專利名稱：：檢測(cè)非人血清中的人抗體的制作方法檢測(cè)非人血清中的人抗體本申請(qǐng)是以對(duì)除美國以外的所有指定國的申請(qǐng)人美國國營公司健泰科公司(Genentech,Inc.)和中國公民JihongYang及美國,A民ValerieElizabethQuarmby的名義，作為PCT國際專利申請(qǐng)?jiān)?005年12月30日提交的，并要求2004年12月31日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/640,948的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明背景已廣泛研究了抗體包括人源化單克隆抗體在人中潛在的治療應(yīng)用。在治療用抗體的早期開發(fā)中，研究的是分子的有效性和安全性。通常，這樣的研究牽涉將抗體施用于非人物種諸如非人靈長類動(dòng)物。分析目的抗體在獲自非人物種的體液例如血清中的存在和濃度。為進(jìn)行該分析，需要能夠特異性檢測(cè)并定量非人物種體液中抗體的靈敏血清藥動(dòng)學(xué)(PK)測(cè)定法。一般而言，可用于測(cè)定生物學(xué)基質(zhì)諸如血清中靶分子濃度的藥動(dòng)學(xué)測(cè)定法需要使用一種或多種靶特異性分子，特別是當(dāng)靶分子是存在于非人靈長類動(dòng)物諸如獼猴血清中的人源化IgG時(shí)。由于測(cè)定中基質(zhì)成分的非特異性相互作用，生物學(xué)基質(zhì)有引起高測(cè)定背景的趨勢(shì)。存在于密切相關(guān)的第二物種生物學(xué)流體中的第一物種抗體的分析可能是特別困難的，因?yàn)樵谶@兩種物種的IgG之間存在著高度序列同一性。例如，據(jù)報(bào)道獼猴IgG和人IgG之間k恒定區(qū)(Qc)的序列同一性為約83%，k可變區(qū)(vk)框架區(qū)的序列同一性為約88-99%，重鏈可變區(qū)(VH)框架區(qū)的序列同一性為約93%,而重鏈恒定區(qū)(CH)的序列同一性為約93-95%。參見例如Lewis等，1993,DevelopmentalandComparativeImmunology,17:549-60;D'Ovidio等,1994,FoliaPrimatol63:221-25;Pace等，1996，Immunol.Lett.50:139-42。獼猴IgG的循環(huán)水平通常在10-16mg/ml的范圍內(nèi)，大大高于分析過程中存在于獼猴血清中的靶人抗體的水平，其可低至20ng/ml(Biagini等，1988，LaboratoryAnimalScience,38:194;Trypho廳等，1991，JMedPrimatol,20:58)。一種例示性人抗體是rhuMAb2H7，衍生自鼠前體2H7的全長人源化單克隆抗體，屬于具有k輕鏈的人IgGl家族(Clark等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82:1766-70)。rhuMAb2H7抗體針對(duì)在正常和惡性B細(xì)胞上都表達(dá)的CD20抗原的胞外結(jié)構(gòu)域(Stashenko等，1980，J.Immunol.125:1678-85;Clark等，1989,Adv.CancerRes,52:81-149;Tedder等，1994,Immunol.Today15:450-54;Tedder等，1988,J.Biol.Chem.263:10009-10015;Riley等，2000，Semin,Oncol.27:17-24)。已成功使用B細(xì)胞消減劑來治療惡性B細(xì)胞介導(dǎo)的癌癥，諸如非何杰金氏淋巴瘤(McLaughlin等，1988,Oncology12:1763-69)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(Jensen等，1998，A.AnnHematol77:89-91;Gopal等，1999，J.Lab.Clin.Med.134:445-50;vonSchilling,2003,Semin.CancerBiol.，2003,13:211-22)。B細(xì)胞還牽涉自身免疫病諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Domer等，2003，Opin.Rheumatology15:246-52;Looney,2002，Ann.Rheum.Dis.61:863-6;Shaw等，2003)、系統(tǒng)性紅斑狼癡(Anolik等，2003,CurrentRheum.Reports.5:350-6)和多發(fā)性硬化(Hafler,2004,JClinInvest.113(6):788-94)。在體內(nèi)rhuMAb2H7結(jié)合CD20抗原造成B細(xì)胞消減(Vugmeyster等，2004，IntImmunopharmacol.4(8):1117-24)。盡管通過rhuMAb2H7消減B細(xì)月包的確切機(jī)制尚未明了，但是結(jié)合體內(nèi)功效數(shù)據(jù)以及來自其它抗CD20治療劑的功效數(shù)據(jù)，表明rhuMAb2H7是B細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病和肺瘤學(xué)適應(yīng)證的潛在治療劑。在rhuMAb2H7的早期開發(fā)中，最初在獼猴中進(jìn)行概念驗(yàn)證研究以評(píng)估該分子的有效性和安全性。需要一種檢測(cè)并定量獼猴血清中rhuMAb2H7的靈敏PK測(cè)定法來支持藥動(dòng)學(xué)評(píng)估。這樣一種測(cè)定法的開發(fā)提出了獨(dú)特的挑戰(zhàn)，包括缺乏可用的靶特異性分子。為解決特異性區(qū)分人源化IgG與獼猴IgG的挑戰(zhàn)，用于檢測(cè)獼猴血清中人源化IgG分子的可用測(cè)定法利用一種或多種靶特異性分子。例如，在rhuMAb2H7獼猴初步研究中，需要20ng/ml的測(cè)定靈敏度。不易獲得結(jié)合抗CD20抗體的這樣的靶特異性分子。為解決該問題，開發(fā)了一種備選測(cè)定法。本發(fā)明提供了無需使用耙特異性捕捉或檢測(cè)劑，定量生物學(xué)基質(zhì)諸如體液中各分子例如抗體的新方法。所公開的測(cè)定法具有高靈敏度并適用于廣泛的分子，包括多肽諸如抗體。所公開的測(cè)定法特別可用于在第一動(dòng)物物種抗體處于第二動(dòng)物物種、甚至密切相關(guān)物種的體液中時(shí)，檢測(cè)第一動(dòng)物物種抗體，諸如人IgG和非人靈長類動(dòng)物IgG。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在存在第二物種的相似分子的情況下，檢測(cè)第一物種分子的存在或量的方法?？墒褂帽疚乃龅姆椒z測(cè)并定量處于第二物種生物學(xué)基質(zhì)諸如血清或其它體液中的第一物種分子例如抗體。待測(cè)定的樣品可以是例如處于第二物種體液中的第一物種抗體，諸如人的、人嵌合的或人源化的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述第二物種例如非人物種，包括密切相關(guān)的靈長類動(dòng)物物種諸如獼猴。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含恒定區(qū)。一般而言，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在配體結(jié)合測(cè)定法的封閉步驟中添加哺乳動(dòng)物球蛋白諸如牛丙種球蛋白(BGG)作為特異性封閉劑，通過降低血清背景及測(cè)定的背景變異，大大提高測(cè)定的靈敏度。例如用第二物種(或與第二物種密切相關(guān)的物種)的生物學(xué)基質(zhì)預(yù)吸收捕捉劑的額外步驟也降低測(cè)定背景并進(jìn)一步提高測(cè)定的靈敏度。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)處于非人體液諸如血清中的人的、人源化的或(1)將捕捉劑施于測(cè)定表面；(2)用含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白諸如牛丙種球蛋白的封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；(3)使樣品與封閉后的捕捉劑反應(yīng)；并(4)用檢測(cè)劑例如能夠產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)劑4企測(cè)捕捉到的抗體。所迷捕捉劑和所述檢測(cè)劑各自都能結(jié)合待檢測(cè)的分子。所述捕捉劑和所述檢測(cè)劑能結(jié)合待檢測(cè)分子的相同或不同的配體或表位。例如，所述捕捉劑和所述檢測(cè)劑能包含相同的抗體?？梢杂蒙飳W(xué)基質(zhì)預(yù)吸收捕捉劑，所述生物學(xué)基質(zhì)例如第二物種或與第二物種密切相關(guān)的物種的體液。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一物種是人，第二物種是非人物種，例如非人哺乳動(dòng)物，諸如靈長類動(dòng)物，可以是例如猴、牛、豬、馬、綿羊等。密切相關(guān)的物種通常是那些屬于相同科的物種，而且可以屬于相同的屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述封閉緩沖液含有哺乳動(dòng)物球蛋白作為非特異性封閉劑。在檢測(cè)人的、人源化的或人嵌合的抗體的測(cè)定法中，例如，封閉緩沖液含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白諸如牛丙種球蛋白(BGG)、小鼠IgG、兔IgG或驢IgG。在使用橋連ELISA格式時(shí)，哺乳動(dòng)物球蛋白可存在于封閉緩沖液中，但不存在于樣品緩沖液和/或檢測(cè)緩沖液中。在使用直接ELISA格式時(shí)，哺乳動(dòng)物球蛋白可存在于封閉緩沖液、樣品緩沖液和檢測(cè)劑緩沖液的每一種中。當(dāng)?shù)谝晃锓N的分子例如抗體或抗體片段處于第二物種的生物學(xué)基質(zhì)例如體液諸如非人血清中時(shí)，本文所述測(cè)定法可用于檢測(cè)和/或定量所述分子，包括多肽諸如抗體，例如人的、人嵌合的和人源化的抗體及其片段，諸如Fab片段等。通過使用本文所公開的測(cè)定法，可以高靈敏度^^測(cè)和/或定量非人靈長類動(dòng)物血清中的重組的、人源化的單克隆抗體諸如抗HER2抗體HERCEPTIN、抗CD20抗體rhuMAb2H7等，無需使用靶特異性捕捉劑。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示使用全長CD20抗原分子作為靶特異性捕捉劑，用于檢測(cè)rhuMAb2H7的靶特異性測(cè)定法的rhuMAb2H7標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。圖2是顯示用于檢測(cè)獼猴血清中rhuMAb2H7的ELISA測(cè)定法中的信噪比的柱狀圖。該測(cè)定法設(shè)計(jì)用來測(cè)試各種緩沖液成分及稀釋和未稀釋形式的緩沖液。圖3是顯示在封閉緩沖液而非樣品稀釋劑或檢測(cè)緩沖液中使用BGG的測(cè)定體系中產(chǎn)生的rhuMAb2H7(抗CD20)、AvastinTM(抗VEGF)和Raptiva⑧(抗CDlla)抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。圖4是顯示在封閉緩沖液而非樣品稀釋劑或檢測(cè)緩沖液中使用BGG的測(cè)定體系中產(chǎn)生的rhuMAb2H7、Xolair⑧(抗IgE)和Herceptin⑧(抗HER2)抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。圖5是顯示在封閉緩沖液而非樣品稀釋劑或檢測(cè)緩沖液中使用BGG的測(cè)定體系中產(chǎn)生的Rituxan⑧抗體(抗CD20)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述I.定義"測(cè)定表面"意在涵蓋可用于固定在本文所述測(cè)定體系中使用的捕捉劑的任何表面。測(cè)定表面可包括惰性支持物或載體，其是基本上不溶于水的而且例如可用于免疫測(cè)定法的，包括表面、顆粒、多孔基質(zhì)等形式的支持物。具體的測(cè)定表面包括例如微量滴定板、層析樹脂、傳感器芯片等。術(shù)語"捕捉劑"指能夠結(jié)合并捕捉樣品中待檢測(cè)的靶分子或分析物的試劑。典型的，捕捉劑固定在例如測(cè)定表面上，所述測(cè)定表面例如固體基質(zhì)，諸如微粒或珠、微量滴定板、柱樹脂等。捕捉劑是結(jié)合測(cè)定法中待檢測(cè)和定量的分子(靶分子或分析物)的分子。當(dāng)待檢測(cè)的分子是抗體時(shí)，捕捉劑可以是例如結(jié)合輩巴抗體的抗原、可溶性受體、抗體、抗體片段、不同抗體的混合物等。術(shù)語"檢測(cè)"以最廣義使用，包括特定分子的定性和定量測(cè)量，在本文中包括特定靶分子諸如人源化抗體的測(cè)量。本文中所描述的測(cè)定法可用于鑒定樣品中微量存在的靶分子。該測(cè)定法還可用于對(duì)樣品中耙分子的量定量。該測(cè)定法亦可用于測(cè)定靶分子對(duì)其結(jié)合配偶體的相對(duì)結(jié)合親和力，例如抗體對(duì)其配體的相對(duì)結(jié)合親和力。