒光信號來定性定量測定熒光蛋白的含量，來反映待測中的抗體水平。上述方案中所述抗體的定量檢測是指以已知濃度且呈梯度稀釋的抗體做為標準物，來檢測報告基因的激活水平，而得到抗體濃度與報告基因激活量之間的劑量效應曲線， 從而來實現抗體濃度或含量的定量檢測。本發(fā)明提供的丙肝病毒抗體檢測方法敏感性和特異性高，具有高通量的特點，同時可實現丙肝病毒抗體的定量檢測，還可廣泛應用于其他感染性疾病和自身免疫相關疾病的各類抗體檢測試劑盒的生產開發(fā)與臨床診療。


圖1示含標簽蛋白、報告基因、抗原基因的表達質粒的示意圖。圖2示報告基因激活水平與丙肝病毒抗體間的線性劑量效應。
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種血清中丙肝病毒抗體的檢測方法。本領域技術人員可借鑒本文內容，適當改進工藝參數加以實現。實施例1.以檢測血清中丙肝病毒核心抗體為例，制定以下技術方案。步驟1.重組質粒的構建根據丙肝病毒核心抗原序列(Genbank #AF177036. 1)設計并合成引物對(上游引物:5，AGCACAMT0CTAM0CTC 3，，下游引物:5，AGCGGAGACCGGGGTGG 3，)，以從丙肝患者全血中提取的病毒RNA為模板，擴增出丙肝病毒核心抗原基因(HCV core)并克隆到 T載體進行測序驗證。以pGluc-basic (NEB產品)質粒為模板PCR擴增Gaussia Iuciferase (Gluc)基因片段，同時在引物5’末端人工加上FLAG蛋白相對應的核苷酸序列，將擴增得到的 FLAG-GIuc克隆到pcDNA3. 1載體內，同時利用限制性酶切法從T載體上將乙肝病毒核心抗原基因也克隆到pcDNA3. 1載體內，注意保證閱讀框的正確。這樣，得到FLAG"Gluc-HCV core的重組表達質粒，如圖1所示。步驟2.融合蛋白的表達純化將IOug轉染級別的重組質粒用脂質體轉染試劑 (Lipofectamine 2000)導入IXlO7真核細胞如HEK293T中，24-48小時后收集細胞并進行裂解，用FLAG抗體親和層析純化細胞裂解液中的FLAG-Gluc-HCV core融合蛋白。步驟3.將100 ng純化后的融合蛋白與50 Ul待測血清室溫孵育30 min，加入10 ul protein A/G 免疫磁珠(Pierce biotechnology)室溫孵育 30 min，后用緩沖液(50 mM Tris, pH 7. 5, IOOmMNaCl, 5 mM MgCl2，1% Triton X-100)洗 3 次，后用 PBS 緩沖液洗 3次，其間利用磁力吸附捕獲抗原抗體復合物。步驟4.向上述復合物中加入50 ul 100 nM Coelenterazine后，利用化學發(fā)光儀檢測其發(fā)光強度。實施例2.抗體與報告基因激活水平間的劑量效應分別用梯度稀釋的HCV抗體 (Abeam產品)和Flag抗體按實施例1中的方案來檢測報告基因的激活水平，結果如圖2所示，提示報告基因激活水平與抗體量之間存在線性劑量效應，以此可以用來進行抗體的定量檢測。
權利要求
1.一種檢測血清中丙肝病毒(HCV)抗體的方法，包括構建帶有標簽蛋白基因的丙肝病毒基因和報告基因的重組質粒，將重組質粒導入哺乳動物細胞株進行表達，利用標簽蛋白抗體純化融合蛋白，將融合蛋白與血清孵育，利用免疫磁珠捕獲抗原抗體復合物，加入報告基因底物檢測報告基因激活水平反映丙肝病毒抗體含量。
2.根據權利要求1的方法，所述標簽蛋白為His、FLAG、Myc、V5、MBP等標簽蛋白之一。
3.根據權利要求1的方法，所述標簽蛋白為FLAG標簽蛋白，氨基酸序列如SEQID N0:1 所示。
4.根據權利要求1的方法，所述丙肝病毒基因為編碼丙肝病毒結構蛋白或非結構蛋白的基因片段，或上述兩種基因的嵌合體，或上述基因經人工進化優(yōu)化后的基因片段。
5.根據權利要求1的方法，所述丙肝病毒基因為HCVcore，El, E2, NS2, NS3, NS4, NS5 之一。
6.根據權利要求1的方法，所述丙肝病毒基因為HCVcore，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。
7.根據權利要求1的方法，所述報告基因為熒光素酶、熒光蛋白、內酰胺酶之一。
8.根據權利要求1的方法，所述報告基因為熒光素酶GaussiaLuciferase，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
9.根據權利要求1的方法，所述融合蛋白是指丙肝病毒蛋白和報告基因蛋白組成的融合蛋白ο
10.根據權利要求1的方法，所述免疫磁珠是指proteinA或G磁珠。
11.根據權利要求1，7的方法，所述報告基因底物是Coelenterazine。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體來說涉及一種檢測血清中丙肝病毒(HCV)抗體的方法，包括構建帶有標簽蛋白基因的丙肝病毒基因和報告基因的重組質粒，將重組質粒導入哺乳動物細胞株進行表達，利用標簽蛋白抗體純化融合蛋白，將融合蛋白與血清孵育，利用免疫磁珠捕獲抗原抗體復合物，加入報告基因底物檢測報告基因激活水平反映丙肝病毒抗體含量。
文檔編號G01N33/68GK102305862SQ20111013651
公開日2012年1月4日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2011年5月25日
發(fā)明者方輝 申請人:方輝