專利名稱：一種用于造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于正常和惡性造血祖細(xì)胞半固體克隆培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，也可用于其液體懸浮培養(yǎng)。
造血干(祖)細(xì)胞的半固體克隆培養(yǎng)是研究正常和惡性造血干(祖)細(xì)胞增殖、分化和成熟及其調(diào)控的不可缺少的手段。自1961年Till和Mcculloch建立CFU-S以來，目前人類各系造血祖細(xì)胞的體外半固體培養(yǎng)體系均已建立，并對(duì)造血機(jī)理和調(diào)控的研究發(fā)揮了巨大作用，然而迄今為止，大多數(shù)報(bào)道均采用傳統(tǒng)的有血清培養(yǎng)方法，血清的成分十分復(fù)雜，至今尚未完全弄清。血清中的未知物質(zhì)和可變因素往往影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，特別是現(xiàn)代應(yīng)用高純度基因重組生長因子進(jìn)行細(xì)胞體外調(diào)控研究時(shí)，更需要一個(gè)精確度較高的細(xì)胞培養(yǎng)體系。排除了血清干擾的無血清培養(yǎng)體系就可以達(dá)到這一要求。國外很早就已開始了動(dòng)物和人類細(xì)胞無血清培養(yǎng)法的研究，1976年Ilayashi等報(bào)道了大鼠垂體GII3細(xì)胞的無血清培養(yǎng)，他們用激素、生長因子和其他一些基本營養(yǎng)物質(zhì)代替血清，此后又發(fā)展了各種無血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)許多不同來源的細(xì)胞，但是均為液體懸沲培養(yǎng)。近年來，開始將無血清培養(yǎng)法用于培養(yǎng)條件要求較高的半固體培養(yǎng)，如BFV-e等，但用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)包括正常和惡性淋巴祖細(xì)胞的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的是研制一種適用于正常和惡性造血祖細(xì)胞，其中包括惡性B淋巴祖細(xì)胞，如非霍奇金淋巴瘤B淋巴祖細(xì)胞(NHL B細(xì)胞)在內(nèi)的半固體克隆培養(yǎng)和長期培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，并用此培養(yǎng)基結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)方法(如重組生長因子和基因分析)重點(diǎn)研究NHL B細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)，為研究B細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)理和調(diào)控提供了有效方法和理論依據(jù)。
本發(fā)明是這樣來實(shí)現(xiàn)的。以急性白血病祖細(xì)胞(CFU-ALL和CFU-ANLL)、正常人T淋巴祖細(xì)胞(TL-CFU)正常人粒單祖細(xì)胞(GM-CFU)和正常人B淋巴祖細(xì)胞(BL-CFU)為代表，建立各自的有血清半固體克隆培養(yǎng)，然后篩選出較為理想的適合于這些祖細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基配方，進(jìn)一步用此培養(yǎng)基研究惡性B淋巴祖細(xì)胞NHL B細(xì)胞的半固體克隆培養(yǎng)和長期培養(yǎng)。
我們采用的無血清培養(yǎng)基是以Dulbecco′s modifiedEagle′smedium(DMEM)為基礎(chǔ)補(bǔ)充以國產(chǎn)氨基酸、維生素、無機(jī)鹽及抗菌素等11種成份，制成IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再添加血清替代物。通過造血祖細(xì)胞測定，對(duì)多種血清替代物進(jìn)行了省略試驗(yàn)和劑量反應(yīng)試驗(yàn)，最后確定血清替代物的配方和最佳濃度為牛血清白蛋白(BSA)10mg/ml、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)1ug/ml、胰島素(Ins)8ug/ml、膽固醇(Chol)20ug/ml和過氧化氫酶(Cata)20ug/ml，此為SFM-1。參考國外有關(guān)文獻(xiàn)，又設(shè)計(jì)了2種無血清培養(yǎng)基SFM-2(高濃度)和SFM-3(低濃度)，將這3種無血清培養(yǎng)基與有血清培養(yǎng)基(SCM)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基IMDM進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFM-1對(duì)上述幾種祖細(xì)胞均有生長支持作用，與SCM比較無顯著性差異(CP＜0.05)。為了探討無血清培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)、表型和結(jié)構(gòu)的影響，我們對(duì)每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了培養(yǎng)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)志的檢查，并對(duì)1例ALL和1例ALL患者進(jìn)行了培養(yǎng)前后細(xì)胞的染色體檢查，結(jié)果表明在培養(yǎng)前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、表型均無特殊改變，2例急性白血病患者，細(xì)胞培養(yǎng)前后亦具有相同的染色體異常。