術(shù)語"檢測(cè)劑"指檢測(cè)測(cè)定的耙分子的試劑，或是直接經(jīng)由可與檢測(cè)劑連接的標(biāo)記物，諸如熒光的、酶的、放射性的或化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記物等，或是間接經(jīng)由經(jīng)標(biāo)記的結(jié)合配偶體，諸如特異性結(jié)合檢測(cè)劑的抗體或受體。直接和間接的檢測(cè)劑是已知的。檢測(cè)劑的例子包括但不限于抗體、抗體片段、可溶性受體、受體片段等。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)劑可以在噬菌體外殼上表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)劑是直接標(biāo)記物，例如偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)劑是間接的，包括偶聯(lián)有生物素的抗體和鏈霉親合素-HRP偶聯(lián)物。術(shù)語"標(biāo)記物"在用于本文時(shí)包括放大檢測(cè)劑所產(chǎn)生的信號(hào)的試劑。標(biāo)記物可以是放射學(xué)的(放射性的)、光致發(fā)光的、化學(xué)發(fā)光的(諸如HRP)或電致化學(xué)發(fā)光的化學(xué)部分，將無色底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩a(chǎn)物的酶等。酶標(biāo)記物的例子包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、P-D-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、谷氨酸脫羧酶、過氧化氫酶、脲酶、腺苷電極(adenosineelectrode)、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、己糖激酶、p-淀粉酶和磷脂酶c。熒光標(biāo)記物的例子包括但不限于香豆素衍生物、熒光素、羅丹明、銪、藻紅蛋白、釤、鋱和傘形酮(umbelliferone)。發(fā)光標(biāo)記物的例子包括但不限于吖啶酯和異魯米諾(isoluminol)衍生物。還可使用的其它標(biāo)記物包括例如配體標(biāo)記物諸如親合素或生物素書f生物、并立子標(biāo)記物、》丈射性同位素標(biāo)記物、嚢泡標(biāo)記物、J交態(tài)金屬標(biāo)記物和自旋標(biāo)記物》者如硝基氧自由基。術(shù)語"抗體"在本文中以最義使用，具體包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、由至少兩種抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性的抗體片段?？贵w可以是天然的或合成的，可以包含不消除抗體結(jié)合活性的氨基酸變異諸如替代。"嵌合抗體"中其重^t連和/或輕鏈的至少一部分在物種或在抗體類別或亞類方面不同于抗體的剩余部分，包括展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性的片段(美國專利號(hào)4，S16，567;Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.SciUSA,81:6851-6855)。非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。一般而言，人源化抗體是如下的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體抗體高變區(qū)(依照Kabat等，1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD以序列限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或依照Chothia和Lesk,1987，J.Mol.Biol.196:901-917以結(jié)構(gòu)限定的高變環(huán)(HVL))的殘基為具有期望特異性、親和力和能力、來自非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物的相應(yīng)高變區(qū)的殘基所替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的特定可變區(qū)框架區(qū)(FR)殘基為相應(yīng)非人殘基所替換。此外，人源化抗體可以包含不見于受體抗體或不見于供體抗體的殘基。通常進(jìn)行這樣的修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能。一般而言，人源化抗體應(yīng)包含至少一個(gè)重鏈或輕鏈可變區(qū)的基本上全部，通常包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，其中高變環(huán)或CDR的全部或基本上全部對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，F(xiàn)R區(qū)的全部或基本上全部則是人免疫球蛋白序列或人共有序列的那些。人源化抗體任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。參見例如Jones等，1986,Nature321:522-525;Riechmann等，1988,Nature332:323-329;Presta,1992，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。抗體"片段"，包括嵌合的和人源化的抗體的片段，包含完整抗體的一部分，例如完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、由抗體片段形成的多特異性抗體等。"密切相關(guān)的物種"指那些屬于同一科，優(yōu)選屬于同一屬的物種。"靈長類動(dòng)物，，解釋為指哺乳動(dòng)物目的任何一種動(dòng)物，包括人、猿、狒狒、黑猩猩、猴和相關(guān)形式，諸如狐猴和跗猴。猴包括例如恒河猴、獼猴和非洲綠猴。II.實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和/或定量目標(biāo)靶分子的準(zhǔn)確和高度靈敏的篩選方法，所述目標(biāo)靶分子諸如人的、人嵌合的或人源化的抗體或此類抗體的片段。本發(fā)明的測(cè)定法提供了對(duì)存在于復(fù)雜生化介質(zhì)諸如非人血清中的靶分子包括人抗體的靈敏篩選，無需靶特異性分子作為捕捉劑。通常，依照本發(fā)明的測(cè)定法包括如下步驟(1)將第一物種捕捉劑施于測(cè)定表面；(2)用含有第二物種球蛋白的封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；(3)使封閉后的捕捉劑與樣品反應(yīng)以捕捉存在于樣品例如非人血清諸如猴血清中的任何靶分子例如人的、人源化的或嵌合的抗體；并(4)用檢測(cè)劑檢測(cè)捕捉到的靶分子抗體。本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即在測(cè)定用封閉緩沖液中使用非人哺乳動(dòng)物球蛋白能對(duì)人的、人源化的或嵌合的抗體進(jìn)行定量測(cè)定，其展現(xiàn)出相對(duì)較低的背景以及樣品間相對(duì)較低的背景變異，同時(shí)保持對(duì)靶分子的高靈敏度。預(yù)計(jì)本發(fā)明的方法可用于在存在第二物種生物學(xué)基質(zhì)的情況下人或非人(第一物種)靶分子的分析。A.捕捉劑劑的選擇。選擇具有從樣品中結(jié)合并捕捉靶分子的能力的捕捉劑。當(dāng)靶分子是抗體時(shí)，例如，捕捉劑可以是抗體，諸如抗人IgG。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，在非人血清中定量人源化抗體時(shí)，捕捉劑可以是例如綿羊或山羊抗人IgG。捕捉劑可施于任何合適的測(cè)定表面，諸如微量滴定板、層析樹脂、傳感器芯片等。B.捕捉劑的預(yù)吸收由于非特異性蛋白質(zhì)相互作用，生物學(xué)基質(zhì)諸如非人體液傾向于產(chǎn)生高且不合需要的測(cè)定背景。在一個(gè)實(shí)施方案中，用來自生物學(xué)基質(zhì)的潛在干擾物質(zhì)預(yù)吸收捕捉劑。例如，在分析存在于猴血清中的人抗體的方法中，用非人體液諸如非人血清預(yù)吸收捕捉劑以降低樣品體液與捕捉劑接觸時(shí)的非特異性相互作用。與為進(jìn)行預(yù)吸收的捕捉劑相比，捕捉劑的預(yù)吸收可用來降低測(cè)定背景?？捎脕碜缘诙锓N例如非人物種或與第二物種密切相關(guān)的物種的體液諸如血清預(yù)吸收捕捉劑。例如，對(duì)于分析處于猴血清中的人源化抗體(第一物種)，體液是猴血清，捕捉劑是用猴血清(第二物種)或密切相關(guān)物種諸如不同靈長類動(dòng)物的血清預(yù)吸收以降低非特異性相互作用的結(jié)合配體。c.封閉緩沖液適用于本文所述方法的捕捉劑具有與樣品中待檢測(cè)和/或定量的期望靶分子(例如抗體)以外的成分產(chǎn)生非特異性相互作用的潛力。在使捕捉劑與含有待定量的靶分子(例如抗體)的樣品反應(yīng)之前，可通過使用封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉緩沖液用來結(jié)合并飽和非特異性結(jié)合位點(diǎn)，并防止不需要的游離配體結(jié)合測(cè)定表面上過量的結(jié)合位點(diǎn)。已知多種封閉緩沖液，可含有例如牛血清清蛋白(BSA)、明膠、Superblock(Pierce，Rockford，IL)、酪蛋白(Pierce)等作為活性封閉成分?？商砑拥椒忾]緩沖液中的其它成分包括例如鹽、金屬螯合劑、非特異性結(jié)合劑、非變性的兩性離子洗滌劑等。本發(fā)明的方法部分涉及以下發(fā)現(xiàn)，即在用于檢測(cè)非人血清中的人或人源化抗體的測(cè)定體系的封閉緩沖液中使用非人哺乳動(dòng)物球蛋白諸如BGG造成背景信號(hào)和變異顯著降低。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括用于檢測(cè)非人生物學(xué)基質(zhì)中的人靶分子的測(cè)定體系，其中封閉劑包括非人哺乳動(dòng)物球蛋白。非人哺乳動(dòng)物球蛋白可以是例如牛丙種球蛋白(BGG)。其它非人哺乳動(dòng)物球蛋白也可用于封閉緩沖液。這些包括但不限于小鼠IgG、兔IgG、驢IgG等。封閉緩沖液可另外含有常規(guī)封閉劑，諸如牛血清清蛋白、明膠、卵清蛋白、酪蛋白、脫脂乳等。而，應(yīng)理解所述實(shí)施方案也可用于檢測(cè)非人靶分子，例如當(dāng)非人(第一物種)分子處于不同的(第二物種)生物學(xué)基質(zhì)中時(shí)。為了檢測(cè)第二物種生物學(xué)基質(zhì)中的非人分子，可以使用不同于第二物種球蛋白分子的某物種的球蛋白分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物球蛋白例如BGG作為封閉緩沖液的成分存在。樣品緩沖液和/或檢測(cè)緩沖液中可缺少非人哺乳動(dòng)物球蛋白。在一個(gè)利用橋連ELISA格式的實(shí)施方案中，非人球蛋白可僅存在于封閉緩沖液中，而不存在于樣品緩沖液或檢測(cè)緩沖液中。在直接ELISA格式中，非人球蛋白可存在于封閉緩沖液中及樣品緩沖液和3僉測(cè)劑緩沖液中。D.合適的測(cè)定法在本發(fā)明的方法中，一旦已經(jīng)用含有哺乳動(dòng)物球蛋白的封閉緩沖液封閉捕捉劑，并使封閉后的捕捉劑進(jìn)一步與含有目標(biāo)分子的樣品反應(yīng)以捕捉靶分子，捕捉到的靶分子就得以檢測(cè)和/或定量，例如借助產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)劑。利用檢測(cè)劑來定量捕捉到的分子包括抗體的測(cè)定體系是眾所周知的。可光發(fā)光測(cè)定法(FLA)、化學(xué)發(fā)光測(cè)定法(CA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等。參見例如Johnstone和Thorpe,1996,In:Blackwell,ImmunochemistryinPractice,第3版，BlackwellPublishing,Maiden,MA;Ausbul等編，2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley&Sons,Hoboken,NJ;Ghindilis等編，2003,ImmunoassayMethodsandProtocols,BlackwellPublishing,MaidenMA;和美國專利/>開號(hào)20030044865。免疫測(cè)定法可以是固相測(cè)定法、液相測(cè)定法等。1.ELISA免疫測(cè)定體系包括例如固相ELISA和捕捉ELISA。在捕捉ELISA中，可通過已知方法來實(shí)現(xiàn)靶分子在固相上的固定化。靶分子可例如通過在測(cè)定流程之前使捕捉劑不溶解而固定化，諸如通過將捕捉劑吸附至不溶于水的基質(zhì)或表面(參見美國專利號(hào)3，720，760)。