我們用所研制的無血清培養(yǎng)體系進(jìn)一步進(jìn)行了NHL B細(xì)胞的半固體克隆培養(yǎng)和長期培養(yǎng)的研究，結(jié)果8例B細(xì)胞型NHL病人中有7例在無血清半固體培養(yǎng)中形成了集落，用T、B淋巴細(xì)胞單克隆抗體，經(jīng)間接免疫堿性磷酸酶法檢查單個(gè)集落，證實(shí)為B細(xì)胞集落。另用1例病人的腦脊髓液及骨髓細(xì)胞，建立了長達(dá)4個(gè)月以上的無血清長期培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞型NIIL病人，其細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和激活狀態(tài)存在異質(zhì)性，可通過體外培養(yǎng)結(jié)果將病人進(jìn)行分類，有助于臨床診斷和治療預(yù)后的判斷。比外證實(shí)了BCGF對(duì)NHL B細(xì)胞有刺激增殖的作用，為NHL病人的治療提供了線索。
除用于研究NHL B細(xì)胞外，還可用此培養(yǎng)基進(jìn)行其他造血組細(xì)胞的研究。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于無血清培養(yǎng)正常和惡性造血祖細(xì)胞的成功，將為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及免疫學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者們所利用，對(duì)推動(dòng)這些領(lǐng)域內(nèi)科學(xué)研究的發(fā)展將起一定的作用。使用本培養(yǎng)基能在排除血清干擾的情況下，比較精確地研究造血祖細(xì)胞的生物學(xué)特性和生長調(diào)控，用于細(xì)胞因子的分離、純化和調(diào)控研究，以及抗原抗體特性異免疫反應(yīng)的研究等具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)血液病發(fā)病機(jī)理，臨床診斷和治療的研究有很大的實(shí)用價(jià)值。推而廣之，也可用于其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)的發(fā)展有一定作用。我們也可將此無血清培養(yǎng)基在國內(nèi)外市場上出售，以獲得直接的經(jīng)濟(jì)效益。
以下是實(shí)施本發(fā)明方法的具體實(shí)施例。
例一血清替代物的配制1、人轉(zhuǎn)鐵蛋白將人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶于IMDM(90mg/ml)，每mg轉(zhuǎn)鐵蛋白加7.4×10-9mol/L Fe3+(以溶于0.1mmol/L鹽酸中的Fecl3形式，使1/3Fe2+飽和)此為貯存液，經(jīng)過濾除菌后-20℃保存。
2、牛血清白蛋白稱取BSA100g使之溶于182ml三蒸餾水(或去離子水)中，置4℃過夜，次日與10g樹脂珠混合，置4℃2小時(shí)，每15分鐘攪拌一次，去樹脂珠，再與10g樹脂珠混合，先后置4℃1小時(shí)及室溫1小時(shí)，去樹脂珠，測BSA的容量，每15mlBSA加1.1mlDulbecco′s磷酸緩沖鹽水(-Mg2+-Ca2+)10倍濃縮液，再用Dulbecco′s磷酸緩沖液鹽水工作液稀釋為10%BSA(W/V)。過濾除菌，-20℃保存，使用前每20mlBSA加7%NaIIco30.5ml和1.9%L-谷酰胺1.2ml。
3、脂類物質(zhì)的配制膽固醇50mg加在50ml酸性培養(yǎng)基中，用超聲波粉碎器(2cm直徑的肽探頭)在0℃以最大振幅蕩1小時(shí)，使之完全分散，然后將懸液先后通過1.2um和0.45um的濾膜過濾酸性培養(yǎng)基為不加碳酸氫鈉的IMDM，PH值為5.1。
4、胰島素及過氧化氫酶的配制胰島素先用少量PBS溶解，緩緩滴加0.01mol/L HCL，使之完全溶解，再用IMDM將其稀釋至所需濃度。過氧化氫酶用IMDM直接溶解，配成1mg/L濃度，將上述血清替代物加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基即成無血清培養(yǎng)基。
為了比較血清替代物的濃度，制備了含3種不同濃度血清替代物的無血清培養(yǎng)基(見表1)。
表1 無血清培養(yǎng)基編號(hào) BSA(mg/ml) Tf(ug/ml) INS(ug/ml) Chol(ug/ml) Ca+a(ug/ml)SFW-110 1 8 20 20SFW-210 1 80 80 80SFW-30.41100有血清培養(yǎng)基(SCM)則以IMD和10%新生牛血清(NBCS)組成。
例二半固體培養(yǎng)體系為0.8%甲基纖維素，10%無血清PIIA-LCM，無血清培養(yǎng)基(SFM-1，SFM-2或SFM-3)或有血清培養(yǎng)基(SCM)。細(xì)胞濃度為正常人和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)外周血單個(gè)核細(xì)胞為5×105/ml(TL-CFU為1×106/ml)，正常人及急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)骨髓單個(gè)核細(xì)胞為2×105/ml。對(duì)TL-CFU，需加0.25%PHA-P，BL-CFU需加葡萄球菌A蛋白50ug/ml。對(duì)CFU-ALL和BL-CFU，培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)前需和半乳糖氧化酶(GO)10u/2×107細(xì)胞/ml一起孵育30分鐘。
例三克隆測定用TL-CFU和GM-CFU測定法對(duì)下述5種培養(yǎng)基進(jìn)行了比較，見表2。
表2 五種培養(yǎng)基對(duì)TL-CFU和GM-CFU支持作用的比較TL-CFU P CM-CFU P培養(yǎng)基 值 值實(shí)驗(yàn) 生長 集落數(shù) 實(shí)驗(yàn) 生長 集落數(shù)例數(shù)例數(shù) (1×105) 例數(shù)例數(shù) (2×104)SFM-1 6 6 222±164 >0.05 7 5 170±154 >0.05SFM-2 5 4 17±18 <0.01 5 3 13±21 <0.01SFM-3 5 5 131±124 >0.05 5 4 29±23 >0.01IMDM 5 4 16⊥18 <0.01 5 3 12⊥15 <0.01SCM 6 6 152±141 7 5 158±179注P值為各組與SCM比較的結(jié)果。
SFM-1對(duì)TL-CFU和GM-CFU，以及SFM-3對(duì)TL-CFU的生長支持作用與SCM無顯著性差異(P＞0.05)，而SFM-2和IMDM對(duì)兩者的作用均比SCM差(＜0.01)。SFM-1和SCM比較并無顯著性差異(P＞0.05)，見表3。
表3 半固體培養(yǎng)條件下SFM-1和SCM對(duì)幾種造血祖細(xì)胞生長支持作用的比較SFM-1 SCM P克隆測定 細(xì)胞數(shù) 值實(shí)驗(yàn) 生長 集落數(shù) 實(shí)驗(yàn) 生長 集落數(shù)(1×104) 例數(shù)例數(shù)例數(shù)例數(shù)TL-CFU 10 6 6 222±164 6 6 152±141 >0.05BL-CFU 5 10 6 23±41 10 8 52±41 >0.05CFU-ALL 5 20 20 92±85 20 12 141±101 >0.05CFU-ANLL 2 18 13 83±57 18 13 122±121 >0.05CM-CFU 2 7 5 170±154 7 5 158±179 >0.0權(quán)利要求
1.一種用于造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，是以DMEM為基礎(chǔ)，補(bǔ)充國產(chǎn)氨基酸、維生素、無機(jī)鹽及抗菌素等成份，制成IMDM，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再添加血清替代物，構(gòu)成適合于各種造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，血清替代物的配方和最佳濃度為牛血清的蛋白(BSA)10mg/ml、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)1ug/ml、胰島素(Ins)3ug/ml、膽固醇(Chol)20ug/ml和過氧化氫酶(Cata)20ug/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞是以急性白血病人祖細(xì)胞(CFV-ALL和CFU-ANLL)正常人T淋巴細(xì)胞(BL-CFU)、正常人粒單祖細(xì)胞(GM-CFU)和正常人B淋巴細(xì)胞(BL-CFU)為代表，建立適合于這些祖細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適合于造血祖細(xì)胞克隆培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，經(jīng)多種造血祖細(xì)胞的克隆測定證明，該培養(yǎng)基支持細(xì)胞生長的效果與有血清培養(yǎng)無明顯差異，可用于各種造血祖細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)和生長調(diào)控的研究。由于使用該培養(yǎng)基可排除血清的干擾，可大大提高研究工作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，在進(jìn)行細(xì)胞產(chǎn)物的分離純化和抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的研究時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明適用范圍廣，可用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域。該培養(yǎng)基可在國內(nèi)外市場上銷售，能產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1088984SQ93114630
公開日1994年7月6日 申請(qǐng)日期1993年11月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月11日
發(fā)明者戴育成 申請(qǐng)人:江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所