捕捉劑還可以通過非共價(jià)或共價(jià)偶聯(lián)至不溶于水的基質(zhì)或表面而不溶解，例如使用戊二醛或碳二亞胺交聯(lián)，無論之前是否用例如硝酸和還原劑活化測(cè)定表面。參見例如美國專利號(hào)3,645,852和Rotmans等，1983,J.Immunol.Methods,57:87-98。耙分子還可在測(cè)定流程后固定化，例如通過免疫沉淀。是抗體/抗原復(fù)合物，其中復(fù)合物的抗原可用來結(jié)合樣品中的靶分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕捉劑可以是與特異性結(jié)合治療用抗體的抗體復(fù)合的抗同種型特異性抗體。例如，捕捉劑可以是與抗治療用IgG單克隆抗體復(fù)合的山羊抗人IgGFc特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗治療用IgG單克隆抗體是抗2H7抗體。a)固相捕捉劑可在供固相ELISA測(cè)定法之用的固相上固定化。基本上不溶于水且可用于免疫測(cè)定法的任何惰性支持物或載體，包括例如表面、顆粒、多孔基質(zhì)、傳感器芯片等形式的支持物，都可用作固相或測(cè)定表面。常用支持物的例子包括小薄片、Sephadex(交聯(lián)葡聚糖凝膠)、聚氯乙烯、塑料珠、微粒、測(cè)定板或由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的試管。這樣的支持物包括96孔微量滴定板和生物傳感器芯片諸如BiaCore傳感器芯片、以及顆粒狀材料諸如濾紙、瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖和其它多糖?；蛘?，反應(yīng)性、不溶于水的基質(zhì)諸如溴化氰活化的碳水化合物和美國專利號(hào)3,969,287;3，691,016;4,195,128;4,247,642;4,229,537;和4,330,440中所記載的反應(yīng)性基質(zhì)適用于捕捉劑的固定化。在一個(gè)實(shí)施方案中，固定化的捕捉劑包被在微量滴定板上。固相諸如多孔微量滴定板可用于同時(shí)分析數(shù)份樣品。固相可用捕捉劑包被，捕捉劑可根據(jù)需要通過非共價(jià)或共價(jià)相互作用或者物理連接來連接。供附著的技術(shù)包括美國專利號(hào)4,376,110及其引用的參考文獻(xiàn)中所記載的那些技術(shù)。如果利用捕捉劑與測(cè)定表面的共價(jià)附著，那么可將平板或其它固相與交聯(lián)劑以及捕捉劑一起溫育。常用于將捕捉劑附著至固相基質(zhì)的交聯(lián)劑包括例如U-雙(重氮乙?；?-2-苯乙烷、戊二酪、N-羥基琥珀酰亞胺酯例如與4-疊氮水楊酸的酯、同型雙功能亞氨酸酯包括雙琥珀酰亞胺基酯(disuccinimidylesters)諸如3,3'-二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酉旨)(3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))、和雙功能馬來酰亞胺諸如雙-N-馬來酰亞胺基-1,S-辛烷(bis-N-maleimido-1，8-octane)。衍生劑諸如3-[(對(duì)疊氮苯基)二石危代]丙亞氨酸曱酉旨(methyl-3-[(p隱azidophenyl)dithio]propioimidate)產(chǎn)生在有光的情況下能夠形成交聯(lián)的光可活化的中間體。如果利用聚苯乙烯或聚丙烯板，那么可通過在約4-20。C,諸如約4-8。C的溫度，在約8-12，諸如約9-10或約9.6的pH,溫育至少約10小時(shí)，例如至少過夜，用捕捉劑(通常在緩沖液諸如0.05M碳酸鈉中稀釋)包被板中的孔。如果期望更短的包被時(shí)間(l-2小時(shí))，那么可在37。C包被平板，或者平板可包含硝酸纖維素濾器底部，諸如例如MilliporeMULTISCREEN。在測(cè)定前可垛疊并包纟皮平板，使得以手動(dòng)、半自動(dòng)或自動(dòng)方式諸如通過4吏用機(jī)器人技術(shù)，對(duì)數(shù)份樣品同時(shí)進(jìn)行免疫測(cè)定。b)封閉通常用結(jié)合并飽和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉劑處理包被后的測(cè)定表面(固相)例如微量滴定板，以防止不想要的游離配體與固相過量結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。例如在檢測(cè)人把分子諸如人或人源化抗體的測(cè)定法中，非人哺乳動(dòng)物球蛋白可用作封閉緩沖液的封閉劑。封閉處理通常在環(huán)境穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，并持續(xù)約1-4小時(shí)，例如約1.5-3小時(shí)，或約2小時(shí)。c)力口樣在包被和封閉后，可將待分析的樣品(例如血清)稀釋到例如約10%,按體積計(jì)?？捎糜谙♂尩木彌_液包括例如(a)含有0.5%BSA,0.05%TWEEN2(FM洗滌劑(P20),5mMEDTA,0.25%Chaps表面活性劑，0.35MNaCl和0.05%Proclin-300的PBS磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),pH8.01;(b)含有0.5%BSA，0.05%Proclin-300和0.05%P20的PBS，pH7.3;(c)含有0.5%BSA,0.05%P20，0.05%Proclin-300，5mMEDTA和0.35MNaCl的PBS，pH6.39;(d)含有0.5%BSA,0.05。/。P20,0.05%Proclin-300,5mMEDTA,0,2%卩-丙種球蛋白，0.25%CHAPS和0.35MNaCl的PBS;(f)含有2%BSA,0,05%Proclin-300和0.05%P20的PBS,pH7.3;(g)含有0.5%BSA,0.05%Proclin-300和0.05%P20的PBS,pH7.3，0.1%TritonX-100;(h)含有0.5%BSA,0.05%Proclin-300和0.05%P20的PBS,pH7.3，0.1%Tween-80;(i)含有0.5%BSA,0.05%Proclin-300和0.05%P20的PBS，pH7.3,0.1%正辛基-b-D-葡糖吡喃糖苦。為了足夠的靈敏度，固定化的捕捉劑通常摩爾過量于在適當(dāng)稀釋后預(yù)計(jì)樣品中靶分子的最大摩爾濃度。取決于靶分子，捕捉劑可與檢測(cè)用抗體竟?fàn)幗Y(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，捕捉劑的終濃度應(yīng)通常憑經(jīng)驗(yàn)決定，以在所關(guān)心的范圍內(nèi)使測(cè)定的靈敏度最大化。在有些實(shí)施方案中，樣品緩沖液可含有額外的成分。例如，在有些實(shí)施方案中，可將哺乳動(dòng)物球蛋白諸如BGG添加到樣品緩沖液中。d)溫育選擇溫育樣品和捕捉劑的條件以使測(cè)定的靈敏度最大化，并使解離最小化。溫育時(shí)間主要取決于溫度，溫育時(shí)間通常隨溫度升高而縮短。溫育時(shí)間可以是例如過夜，可以在例如室溫。升高溫度例如升高至約30°C,可縮短溫育時(shí)間，例如縮短至約1-3小時(shí)。降低溫育溫度例如降低至約4°C,可延長溫育時(shí)間，例如延長至約24-48小時(shí)。如果樣品是生物學(xué)流體，那么可通過向樣品中添加蛋白酶抑制劑來延長溫育時(shí)間，以防止生物學(xué)流體中的蛋白酶降解分析物。選擇溫育緩沖液的pH以維持顯著水平的捕捉劑與所捕捉分析物的特異性結(jié)合。溫育緩沖液的pH通常為約6-9.5,例如約7-8。在該步驟中可使用多種緩沖液來達(dá)到并維持期望的pH,所述緩沖液包括硼酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或Tris-磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液等。具體采用的緩沖液通常并不重要；然而，在個(gè)別測(cè)定法中，某種緩沖液可能優(yōu)于其它緩沖液。e)洗滌可以用洗滌液將樣品與固定化的捕捉劑分開，以從體系中除去未捕捉的分析物。洗滌液通常是緩沖液，例如可以是上述溫育緩沖液之一。如上對(duì)溫育緩沖液所述決定洗滌液的pH,可以是約6-9,例如約7-8。洗滌可以進(jìn)行一次或多次。然而，將洗滌的次數(shù)減至最少能有助于保留與靶分子以低親和力結(jié)合的分子；然而，洗滌減至最少能提高測(cè)定的背景。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行了三次洗滌。洗滌液的溫度通常在約0-40。C,可以是約4-30°C?？梢岳米詣?dòng)化洗板機(jī)?？梢韵蛳礈煲褐刑砑咏宦?lián)劑或其它合適的試劑以將捕捉到的分析物共價(jià)附著于捕捉劑。f)檢測(cè)在例如通過洗滌從體系中除去未捕捉的靶分子之后，例如在室溫，可將捕捉到的耙分子與結(jié)合并能檢測(cè)捕捉到的靶分子諸如捕捉到的抗體的檢測(cè)劑接觸。當(dāng)靶分子是人源化治療用抗體時(shí)，檢測(cè)劑可以是例如不同物種的抗同種型抗體。如果治療用抗體是例如人IgG，檢測(cè)劑可以是鼠抗人IgG抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子是鼠單克隆抗體，檢測(cè)劑是綿羊抗小鼠IgG。輩巴分子與檢測(cè)劑接觸的溫度和時(shí)間主要取決于所采用的檢測(cè)手段。例如，在使用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶(HRP)的綿羊抗小鼠IgG作為檢測(cè)手段時(shí)，可將檢測(cè)劑與捕捉到的靶分子一起溫育約0.5-2小時(shí)，例如約1小時(shí)?？扇缟纤鰧?duì)體系進(jìn)行洗滌以從體系中除去未結(jié)合的檢測(cè)劑，并可通過添加過氧化物酶底物并在室溫溫育平板約5分鐘或直至可見清晰的顯色來顯影。在已從體系中洗去未結(jié)合的靶分子之后，通常向體系中添加摩爾過量的檢測(cè)劑。才企測(cè)劑可以是多克隆或單克隆抗體，可以是例如單克隆抗體，諸如鼠單克隆抗體。檢測(cè)劑可以是直接或間接可檢測(cè)的。如果檢測(cè)劑是不能直接檢測(cè)的抗體，例如未標(biāo)記的抗體，那么檢測(cè)抗體可通過添加摩爾過量的針對(duì)檢測(cè)抗體的同種型和動(dòng)物物種的已經(jīng)標(biāo)記的第二抗體來;f全測(cè)。g)親和力檢測(cè)劑的親和力必須是足夠高的，以致于能檢測(cè)到少量的靶分子。與常靈敏度。鑒于捕捉劑的結(jié)合親和力，必須考慮所選3奪的檢測(cè)劑的結(jié)合親和力，使得檢測(cè)劑不會(huì)將靶分子從捕捉劑上奪去。h)標(biāo)記物標(biāo)記物部分可以是不干擾捕捉到的靶分子與檢測(cè)劑結(jié)合的任何可檢測(cè)官能團(tuán)。合適的標(biāo)記物部分的例子包括可直接檢測(cè)的部分，諸如熒光染料、化學(xué)發(fā)光物和放射性標(biāo)記物，以及必須起反應(yīng)或衍生才能檢測(cè)的部分，諸如酶。這樣的標(biāo)記物的例子包括放射性同位素"P、"C、'251、3H和1311,熒光團(tuán)諸如稀土螯合物或焚光素及其衍生物、羅丹明及其^"生物、丹酰、傘形酮、螢光素酶例如螢火蟲螢光素酶、細(xì)菌螢光素酶(美國專利號(hào)4,737,456)、螢光素，2，3-二氫酞。秦二S同(dihydrophthalazinedione)，辣根過氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶，p-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，雜環(huán)氧化酶諸如尿酸酶和黃。票呤氧化酶，偶聯(lián)有利用過氧化氫來氧化染料前體的酶諸如HPP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶，生物素/親合素、生物素/鏈霉親合素、生物素/鏈霉親合素-(3-半乳糖香酶及MUG，自旋標(biāo)記物，噬菌體標(biāo)記物，穩(wěn)定的自由基等。標(biāo)記物部分與檢測(cè)劑諸如例如抗體的偶聯(lián)是免疫測(cè)定技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。參見例如O'Sulli糧等，1981,"MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay",in:MethodsinEnzymology,Langone和VanVunakis編,Vol.73,AcademicPress,NewYork,N.Y.,pp.147-166。常規(guī)方法可用來將標(biāo)記物部分與蛋白質(zhì)或多肽共價(jià)結(jié)合。例如，偶聯(lián)劑諸如二醛、碳二亞胺、二馬來酰亞胺(dimaleimide)、二亞氨酸酯(bis-imidate)、雙重氮化聯(lián)苯胺等可用于用上述熒光、化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記物標(biāo)記抗體。參見例如美國專利號(hào)3,940,475(焚光測(cè)定法)和3,645,090(酶)；Hunter等，1962,Nature,144:945;David等，1974,Biochemistry,13:1014-1021;Pain等，1981，J.ImmunolMethods,40:219-230;和NygrenJ.，1982,Histochem.andCytochem.,30:407-412。熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物可用于提高放大和靈敏度至約5-10pg/ml?？赏ㄟ^從固定相上洗去未結(jié)合的檢測(cè)劑，并使用適合于標(biāo)記物的檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)合到靶分子上的檢測(cè)劑的量，從而測(cè)定結(jié)合到捕捉劑上的靶分子的量。標(biāo)記物部分可以是例如酶。就酶部分而言，所形成的信號(hào)例如顏色的量是捕捉到的靶分子的量的直接度量。例如，當(dāng)HRP是標(biāo)記物部分時(shí)，通過在650nm吸光度定量光密度(O.D.)來檢測(cè)顏色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可間接測(cè)定結(jié)合到捕捉劑上的靶分子的量。可以用偶聯(lián)有標(biāo)記物部分的抗檢測(cè)劑抗體來放大未標(biāo)記檢測(cè)劑的信號(hào)供^:測(cè)。例如，可以用標(biāo)記有HRP的綿羊抗小鼠IgG抗體來放大結(jié)合到靶分子上的未標(biāo)記小鼠抗體的信號(hào)。使用適合于標(biāo)記物的檢測(cè)方法檢測(cè)標(biāo)記物部分。例如，可通過使HRP與比色底物反應(yīng)并在650nm吸光度測(cè)量反應(yīng)后底物的光密度來4全測(cè)HRP。2.橋連ELISA在常規(guī)的直接ELISA體系中，捕捉劑和檢測(cè)劑在結(jié)構(gòu)和/或物種上彼此不同。例如，捕捉劑可以是綿羊抗人IgG,而檢測(cè)劑則可包括山羊抗人IgG。在橋連ELISA體系中，捕捉劑和檢測(cè)劑在結(jié)構(gòu)和/或物種上類似，可以衍生自相同的多克隆抗體。在多種測(cè)定法中，已觀察到橋連ELISA顯示出降低的非特異性背景和背景變異。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，捕捉劑和檢測(cè)劑都包含相同的多克隆抗體，可以是或包含例如綿羊抗人IgG。E.使用非哺乳動(dòng)物丙種球蛋白的測(cè)定法對(duì)于需要高靈敏度的生物學(xué)基質(zhì)中樣品的測(cè)定法，通常需要靶特異性結(jié)合分子。靶特異性分子通常有助于降低測(cè)定背景和個(gè)體背景變異，并因此提供了高的測(cè)定靈敏度。雖然在目前的研究中，多克隆和單克隆抗rhuMAb2H7獨(dú)特型分子都正在開發(fā)中，但是研究計(jì)劃首先集中在開發(fā)使用能為rhuMAb2H7以高親和力特異性識(shí)別的CD20分子的針對(duì)rhuMAb2H7的測(cè)定法。這些研究計(jì)劃未能得到針對(duì)rhuMAb2H7的高靈敏度的和準(zhǔn)確的測(cè)定法。然而，下文實(shí)施例中所描述的研究發(fā)現(xiàn)了能夠以高靈敏度和準(zhǔn)確度定量非人血清中的抗體諸如rhuMAb2H7并且不依賴于任何把特異性分子的ELISA測(cè)定法。本文中所公開的方法提供了用于定量第二物種特別是密切相關(guān)物種的生物學(xué)基質(zhì)中第一物種分析物的通用方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法提供了對(duì)第二物種的生物學(xué)基質(zhì)中第一物種分子諸如人抗體、人源化抗體、嵌合抗體等的檢測(cè)和定量，所述第二物種的生物學(xué)基質(zhì)例如非人物種血清，諸如獼猴體液。本文中所公開的測(cè)定法無需使用對(duì)待檢測(cè)和/或定量的靶分子特異的捕捉劑(即靶特異性分子)，并可用于定量廣泛的分析物，包括人抗體、人嵌合抗體、人源化抗體、其片段等。這些方法具有廣泛的應(yīng)用，例如在人源化抗體藥動(dòng)學(xué)測(cè)定法開發(fā)中，尤其是在動(dòng)物研究必不可少但試劑不易獲得的藥物開發(fā)初期。當(dāng)不能獲得適當(dāng)?shù)陌刑禺愋苑肿訒r(shí)，如在本文所述的CD20用于檢測(cè)2H7治療用抗體的情況下，研究計(jì)劃可集中在盡可能的除去潛在干擾成分上。與沒有進(jìn)行預(yù)吸收的捕捉劑相比，用潛在干擾物質(zhì)預(yù)吸收捕捉劑能大大降低背景，例如由于存在血清蛋白質(zhì)所致的背景。在下文實(shí)施例中，所用捕捉劑綿羊抗人IgG(H+L)是用猴血清吸收的。與其它捕捉劑相比，其產(chǎn)生了相對(duì)較低的背景。然而，不管獼猴IgG非常類似于人IgG并且可能是干擾的主要成因的事實(shí)，發(fā)現(xiàn)僅僅除去捕捉劑中的獼猴IgG結(jié)合成分是不夠的。用純化自高背景個(gè)體的獼猴IgG進(jìn)一步吸收捕捉劑未能導(dǎo)致背景的進(jìn)一步降低，說明除IgG以外的血清蛋白質(zhì)也干擾測(cè)定。在個(gè)體獼猴血清間注意到的高背景變異也可能是除IgG本身以外的血清蛋白質(zhì)干擾之故。這些成分可具有不同的濃度和/或?qū)Σ蹲絼┑挠H和力，因此給出了高背景變異。雖然找到并除去血清中存在的所有干擾成分并不現(xiàn)實(shí)，但是研究使背景最大化以減低背景變異可作為免疫測(cè)定體系的策略。提高血清濃度是使背景最大化并降低背景變異的一種方法，然而，顯著提高背景亦降低了測(cè)定的靈敏度。如本文中所公開的，發(fā)現(xiàn)將非人丙種球蛋白(BGG)添加到封閉緩沖液中，顯著降低背景變異，血清背景僅有相對(duì)較小的升高。不受理論所限，認(rèn)為BGG與捕捉劑(例如綿羊抗人IgG(H+L))有弱相互作用，并導(dǎo)致背景的普遍升高，如測(cè)定空白所證實(shí)的。然而，該相互作用太弱以至于無法完全消除人IgG結(jié)合或者產(chǎn)生使用獼猴血清時(shí)的實(shí)質(zhì)性高背景。然而，發(fā)現(xiàn)向樣品和/或檢測(cè)劑稀釋緩沖液中添加BGG干擾人抗體才企測(cè)例如rhuMAb2H7檢測(cè)，導(dǎo)致信號(hào)降低。BGG與捕捉劑的相互作用掩蔽了捕捉劑的結(jié)合位點(diǎn)并且潛在的與檢測(cè)劑有相互作用，因此降低了絕對(duì)的rhuMAb2H7信號(hào)。另一方面，BGG和捕捉劑之間的相互作用稍強(qiáng)于獼猴血清蛋白質(zhì)和捕捉劑之間的相互作用，因此導(dǎo)致背景變異的降低。數(shù)個(gè)因素可潛在的促成人抗體例如rhuMAb2H7與BGG之間的更強(qiáng)相互作用，諸如纟爰沖液中相對(duì)較高的BGG濃度、BGG對(duì)人抗體例如rhuMAb2H7的更高親和力或這些因素的組合。發(fā)現(xiàn)從樣品和檢測(cè)劑緩沖液中都除去BGG提高絕對(duì)的人抗體信號(hào)例如rhuMAb2H7信號(hào)，并進(jìn)一步改善信噪比。該觀察結(jié)果與BGG掩蔽捕捉劑和檢測(cè)劑二者對(duì)人抗體例如rhuMAb2H7的有些結(jié)合位點(diǎn)的假說是一致的。因此，盡管在封閉步驟中使用BGG會(huì)產(chǎn)生更低的背景變異，但從緩沖液中除去BGG則會(huì)產(chǎn)生更高的信噪比。發(fā)現(xiàn)對(duì)于捕捉劑和檢測(cè)劑使用相同試劑(例如綿羊抗人IgG)的橋連格式較之常規(guī)的直接ELISA格式產(chǎn)生更低的背景和更小的個(gè)體血清背景變異。提出了一些可能的解釋。首先，因?yàn)闄z測(cè)劑綿羊抗人IgG也是用猴血清吸收的，因此與樣品溫育期間捕捉到的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)會(huì)減少了。其次，在檢測(cè)劑衍生自捕捉劑的橋連格式中，包含兩個(gè)相同結(jié)合位點(diǎn)的分析物得到優(yōu)先檢測(cè)。如預(yù)吸收實(shí)驗(yàn)所表明的，除IgG以外的獼猴血清蛋白質(zhì)也促成背景。然而，當(dāng)捕捉劑和檢測(cè)劑都衍生自相同的分子時(shí)，這些血清蛋白質(zhì)無法有效充當(dāng)橋接，因此它們?cè)跇蜻B格式中的識(shí)別會(huì)降至最低，導(dǎo)致血清背景的進(jìn)一步降低。如下文實(shí)施例所示，開發(fā)了具有高靈敏度的獼猴血清rhuMAb2H7PK測(cè)定法。沒有添加合并的獼猴血清的緩沖液成功用于樣品和檢測(cè)劑緩沖液，并且在緩沖液中也產(chǎn)生了標(biāo)準(zhǔn)曲線。該實(shí)踐降低了成本并簡(jiǎn)化了測(cè)定的準(zhǔn)備工作供自動(dòng)化，并將獲得/保持可比的試劑以確保結(jié)果可重現(xiàn)方面的潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步降至最低。該測(cè)定法是高度靈敏的，使用1:10的最小血清稀釋度。該測(cè)定法也是非?？煽康?，具有較小的批內(nèi)和批間測(cè)定變異性。對(duì)于rhuMAb2H7分子，在數(shù)項(xiàng)獼猴研究中以及在嚙齒類動(dòng)物物種的研究中，該測(cè)定法揭示了分子的藥動(dòng)學(xué)。本發(fā)明的測(cè)定法不依賴于任何特異性靶分子，并可用于定量多種分子，包括人/人源化IgG。如下文實(shí)施例所示，對(duì)本文中所公開的rhuMAb2H7測(cè)定法的開發(fā)來說重要的優(yōu)化，可將該測(cè)定法應(yīng)用于其它分子，包括其它人/人源化IgG。所述測(cè)定法具有普遍應(yīng)用并已用于例如測(cè)量猴、大鼠和小鼠血清中的rhuMAb2H7(見表1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在大鼠和小鼠中進(jìn)行的研究結(jié)果示于表1。使用本發(fā)明優(yōu)化的一般性(非耙特異性)測(cè)定法，數(shù)據(jù)顯示這兩個(gè)物種的高摻加回收率(spikerecovery)。此外，初步結(jié)果也表明可在其它非人靈長類動(dòng)物諸如狒狒、恒河猴和非洲綠猴的血清中檢測(cè)rhuMAb2H7(見表2)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2所示數(shù)據(jù)顯示這三種物種之間的回收率在81-93%范圍內(nèi)。提供下文實(shí)施例作為例示而非限制。說明書中所有51文的公開內(nèi)容在此明確收入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例l:預(yù)吸收以降低背景/變異1.預(yù)吸收以除去獼猴IgG交叉反應(yīng)性篩選多種捕捉劑供本發(fā)明所公開的方法使用。用獼猴血清吸收的綿羊抗人IgG重鏈(H)和輕鏈(L)(目錄號(hào)CUS1684)購自TheBindingSite(SanDiego,CA)并顯示出有希望的潛力。然而，如下文所討論的及表3所顯示的，使用該捕捉劑產(chǎn)生高且可變的背景。因此，在試圖降低背景和背景變異的嘗試中，用獲自問題(problematic)個(gè)體猴(高背景)血清的純化的獼猴IgG進(jìn)一步吸收經(jīng)猴血清吸收的綿羊抗人IgG(H+L)以進(jìn)一步除去捕捉劑中的任何IgG結(jié)合成分。首先使用HiTrap蛋白G柱(Pharmacia)遵循制造商推薦的流程純化獼猴IgG。筒言之，將柱子用水清洗并用20mM磷酸鈉pH7.0平衡。用注射器將約lml在初步篩選期間給出高背景的個(gè)體獼猴血清注射到柱子上。然后用5倍柱體積的20mM磷酸鈉緩沖液清洗柱子，并用0.1M甘氨酸pH2.7洗脫。洗脫液在4°C對(duì)PBS透析過夜，并通過280nm處的吸光度測(cè)量濃度，其中使用1.36的估算消光系數(shù)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)流程將純化的獼猴IgG偶聯(lián)至可控孔徑玻璃(CPG)珠。簡(jiǎn)言之，首先讓珠子在含有蒸餾水的蓋帽管(snap-captube)中膨脹。通過真空抽吸除去上清液并丟棄。將新鮮制備的1%偏高碘酸鈉以與濕珠子相同的體積添加到管中，將懸浮液在室溫輕輕旋轉(zhuǎn)30分鐘。在珠子沉降后，傾倒出上清液并用PBS洗滌珠子5次以除去過量的高碘酸鹽。將純化的獼猴IgG添加至活化后的珠子，并將懸浮液充分混合，然后讓珠子沉降。添加2毫克固體氰基硼氫化鈉，并將混合液在4。C混合40小時(shí)。將偶聯(lián)好的樹脂用PBS洗滌數(shù)次，然后用1M乙醇胺在pH8.0封閉過夜。然后將樹脂用PBS洗滌并貯存在PBS中。接著，依照如下流程用純化的獼猴IgG預(yù)吸收捕捉劑。將捕捉劑(100|il，lpg/ml，在碳酸鈉(pH9.6)中)添加到96孔樣t量滴定板的孔中，并將板在4。C溫育過夜以固定捕捉劑。然后將板用含有0.05%聚山梨醇酯-20的PBS洗滌3次。在1%或10%血清濃度下，用合并的獼猴IgG血清或合并的獼猴血清加來自一只或兩只傾向于產(chǎn)生高背景的個(gè)體猴的血清的組合吸收固定化捕才足劑，如表3所示。將緩沖液A(含有0.5%BSA，0.05%Tween-20和0.05%Proclin-300的PBS)添加到洗滌后的板中并在室溫溫育約2小時(shí)以封閉板。將板洗滌3次并吸干。緩沖液A也用來稀釋樣品和4企測(cè)劑。2.結(jié)果表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>a捕捉劑是獲自TheBindingSite(SanDiego,CA)的綿羊抗人IgG重鏈(H)和輕鏈(L)(目錄號(hào)CUS1684)。該市售捕捉劑是已用獼猴血清預(yù)吸收的。因此，列于該欄中的預(yù)處理指額外的預(yù)處理吸收步驟。如表3所示，用1%獼猴血清預(yù)吸收捕捉劑產(chǎn)生0.181O.D.的平均背景，大大低于10%血清的(0.308O.D.)。然而，使用1%血清的背景變異卻極高，具有85的CV%。見表3。使用10%血清時(shí)觀察到的變異更低，說明使用更高濃度的血清有使背景最大化的效果。來自獼猴血清的背景可能由結(jié)合捕捉劑的非特異性蛋白質(zhì)所引起。因?yàn)檫@些非特異性蛋白質(zhì)在個(gè)體獼猴血清中以不同濃度存在，因此有助于個(gè)體血清背景的變異。進(jìn)一步稀釋血清可降低背景變異和平均血清背景，但會(huì)使得用于PK分析的測(cè)定法不夠靈敏。與此相反，表3所示數(shù)據(jù)指出提高血清濃度導(dǎo)致背景變異受到抑制。當(dāng)捕捉劑變成限制性試劑時(shí)，隨著在測(cè)定法中所使用的血清百分比的增加，板上捕捉到的非特異性相互作用蛋白質(zhì)的總量就會(huì)增加直至達(dá)到最大量。由于非特異性相互作用通常是弱的，因此最大信號(hào)可低到足以產(chǎn)生可使用的測(cè)定法。然而，使用10。/。獼猴血清時(shí)，個(gè)體背景變異仍然非常高，即使其大大低于使用1%血清時(shí)的變異。使用超過10%的血清濃度可進(jìn)一步抑制變異，但由于在測(cè)定進(jìn)行中其自身能造成另外的考驗(yàn)(challenge)，有可能產(chǎn)生甚至更高的背景?？偠灾?，對(duì)于使個(gè)體獼猴血清背景的變異降至最低，用獼猴IgG預(yù)吸收捕捉劑抗體以進(jìn)一步除去捕捉劑中的任何IgG結(jié)合成分不會(huì)產(chǎn)生任何明顯的改善。該觀察結(jié)果說明使用目前的格式，個(gè)體血清背景的變異是由獼猴免疫球蛋白以外的蛋白質(zhì)引起的。實(shí)施例2:封閉緩沖液中的BGG(牛丙種球蛋白)分析BGG在封閉緩沖液、樣品稀釋劑和檢測(cè)劑稀釋劑中的用途，以測(cè)定背景水平和背景變異是否能得到改善。綿羊抗人IgG重鏈(H)和輕鏈(L)捕捉劑(目錄號(hào)CUSWM)和綿羊抗人IgG(H+L)HRP偶聯(lián)物檢測(cè)劑(目錄號(hào)CUS1684.H)購自TheBindingSite(SanDiego,CA)?？赏ㄟ^已知方法產(chǎn)生人源化mAb。rhuMAb2H7如WO04/056312中所述產(chǎn)生。Herceptin、Xolair、AvastinTM和Raptiva⑧分別依照Carter等，PNAS89:4285-4289(1992),美國專利號(hào)6,172,213，Presta等，CancerResearch57:4593-4599(1997)和美國專利號(hào)6,037,454中所述的流程產(chǎn)生。山羊抗人IgG(H+L)辣根過氧化物酶(HRP)(檢測(cè)劑)購自AmericanQualex(SanClemente,CA)。個(gè)體獼猴血清獲自BiochemMed(VA)。MaxisorpNunc免疫用96孔孩i量滴定板購自NalgeNuncInternational(Rochester,NY)。HRP檢測(cè)劑底物3,3，,5,5，-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)和H202獲自KPL(Gaithersburg,MA)。牛血清清蛋白(bovuminarCohn級(jí)分V,pH7)獲自SerologicalsCorp(目錄號(hào)3322-90,Ontario,Canada),Proclin300來自Supelco(Bdlefonte，PA)。含有1%聚山梨醇酯20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的20x溶液購自MediaTechCellgro(Herndon,VA)。牛y-免疫球蛋白(BGG)和3-[(3-膽胺基丙基)二曱氨基]-l-丙烷磺酸(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1—propane-sulfonate，CHAPS)渚卩來自Sigma(St.Louis,MO)。來自Bio-TekInstruments,Inc.(Winooski,VT)的EL404微量滴定板自動(dòng)清洗機(jī)用于ELISA中的所有洗滌步驟。SpectraMax250讀板4義(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)用于記錄ELISA中的信號(hào)，其中使用450nm處的吸光度減去650nm處的吸光度。1.ELISA的格式吸收綿羊抗人IgG(重鏈+輕鏈)以除去獼猴IgG交叉反應(yīng)性a.將捕捉劑施于測(cè)定表面及捕捉劑的預(yù)吸收將100^1體積的(碳酸鈉(pH9.6)中的l嗎/ml綿羊抗人IgG(H+L))捕捉劑添加至96孔微量滴定板，并將板在4。C溫育過夜。然后將板用洗滌緩沖液(含0.05%聚山梨醇酯-20的PBS)洗滌3次。b.加樣至捕捉劑將封閉緩沖液(200(^1PBS/0.5%BSA/0.05%P20，0.05%Proclin300,0.25%CHAPS,0.2%BGG，5mMEDTA,0.35MNaCl,pH8.0)添加至洗滌后、經(jīng)預(yù)吸收的捕捉劑。將板密封并在室溫輕輕振蕩溫育2小時(shí)。洗滌3次并吸干后，將lOOiil緩沖液(與封閉緩沖液具有相同組成)中的rhuMAb2H7標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照、血清空白和血清樣品添加至板。隨后，將板用封板機(jī)密封。在室溫輕輕振蕩溫育又一小時(shí)后，將板用洗滌緩沖液洗滌6次并吸干。c.使用檢測(cè)劑定量樣品分析物添加稀釋的檢測(cè)劑(100^1)，將板密封并在室溫輕輕振蕩溫育1小時(shí)。然后將板再洗滌6次并吸干，然后添加100|il等體積的TMB和H202。在室溫不振蕩溫育15分鐘后，通過添加另外lOO[il1MH3P04來終止反應(yīng)。從SpectraMax250讀+反4義(MolecularDevicesCorporation,CA)讀出吸光度，^!夸450nm處的吸光度減去650nm處的吸光度，并使用制造商提供的SoftmaxPro軟件處理數(shù)據(jù)。2.在所有緩沖液(封閉緩沖液、樣品緩沖液和檢測(cè)緩沖液)中使用BGG在建立對(duì)背景變異的更好控制的同時(shí)將測(cè)定背景降至最低的進(jìn)一步嘗試中，制備了數(shù)種含有不同緩沖液添加物包括BGG(牛丙種球蛋白)的緩沖液溶液(表4所示緩沖液A-E),并用于封閉緩沖液、樣品緩沖液和4企測(cè)劑緩沖液中。然后在如上所述的ELISA測(cè)定法中篩選這些緩沖液以確定它們降低背景和變異的效力。數(shù)據(jù)示于表4。表4緩沖液緩沖液添加物PH信號(hào)3測(cè)定空白4平均值5cv%6無7.302.0410.0120.08347B15mMEDTA0.35MNaCl6.391.9110.0070.05862C15mMEDTA0.35MNaCl0.25%CHAPS0.2%BGG8.011.8780.1130.14222D15mMEDTA8.981.7240.1420.16518<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>1基礎(chǔ)緩沖液成分是PBS/0.5%BSA,0.05%Tween-20和0.05%Proclin-300。2基礎(chǔ)緩沖液成分是55mMHEPES/0.5%BSA,25mMHEPES鈉鹽，2%TritonX-100和0.05%Proclin畫300。3于240ng/mlrhuMAb2H7濃度，在450-650nm處的O.D.測(cè)量值，n=8。4在450-650nm處的O.D.測(cè)量值，n=8。5在450-650nm處測(cè)量的平均血清背景。6背景的CV%。表4列出了每種緩沖液的成分。制備緩沖液A作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定緩沖液，其含有0.5%BSA,0,05%Tween-20和0.05%Proclin-300。制備緩沖液C和D,它們具有與緩沖液A相同的成分，但含有列于表4的緩沖液添加物，包括BGG。對(duì)于所有試驗(yàn)，N=8。在如上所述ELISA測(cè)定法中測(cè)試緩沖液。緩沖液用于在包被捕捉劑(綿羊抗人IgG(H+L)，猴血清吸收的)后封閉板，及用于稀釋樣品(10。/。個(gè)體獼猴血清和rhuMAb2H7)和檢測(cè)劑(山羊抗人IgG.HRP)。列于表4中的測(cè)定空白指不含血清或rhuMAb2H7的緩沖液樣品。3.結(jié)果使用ELISA在不同的緩沖液條件下比較rhuMAb2H7信號(hào)和測(cè)定空白與10%獼猴血清二者的測(cè)定背景。在所篩選的緩沖液中，與常規(guī)測(cè)定稀釋劑A相比，僅有緩沖液B降低了平均血清背景和測(cè)定空白背景(表4)。然而，個(gè)體獼猴血清之間的變異達(dá)到62%,高于使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定稀釋劑A時(shí)的變異(47%)。還發(fā)現(xiàn)緩沖液E與測(cè)定空白相比降低背景。正如觀察到的平均血清背景升高所指出的，該緩沖液似乎增強(qiáng)獼猴血清和捕捉劑/檢測(cè)劑之間的非特異性相互作用。由于觀察到的個(gè)體血清背景變異類似于緩沖液A(表4)，因此對(duì)于該實(shí)驗(yàn)中的所有個(gè)體獼猴該增加是類似的。緩沖液C和D包含相同的緩沖液組成，但具有不同的pH值(分別為8.98和8.01)。緩沖液C和D都引起測(cè)定空白背景的增加，表明一種或多種緩沖液成分與捕捉劑和檢測(cè)劑二者有弱相互作用。由于這些緩沖液含有額外的添加物，因此平均獼猴血清背景的增加并不令人驚訝。在使用緩沖液C和D時(shí)，個(gè)體獼猴血清之間的變異分別顯著下降22%和18%(表4)。該降低可能由緩沖液添加物和捕捉劑A全測(cè)劑之間的額外相互作用引起，因?yàn)樵撓嗷プ饔檬贡尘斑_(dá)到最大，掩蔽了個(gè)體猴血清的差異以產(chǎn)生降低的背景變異。同樣，如表4所見，緩沖液C和D各自背景和測(cè)定空白之間的差異顯著縮小。該背景和測(cè)定空白之間的狹小差異結(jié)合使用這些緩沖液獲得的血清背景變異降低的觀察結(jié)果，說明在使用緩沖液C和D時(shí)，與存在于這些緩沖液中的額外成分的貢獻(xiàn)相比，來自獼猴血清與捕捉劑/檢測(cè)劑的非特異性相互作用對(duì)血清背景貢獻(xiàn)較小。當(dāng)使用緩沖液C和D時(shí)，主要背景貢獻(xiàn)物的改變引起個(gè)體血清之間變異降低，并使血清背景與測(cè)定空白密切相似。該結(jié)果使單獨(dú)使用測(cè)定緩沖液來稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品成為可能，消除了尋找用于添加到緩沖液中的合適且代表性的合并獼猴血清的需要。還發(fā)現(xiàn)與緩沖液C(8.01)相比，緩沖液D更高的pH(8.98)引起個(gè)體獼猴血清變異的進(jìn)一步降低(表4)。使用緩沖液C和D也降低rhuMAb2H7信號(hào)(表4)。對(duì)于該觀察結(jié)果一種可能的解釋是這些緩沖液中額外的添加物與檢測(cè)劑的相互作用有效掩蔽了rhuMAb2H7的檢測(cè)，導(dǎo)致信號(hào)降低。由于捕捉劑和檢測(cè)劑之間的相似性(來自兩種不同物種的抗人IgG),因此緩沖液C和D中額外的添加物能與這兩種試劑都相互作用并不令人驚訝。4.優(yōu)化緩沖液D以恢復(fù)rhuMAb2H7信號(hào)在恢復(fù)rhuMAb2H7信號(hào)的嘗試中，著手進(jìn)行緩沖液D中每種添加物貢獻(xiàn)的系統(tǒng)勘探以分離出導(dǎo)致信號(hào)降低的參數(shù)。緩沖液D含有四種不存在于緩沖液A中的額外添加物。制備緩沖液A1-A4,各自具有一種不存在于原始緩沖液A中的來自緩沖液D的額外添加物。測(cè)量檢測(cè)劑稀釋步驟中額外添加物對(duì)信噪比的影響。綿羊抗人IgG(H+L)(用猴血清吸收的)用作捕捉劑。檢測(cè)劑是山羊抗人IgG(H+L)參HRP。緩沖液組成如表4所述。結(jié)果示于表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如上所述進(jìn)行ELISA，并在檢測(cè)劑稀釋步驟中使用新的緩沖液。計(jì)算信號(hào)(240ng/mlrhuMAb2H7)和噪聲(10%獼猴血清背景)的光密度(O.D.)測(cè)量值。還對(duì)每種緩沖液計(jì)算了信噪比(表5)。正如預(yù)期，高鹽、金屬螯合劑諸如EDTA、和洗滌劑(CHAPS)各自降低了背景。與使用親本緩沖液A所獲得的信號(hào)相比(表3)，這些添加物還降低rhuMAb2H7的信號(hào)，但程度小于背景降低的量?？偠灾?，添加物提高了信噪比(表5)。然而，將BGG添加到親本緩沖液A中導(dǎo)致獼猴血清背景和rhuMAb2H7信號(hào)都增力口。使用緩沖液A2(含有BGG的緩沖液)時(shí)血清背景的增長大于rhuMAb2H7信號(hào)的增長，使得信噪比下降至約16,相比之下親本緩沖液中的信噪比為約20。為證實(shí)這些觀察結(jié)果，將緩沖液A、Al、A2、A3和A4用等體積的緩沖液A稀釋，然后用于檢測(cè)劑稀釋步驟。對(duì)稀釋和未稀釋的緩沖液計(jì)算信噪比。結(jié)果概述于圖2,顯示與親本緩沖液A相比，緩沖液A1、A3和A4都產(chǎn)生了改善的信噪比。與稀釋的緩沖液相比，未稀釋的緩沖液產(chǎn)生了稍大一些的信噪比改善。然而，與未稀釋的緩沖液A2相比，稀釋的A2緩沖液產(chǎn)生了更高的信噪比，盡管其仍然低于親本緩沖液A(圖2)。來自緩沖液C和D中額外添加物的系統(tǒng)評(píng)估的這些觀察結(jié)果說明從檢測(cè)劑稀釋步驟中除去BGG可恢復(fù)rhuMAb2H7信號(hào)，同時(shí)還改善信噪比。為檢驗(yàn)該假說，制備緩沖液Dl,其具有與緩沖液D相同的成分，只是它缺少BGG。然后，將緩沖液D1用于ELISA測(cè)定法的檢測(cè)劑稀釋步驟中。正如預(yù)期，與緩沖液D相比，緩沖液Dl產(chǎn)生了高得多的rhuMAb2H7信號(hào)和信噪比(表5和圖2)。另一個(gè)測(cè)定法旨在測(cè)定從樣品稀釋劑中除去BGG的影響。該測(cè)定法的樣品緩沖液稀釋劑含有10%獼猴血清和256ng/ml2H7。如實(shí)施例2所述進(jìn)行ELISA,但使用橋連格式，其中捕捉劑和檢測(cè)劑都包括綿羊抗人IgG(H+L)。如實(shí)施例1所述用猴血清預(yù)吸收捕捉劑。緩沖液D用作封閉緩沖液和樣品緩沖液稀釋劑。當(dāng)緩沖液D用作檢測(cè)劑稀釋劑時(shí)，測(cè)定法的信噪比為39，而當(dāng)使用緩沖液D1時(shí)，信噪比為44。因此，從樣品稀釋步驟中除去BGG進(jìn)一步提高了信噪比。發(fā)現(xiàn)對(duì)于每種樣品和檢測(cè)劑，緩沖液D(含有BGG)用于封閉步驟和緩沖液D1(缺少BGG)作為測(cè)定稀釋劑的組合給出了最好的測(cè)定表現(xiàn)，包括個(gè)體獼猴血清變異低和信噪比高。實(shí)施例3:橋連ELISA和直接ELISA的比較實(shí)施例2中所描述的測(cè)定法是直接ELISA流程，其中檢測(cè)劑不同于捕捉劑。其中檢測(cè)劑和捕捉劑包含相同試劑(諸如相同抗體)的橋連ELISA已知在有些測(cè)定中產(chǎn)生降低的非特異性背景。測(cè)試橋連格式測(cè)定體系以與直接ELISA流程比較所得到的背景和背景變異。在兩種稀釋劑中進(jìn)行使用不同檢測(cè)劑的獼猴血清背景和變異的比較。山羊抗人IgG(H+L)HRP和猴血清吸收的綿羊抗人IgG(H+L)*HRP各自分別用于直接和橋連格式。綿羊抗人IgG(H+L)用作捕捉劑。緩沖液D用于封閉板及稀釋樣品。如實(shí)施例2所述進(jìn)行ELISA測(cè)定法。將rhuMAb2H7樣品摻入每次實(shí)驗(yàn)中以確保陽性試樣具有類似的信號(hào)。結(jié)果示于表6。來自6個(gè)個(gè)體獼猴的10%血清背景的篩選說明橋連格式產(chǎn)生更低的血清背景及降低的個(gè)體血清背景變異(表6)。重復(fù)橋連格式ELISA以測(cè)定親本緩沖液A是否能代替實(shí)施例2中所描述的檢測(cè)劑稀釋劑Dl。左右比較說明即使使用橋連格式，需要含有緩沖液Dl的額外添加物(如BGG)的緩沖液來保持低背景變異，盡管緩沖液A給出了低得多的平均獼猴血清背景(表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>還使用直接ELISA格式執(zhí)行上文所描述的測(cè)定方法，其中捕捉劑是猴血清吸收的綿羊抗人IgG,檢測(cè)劑是山羊抗人IgG(H+L)。結(jié)果示于表7。在該測(cè)定法中，與這三種緩沖液的一種或多種中缺少BGG時(shí)得到的50%-63%的CV。/。相比，每種緩沖液都使用緩沖液D(含有BGG)產(chǎn)生21%的CV%。該數(shù)據(jù)說明在使用直接ELISA格式時(shí)，BGG可以是每一種封閉緩沖液、樣品稀釋劑緩沖液和檢測(cè)劑稀釋劑緩沖液中的有用成分。對(duì)于在直接ELISA格式中的所有三種緩沖液中使用BGG所觀察到的陽性結(jié)果，一種可能的解釋是由于BGG與捕捉劑的弱相互作用，因此如果BGG不包含在樣品稀釋劑緩沖液中，其可被洗去。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>為測(cè)定測(cè)定法中捕捉劑的最佳濃度，在測(cè)定法中篩選0.25(ig/ml至2jig/ml濃度的捕捉劑。0.25和0.5嗎/ml的捕捉劑濃度產(chǎn)生了不能接受的低響應(yīng)，而l-2嗎/ml的濃度則產(chǎn)生了良好的響應(yīng)曲線?？紤]到高靈4丈度和經(jīng)濟(jì)利益二者，將抗體的最佳濃度確定為l嗎/ml。實(shí)施例4:測(cè)定rhuMAb2H7獼猴血清PK測(cè)定法的靈敏度、準(zhǔn)確度和線性在評(píng)估條件之后，使用包括測(cè)定靈敏度、準(zhǔn)確度和線性的數(shù)項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)分析使用橋連ELISA格式，緩沖液D作為封閉緩沖液及緩沖液Dl作為樣品和檢測(cè)緩沖液的優(yōu)化后測(cè)定法的品質(zhì)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>1.標(biāo)準(zhǔn)曲線值域(range)和靈敏度:在1.56ng/nl至400ng/ml范圍內(nèi)產(chǎn)生緩沖液中rhuMAb2H7的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。為了確定定量的下限和上限(分別為LLOQ和ULOQ)，制備在10%獼猴血清中摻入不同濃度的rhuMAb2H7摻加樣品。制備等分試樣并在分析之前保持冷凍以模擬真實(shí)樣品的貯存條件。對(duì)每一濃度的20^分樣品進(jìn)行持續(xù)4天的分析。每一濃度的方差分量(variancecomponent)概述于表8中?；诜讲罘至糠治?，確定了LLOQ和ULOQ分別為1.56ng/ml和100ng/ml。2.測(cè)定法的準(zhǔn)確度為確定測(cè)定法的準(zhǔn)確度，將rhuMAb2H7以低(15.6ng/ml)、中(300ng/ml)和高(1000ng/ml)濃度摻入緩沖液或個(gè)體獼猴血清。將樣品稀釋至1:10并分析。獼猴血清樣品的回收率用緩沖液回收率校正并概括在表9中。在所測(cè)試的三個(gè)不同濃度，rhuMAb2H7的摻入回收率具有91%、87%和95%的平均值，CV。/。在2%-8°/。范圍內(nèi)。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>3.稀釋的線性來自PK研究的真實(shí)樣品將具有寬泛的huMAb2H7濃度，因此需要在數(shù)個(gè)待分析步驟中稀釋到測(cè)定范圍內(nèi)。為評(píng)估是否能在大的稀釋倍數(shù)之后準(zhǔn)確的測(cè)定濃度，進(jìn)行試驗(yàn)以檢驗(yàn)測(cè)定法的線性。在該實(shí)驗(yàn)中，rhuMAb2H7以兩個(gè)不同濃度(1000和300ng/ml)一參入個(gè)體獼猴血清，并在每個(gè)樣品連續(xù)稀釋度比較通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定并經(jīng)過稀釋校正的濃度。每份連續(xù)稀釋樣品的稀釋校正后濃度值的百分比差異小于18%,說明樣品在檢驗(yàn)范圍內(nèi)是線性稀釋的。4.批內(nèi)測(cè)定和批間測(cè)定精度為確定批內(nèi)測(cè)定和批間測(cè)定精度，通過將rhuMAb2H7稀釋到純獼猴血清中來制備濃度為30、300和800ng/ml的對(duì)照樣品。用同一天內(nèi)、不同板上新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析各組對(duì)照的一式多份的樣品，該程序重復(fù)數(shù)天。計(jì)算對(duì)照樣品在每種濃度的方差分量(。/。CV)，并示于表IO。"批內(nèi)測(cè)定精度"指在同一天的實(shí)驗(yàn)中對(duì)每種濃度獲得的CV%,而"批間測(cè)定精度'，則是使用數(shù)天數(shù)據(jù)獲得的CV%。表10:批內(nèi)測(cè)定和批間測(cè)定精度的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實(shí)施例5:測(cè)定法對(duì)其它抗體的適用性a.使用測(cè)定法來產(chǎn)生各種人源化抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線在實(shí)施例1-4所述測(cè)定法中所使用的試劑都不是對(duì)rhuMAb2H7特異的。為確定該測(cè)定法是否可用于定量其它人源化抗體，將以緩沖液D作為封閉緩沖液和1￡沖液Dl作為樣品和4全測(cè)劑緩沖液的實(shí)施例1-4所述rhuMAb2H7獼猴橋連ELISAPK測(cè)定法用于產(chǎn)生數(shù)種其它人源化抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述人源4b抗體包4舌AvastinTM、Raptiva、Xolair⑧和Herceptin。圖3和4所示結(jié)果證明了使用本發(fā)明的測(cè)定法，測(cè)試的所有抗體得到高特異性的定量并顯示出良好的交叉反應(yīng)性。b.使用非靶特異性橋連ELISA測(cè)定法來定量1%和10%獼猴血清中的Herceptin表11<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>1使用Herceptin特異性測(cè)定法的摻加回收率(％)。2使用rhuMAb2H7測(cè)定法的Herceptin摻加回收率(％)。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)本文所述測(cè)定法的有用性，并排進(jìn)行以緩沖液D作為封閉緩沖液及緩沖液Dl作為樣品和檢測(cè)劑緩沖液的實(shí)施例1-4所述橋連ELISA測(cè)定法及針對(duì)Herceptin的靶特異性測(cè)定法，以定量1%和10%獼猴血清中的Herceptin。該靶特異性測(cè)定法使用HER2的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)作為捕捉劑，山羊抗人Fc'HRP作為檢測(cè)劑。將不同濃度的Herceptin摻入1%和10%獼猴血清，并用兩種不同測(cè)定法來測(cè)量回收率。比較的結(jié)果示于表ll。在測(cè)試的所有濃度，兩種測(cè)定法都給出了非常相似的Herceptin纟參加回收率。c.在本發(fā)明優(yōu)化后的橋連ELISA格式測(cè)定法中使用山羊抗人IgG來檢測(cè)mAb2H7表12<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>110%獼猴血清的O.D.。2(高于50ng/ml2H7的O.D.)。3(低于1.56ng/ml2H7的O.D.)。410%獼猴血清中30ng/ml2H7的回收率。為檢驗(yàn)其它多克隆抗人IgG是否能代替綿羊抗人IgG作為捕捉劑，使用山羊抗人IgG作為捕捉劑進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)定。用2H7柱及隨后可有可無的獼猴血清蛋白質(zhì)柱純化獲自用mAb2h7免疫的山羊的抗血清。在兩種測(cè)定法中比較獼猴血清背景，其中測(cè)定法#1使用僅用2H7柱純化的試劑，而測(cè)定法#2使用用兩種柱純化的試劑。這兩種方法都使用橋連格式，及實(shí)施例1-4中所討論的優(yōu)化后的測(cè)定法的緩沖液體系(以緩沖液D作為封閉緩沖液及緩沖液Dl作為樣品和檢測(cè)緩沖液)。結(jié)果概述于表12。結(jié)果顯示在本發(fā)明的測(cè)定法中，其它多克隆抗人IgG能成功用作捕捉劑。還對(duì)來自另外物種的血清評(píng)估了100ng/mlrhuMAb2H7在10%血清中的摻入回收率，所述血清來自嚙齒類動(dòng)物或其它非人靈長類動(dòng)物。結(jié)果概述于表13。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示非靶特異性測(cè)定法不僅在獼猴血清中準(zhǔn)確檢測(cè)出rhuMAb2H7，而且還在包括大鼠、小鼠、狒狒、非洲綠猴和恒河猴的其它血清中準(zhǔn)確檢測(cè)出rhuMAb2H7。實(shí)施例6:使用含有BGG的緩沖液D作為封閉緩沖液與使用其它封閉劑溶液的非把特異性直接ELISA格式huMAb2H7獼猴血清PK測(cè)定法的比較.表14<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>之前已顯示高濃度的BSA和添加明膠有效控制背景(Pruslin等，1991;Harlow等，1988)。因此，在使個(gè)體獼猴血清的背景和背景變異降至最低的嘗試中，在使用BGG之外測(cè)試封閉緩沖液和樣品/檢測(cè)緩沖液的不同條件(如實(shí)施例2中所述)。這些測(cè)試是使用以綿羊抗人IgG(H+L)(用猴血清吸收的)作為捕捉劑和山羊抗人IgG(H+L)HRP作為檢測(cè)劑的直接ELISA格式進(jìn)行的。使用測(cè)定稀釋劑來稀釋樣品和;險(xiǎn)測(cè)劑。洗滌步驟、溫育時(shí)間及一企測(cè)步驟如實(shí)施例2中所述。結(jié)果示于表14。數(shù)據(jù)說明雖然所測(cè)試的封閉溶液中的有些成分可以降低背景，沒有一種溶液產(chǎn)生顯著降低的獼猴血清背景。因此，似乎容易得到的緩沖液不足以解決高背景的問題，甚至使用業(yè)已開發(fā)的改良的捕捉劑(綿羊抗人IgG(H+L),用猴血清吸收的)也不行。此外，市售封閉溶液Superblock和酪蛋白(都來自Pierce)也在背景水平方面產(chǎn)生很小的改善。最后，含有0.1%洗滌劑TritonX-IOO、Tween-80和正辛基-(3-D-葡糖吡喃糖苷的封閉溶液產(chǎn)生與用0.05%Tween-20所獲得的結(jié)果類似的獼猴血清背景。實(shí)施例7:在封閉緩沖液中使用魚膠和哺乳動(dòng)物IgG進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以確定在本文所述測(cè)定法中BGG是否能為魚膠或其它哺乳動(dòng)物免疫球蛋白包括小鼠IgG、兔IgG、驢IgG所代替。以類似于實(shí)施例2所述的流程進(jìn)行該測(cè)定法，但使用橋連ELISA格式。綿羊抗人IgG(l嗎/ml，用猴血清預(yù)吸收的)用作捕捉劑。魚膠或其它哺乳動(dòng)物免疫球蛋白代替BGG用于封閉緩沖液和/或樣品緩沖液及檢測(cè)劑緩沖液。結(jié)果示于表15。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>信號(hào)21.151.041.630.090.060.380.3410%獼猴血清的平均值015015S/N76.894.2110%獼猴血清背景的cv%。2240ng/ml2H7的信號(hào)。256ng/ml2H7的信號(hào)。結(jié)果表明與靶特異性捕捉測(cè)定法所獲得的信號(hào)相比，在封閉緩沖液中使用魚膠、驢IgG、兔IgG或小鼠IgG產(chǎn)生顯著更高的信號(hào)。在封閉緩沖液中使用這些試劑時(shí)所產(chǎn)生的信號(hào)顯著低于使用BGG獲得的信號(hào)。該數(shù)據(jù)還揭示了在使用橋連格式ELISA的測(cè)定中，當(dāng)封閉緩沖液中不存在BGG時(shí)，通過CV。/。測(cè)量的背景變異顯著升高了(表15)。同樣有趣的是在橋連ELISA格式中，與在封閉緩沖液及樣品緩沖液和檢測(cè)劑緩沖液二者中使用BGG相比，從樣品緩沖液和;險(xiǎn)測(cè)劑緩沖液中除去BGG,但在封閉緩沖液中保留BGG,產(chǎn)生了更高的信噪比，即使血清背景變異(CV。/o)仍然類似(表15)。實(shí)施例8:CD20肽和全長CD20對(duì)rhuMAb2H7的結(jié)合親和力一般而言，定量體液諸如血清中靶分子濃度的藥動(dòng)學(xué)(PK)測(cè)定法需要一種或多種靶特異性分子來充當(dāng)捕捉劑。因此，在當(dāng)前研究過程中，通過使用對(duì)于rhuMAb2H7靶特異性的可溶性CD20肽作為捕捉劑，進(jìn)行了開發(fā)獼猴rhuMAb2H7PK測(cè)定法的嘗試。合成全長CD20多肽以及類似CD20的C-末端胞外結(jié)構(gòu)域的肽，并評(píng)估它們?cè)趓huMAb2H7測(cè)定法中的有用性。合成四種CD20肽(1)以二硫鍵環(huán)化的單生物素35聚物，序列為[SEQIDNO:l]生物素-FIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSGGK-酰胺，(2)以二辟d建環(huán)化的雙生物素35聚物，序列為[SEQIDNO:2])-酰胺，(3)以二碌^建環(huán)化的單生物素51聚物，序列為[SEQIDNO:3]生物素SGGK-酰胺，和(4)以二石jU建環(huán)化的雙生物素51聚物，序列為[SEQIDN0:4]生物素SGGK(生物素)-酰胺c1.CD20ECD肽的合成使用固相方法，利用Fmoc胺保護(hù)在rink酰胺樹脂上合成CD20肽。該合成在ABI的Pioneer肽合成儀上于N,N-二曱基甲酰胺中進(jìn)行，使用4個(gè)當(dāng)量的氨基酸、4個(gè)當(dāng)量的HBTU和5個(gè)當(dāng)量的二異丙基乙胺，偶聯(lián)時(shí)間為1小時(shí)。在兩個(gè)偶聯(lián)循環(huán)后，使用N,N-二甲基曱酰胺中的10。/。哌咬除去Fmoc。使用溶解于具有4個(gè)當(dāng)量的PyBOP的1:1二曱亞砜:二甲基曱酰胺中的4個(gè)當(dāng)量的生物素和5個(gè)當(dāng)量的二異丙基乙胺將生物素偶聯(lián)到游離的氮上過夜。通過用DMF中的5%肼處理來除去C-末端賴氨酸s-氮上的ivDde，緊接著進(jìn)行生物素附著，從而附著C-末端生物素。通過在具有5%三異丙基硅烷的TFA中搖動(dòng)1小時(shí)從樹脂上切下肽。經(jīng)過濾分離樹脂并在減壓下除去TFA。肽用乙醚沉淀并通過HPLC測(cè)序純化，其中使用含有0.1%TFA的0-60水乙腈梯度的。在凍干后所獲得的純化的肽為白色粉末。肽的LCMS產(chǎn)生了單峰，顯示該肽具有預(yù)測(cè)的質(zhì)量。2.CD20全長分子的表達(dá)和純化材料所有洗滌劑都獲自AnatraceInc.(Maumee,OH)。除非另有說明，所有化學(xué)藥品都獲自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。Rituximab(C2B8)如美國專利號(hào)5,736,137中所披露的產(chǎn)生?？寺『捅磉_(dá)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubel等編，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2003))將人和鼠CD20的cDNA亞克隆到BR322衍生的質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒含有P-內(nèi)酰胺酶基因和三種大腸桿菌罕用密碼子的tRNA基因(arg"、gfyr和pra2)。將MKHQHQQ短序列添加到CD20的N-末端以確保高翻i奪起始，并將8個(gè)組氨酸的序列置于C-末端以幫助;險(xiǎn)測(cè)和純化。在；/zov4啟動(dòng)子控制下進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄。通過在C.R.A.P.磷酸鹽限制培養(yǎng)基(Simmons等，2002，J.Immunol.Methods263:133-147)中稀釋飽和的LB羧芐青霉素培養(yǎng)基并將培養(yǎng)物在30。C培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)基因表達(dá)。通過定點(diǎn)誘變將半胱氨酸殘基111和220突變?yōu)榻z氨酸以改善蛋白質(zhì)性能(C2S突變體)。然后進(jìn)行CD20的發(fā)酵罐表達(dá)(Simmons等，見上文)。蛋白質(zhì)分離為確定用于在大腸桿菌中表達(dá)的組氨酸標(biāo)記的人CD20的洗滌劑抽提條件，使用Polytron(Brinkmann，Westbury,NY)將5g細(xì)胞重懸于50mL緩沖液A(20mMTrispH8.0,5mMEDTA)，并在125,000xg離心1小時(shí)。然后將細(xì)胞沉淀物重懸于緩沖液A,通過使用微型流化儀(microfluidizer)(MicrofluidicsCorp,Newton,MA)破碎細(xì)胞進(jìn)行裂解，并在125,000xg離心1小時(shí)。在不含EDTA的相同緩沖液中洗滌沉淀物一次并如前所述進(jìn)行沉淀。將沉淀物重懸于20mL緩沖液B(20mMTrispH8.0,300mMNaCl),等分試樣，并以如下濃度向各個(gè)等分試樣中添加洗滌劑1%SDS、1%正十二烷基-N,N-二曱胺-N-氧化物(LADO)、1%十二烷基磷酸膽堿(DDPC,Fos-Choline12)、1%正十二烷基-卩-D-麥芽糖苦(DDM)、1%Triton-X100和2.5%CHAPS。除SDS樣品在室溫抽—提以外，沉淀物在4。C抽提過夜。第二天，離心樣品并除去上清液。將沉淀物和上清液重懸于相同體積的還原性SDS加樣緩沖液，并通過SDS-PAGE和用偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗組氨酸抗體(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)探查硝酸纖維素膜上的免疫印跡進(jìn)行分析。為了大規(guī)模提取，如前所述裂解100-200g細(xì)胞并制備不溶性級(jí)分。為從不溶性級(jí)分中提取CD20，將最終的沉淀物以大約初始細(xì)胞濕重1:2.5w/v重懸于緩沖液B,添加DDPC至1。/。，并將溶液在4°C攪拌過夜。第二天通過125，00xg超速離心1小時(shí)沉淀洗滌劑不溶性級(jí)分。將上清液加載到用緩沖液B和5mMDDPC預(yù)平衡的Ni-NTASuperflow柱上。用10個(gè)柱體積的具有20mM咪哇的緩沖液A洗滌柱子，并用具有250mM咪唑的緩沖液A洗脫。所有通過柱加樣的純化步驟都在4°C進(jìn)行。濃縮含有CD20的洗脫級(jí)分并加載到在具有5mMDDPC的緩沖液A中預(yù)平4軒的Superdex200斗主(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上。在;疑月交過濾前,在5mLHiTrapHPQ(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)柱上進(jìn)一步純化組氨酸標(biāo)記的人CD20和鼠CD20。為了交換洗滌劑，使樣品在緩沖液B(0.1%DDM,150mMNaCl,20mMHEPES,pH7.2.)中通過Superdex200柱。或者，使樣品結(jié)合到小型Ni-NTA柱上，用緩沖液B洗滌并用含有300mM咪唑的緩沖液B洗脫。然后將這些樣品對(duì)緩沖液B透析以除去咪唑。為了人CD20的親和純化，將Rituximab⑧以6mg/ml固定化在10mLActigelALDSuperflow樹脂(Sterogene，Carlsbad，CA)上。將該樹脂置于柱中并在緩沖液B中平衡。使如前對(duì)天然hCD20所述純化的人CD20C2S突變體通過柱子，并通過在緩沖液B中大量洗滌來除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。在0.1%DDM,150mMNaCl和20mM檸檬酸鈉pH3.5中洗脫蛋白質(zhì)。洗脫的樣品立即中和、濃縮并對(duì)緩沖液B透析。通過BCA(20)(PierceBiotechnology,Rockford,IL61101)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并在使用前將樣品貯存在-80。C。全長Rituximab抗體如美國專利號(hào)5,736,137所纟皮露的產(chǎn)生。RituximabFab在大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)蛋白A和陽離子交換層析純化。回收的全長CD20分子具有序列VIAGIVENEWKRTCSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNEEDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSP正NDSSP[SEQIDNO:5]。3.通過Biacore3000測(cè)量CD20肽的結(jié)合親和力在合成CD20肽后，在Biacore3000上4吏用生物傳感器系統(tǒng)測(cè)量對(duì)rhuMAb2H7的結(jié)合親和力。使用兩種不同的方法來測(cè)量CD20肽對(duì)rhuMAb2H7的結(jié)合親和力。在第一種方法中，在鏈霉親合素芯片上用Biacore3000測(cè)量親和力，^f吏用固定化的95RU的單生物素化CD20-35聚物或94RU的單生物素化CD20-51聚物，其中RU是基于任意標(biāo)度的相對(duì)表面等離振子共振單位。運(yùn)行緩沖液是HBS-EP，流速50nL/min，用25jal10mM甘氨酸-HClpH2.5再生。注射2H7-IgG,并用Biaevaluation3.0軟件(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)將所得數(shù)據(jù)擬合1:1結(jié)合模型以得到表觀平衡解離常數(shù)。在第二種方法中，在鏈霉親合素芯片上用Biacore3000測(cè)量親和力，使用固定化的685RU的CD20(35聚物，雙(生物素))、1637RU的CD20(51聚物，單(生物素))或1037RU的CD20(51聚物，雙(生物素))。PBS/Tween/疊氮化物用作運(yùn)行緩沖液，流速20|iL/min，用20mMHC1再生。注射2H7-IgG，并將所得數(shù)據(jù)擬合二價(jià)分析物模型。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>結(jié)合親和力研究的結(jié)果示于表16。因?yàn)榕crhuMAb2H7分子相比肽非常小，因此僅有其中肽被固定化的格式得到使用，并且rhuMAb2H7分子是分析物。由于親合力之故，使用該格式僅獲得表觀親和力。即使使用全長rhuMAb2H7分子，肽與抗體之間的相互作用還是弱的(表16)。此外，當(dāng)濃度高達(dá)10pg/m1,在電致化學(xué)發(fā)光法中使用Ori-Tag標(biāo)記的rhuMAb2H7和生物素化肽時(shí)，沒有觀察到可^^測(cè)的相互作用。表17<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>還進(jìn)行了另一種ELISA測(cè)定法，其使用鏈霉親合素微量滴定板來捕捉生物素化CD20肽。將板與PBS中的2-20嗎/ml的肽溫育。然后用常規(guī)測(cè)定稀釋劑(含有0.5%BSA,0.05%Proclin-300和0.05%P20的PBS，pH7.3)進(jìn)一步封閉+反。在洗滌并吸干后，向孔中添加2.5-160pg/mlrhuMab2H7，并將板在室溫溫育1小時(shí)。在洗滌并吸干后，將板與山羊抗人IgG(H+L)HRP偶聯(lián)物溫育l小時(shí)，然后洗滌。結(jié)果示于表17。結(jié)果顯示，即使釆用最少的洗滌循環(huán)，rhuMab2H7的信號(hào)還是極低，表明鏈霉親合素/CD20生物素化肽不適用于開發(fā)rhuMAb2H7測(cè)定法。所觀察到的弱相互作用可能解釋為與在細(xì)胞上表達(dá)的CD20抗原的胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)相比，CD20肽缺少正確的三級(jí)結(jié)構(gòu)?？紤]到抗原的胞外結(jié)構(gòu)域較小，有可能細(xì)胞膜提供了有些類別的錨定支持，并使ECD結(jié)構(gòu)適宜。此外，業(yè)已顯示分子ECD上的二硫鍵對(duì)于抗原與其抗體的結(jié)合活性是至關(guān)重要的。該二硫4建的存在可能與可為數(shù)種抗CD20抗體包括rhuMAb2H7所識(shí)別的三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和維持有關(guān)。4.使用全長CD20分子作為捕捉劑的ELISAa.ELISA格式將碳酸鈉(pH9.6)中的捕捉劑(100pll嗎/ml全長CD20)添加至96孔微量滴定板，并將板在4。C溫育過夜。然后將板用洗滌緩沖液(具有0.05%聚山梨醇酯-20的PBS)洗滌3次。添加封閉緩沖液(200^Ll),密封板并在室溫輕輕振蕩溫育2小時(shí)。洗滌3次接著吸干后，將lOOpl樣品稀釋劑中的rhuMAb2H7標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照、血清空白和樣品添加至板，隨后用封^反才幾密封。在室溫輕輕振蕩溫育又一小時(shí)后，將板用洗滌緩沖液再洗滌6次并吸干。添加用4全測(cè)劑稀釋劑稀釋的100jil體積的檢測(cè)劑，將板密封并在室溫輕輕振蕩溫育1小時(shí)。然后再將板洗滌6次并吸干，然后添加100nl等體積的TMB和H202。在室溫不振蕩溫育15分鐘后，通過添加另外100^11MH3P04來終止反應(yīng)。從SpectraMax250讀4反4義(MolecularDevicesCorporation,CA)讀出吸光度，^]夸450nm處的吸光度減去650nm處的吸光度，并使用SoftmaxPro(MolecularDevicesCorporation,Sunnyvale,CA)處理數(shù)據(jù)。b.使用CD20建立rhuMAb2H7的標(biāo)準(zhǔn)曲線為確定全長CD20作為捕捉劑的適用性，使用濃度為1和5嗎/ml的全長CD20分子作為捕捉劑來產(chǎn)生rhuMAb2H7標(biāo)準(zhǔn)曲線。然而，對(duì)于400ng/ml的抗體濃度，信號(hào)相當(dāng)弱(圖1)?？瞻撰J猴血清樣品的篩選(screening)顯示出高背景。考慮到分子的疏水特性，血清背景高并不令人驚訝。此外，分子在包被到微量滴定板上時(shí)可能以聚集體形式存在，CD20胞外結(jié)構(gòu)域不易接近rhuMAb2H7,因此產(chǎn)生4氐信號(hào)。c.使用CD20作為捕捉劑的rhuMAb2H7的定量RITUXAN⑧的定量的測(cè)試，以確定與本發(fā)明的一般性測(cè)定法相比，特異性捕捉劑是否能產(chǎn)生類似的或甚至更好的結(jié)果。結(jié)果示于表18。表18中所顯示的低信號(hào)顯示在rhuMAb2H7或RITUXAN⑧的定量中CD20不能用作捕捉劑。因此，本發(fā)明的一般性測(cè)定法的適用性甚至超出了不能得到靶特異性試劑的情況。在使用靶特異性捕捉劑的測(cè)定法無法產(chǎn)生可接受的結(jié)果的情況下，本發(fā)明優(yōu)化后的一般性測(cè)定法可能能夠定量抗體?？紤]到許多藥物靶是膜結(jié)合抗原而且，像CD20，可能給出會(huì)降低使用靶特異性捕捉劑的測(cè)定法有效性的類似高血清背景的事實(shí)，這一結(jié)論尤其重要。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>110%獼猴血清背景的平均值(OX).450nm)2247ng/ml2H7的信號(hào)(0.D.450nm)3247ng/mlRituxan的信號(hào)(O.D.450nm)5.討論CD20具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及一個(gè)小型胞外結(jié)構(gòu)域。在使用獼猴血清時(shí)，CD20全長分子的內(nèi)在疏水特性促成了高背景。盡管在基于緩沖液的測(cè)定法中已成功使用了全長CD20分子，但是其不適于開發(fā)具有高靈敏度的基于獼猴血清的PK測(cè)定法。因此，在開發(fā)用于生物學(xué)基質(zhì)的測(cè)定法中選擇靶特異性分子時(shí)需要小心謹(jǐn)慎。雖然靶分子的配體適用于基于緩沖液的測(cè)定法，但其可能無法用于基于血清的測(cè)定法，尤其是在該配體是不溶性物質(zhì)時(shí)。在本實(shí)施例中，使用所有的合成肽，都觀察到對(duì)rhuMAb2H7相對(duì)較低的親和力。如上文所討論的CD20結(jié)合親和力研究的不利結(jié)果突出了開發(fā)如本發(fā)明所公開的用于定量抗體血清的備選測(cè)定體系的需要。雖然上文提及了具體實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并限于此。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)想到，可以對(duì)所公開的實(shí)施方案進(jìn)行多種修飾，而在總體上不偏離本發(fā)明的設(shè)想。所有這樣的修飾意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。4權(quán)利要求1.一種檢測(cè)含有非人物種流體的樣品中人的、人嵌合的、人源化的抗體或其包含恒定區(qū)的片段的方法，包括如下步驟(1)將捕捉劑施于測(cè)定表面；(2)用含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白的封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；(3)使封閉后的捕捉劑與樣品反應(yīng)以捕捉存在于樣品中的抗體；并(4)用包含可檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)劑檢測(cè)捕捉到的抗體。2.權(quán)利要求l的方法，進(jìn)一步包括如下步驟用相同的或親緣關(guān)系密切的非人物種的非人體液預(yù)吸收捕捉劑。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)劑和所述捕捉劑包含相同的抗體結(jié)合部分。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述檢測(cè)劑和所述捕捉劑各自包括結(jié)合人的、人嵌合的或人源化的抗體的抗體。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述檢測(cè)劑抗體包括捕捉劑抗體。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)劑包括偶聯(lián)有可檢測(cè)標(biāo)記物的抗體。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述標(biāo)記物包括堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。8.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品包括非人靈長類動(dòng)物血清。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述捕捉劑用相同的或親緣關(guān)系密切的非人靈長類動(dòng)物物種的非人靈長類動(dòng)物血清預(yù)吸收。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述封閉緩沖液含有牛丙種球蛋白。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述封閉緩沖液含有小鼠IgG。12.權(quán)利要求1的方法，其中所述封閉緩沖液含有至少一種兔IgG或驢IgG。13.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測(cè)劑處于含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白的緩沖液中。14.權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品處于樣品緩沖液中且所述檢測(cè)劑處于檢測(cè)緩沖液中，而且其中所述樣品緩沖液、所述檢測(cè)緩沖液或兩者不含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白。15.權(quán)利要求l的方法，其中所述人的、嵌合的、人源化的抗體或其片段包括嵌合抗體。16.權(quán)利要求l的方法，其中所述人的、嵌合的、人源化的抗體或其片段包括F(ab)2片段。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述人的、嵌合的、人源化的抗體或其片段包括人源化抗體。18.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體包括人源化的抗HER2抗體。19.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體包括人源化的抗CD20抗體。20.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗體包括人源化的抗VEGF抗體。21.—種檢測(cè)含有非人體液的樣品中人的、人嵌合的、人源化的抗體或其包含恒定區(qū)的片段的方法，包括如下步驟(1)用相同的或親緣關(guān)系密切的非人物種的非人體液預(yù)吸收包含非人抗體的捕捉劑；(2)用含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白的封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；(3)使封閉后的捕捉劑與樣品反應(yīng)以捕捉存在于樣品中的抗體；并(4)用與捕捉劑包含相同非人抗體的檢測(cè)劑檢測(cè)捕捉到的抗體；其中所述捕捉劑處于捕捉緩沖液中且所述樣品處于樣品緩沖液中，而且其中所述捕捉緩沖液、所述樣品緩沖液或兩者不含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述捕捉劑包被在測(cè)定表面上。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述測(cè)定表面包括聚合物基質(zhì)、傳感器芯片、樹脂珠或微量滴定板。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述非人哺乳動(dòng)物球蛋白是牛丙種球蛋白。25.權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測(cè)包括對(duì)樣品中抗體的量進(jìn)行定量。26.權(quán)利要求21的方法，其中所述檢測(cè)包括對(duì)樣品中抗體的量進(jìn)行定量。全文摘要本發(fā)明提供了用于人的、人嵌合的、人源化的抗體或其片段的定量方法，無需使用靶特異性分子。更具體地說，本發(fā)明涉及一種定量測(cè)定法，其包括用含有非人哺乳動(dòng)物球蛋白諸如牛丙種球蛋白(BGG)的封閉緩沖液封閉捕捉劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的步驟。文檔編號(hào)G01N33/68GK101133328SQ200580048896公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2005年12月30日優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日發(fā)明者楊薊紅,瓦萊麗·E·夸姆比申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司