專利名稱：因子Ⅷ和因子Ⅷ-類似蛋白的小肽或者擬肽親合性配體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有固定在基質上的本發(fā)明化合物的診斷設備或者試劑盒，其中化合物特異性地結合在FVIII或者FVIII-相關蛋白上。在某些實施方案中，化合物直接或者經錨定化合物和/或間隔分子固定在基質上，所述基質可以為聚合物材料，例如為樹脂。
在又一實施方案中，化合物在方法中用作FVIII或者FVIII-相關蛋白的標記物。
在本發(fā)明的實施方案中，化合物在識別和/或純化FVIII或者FVIII-相關蛋白的方法中使用。
本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明化合物在疾病治療中的醫(yī)藥用途。



圖1示出如實施例3所述的用于純化先前純化的FVIII的純化輪廓圖。
圖2表明如實施例3所述的由用FVIII示蹤的含FBS的細胞條件培養(yǎng)基得到的FVIII的純化輪廓圖。
圖3是如實施例3所述的由純FVIII的吸附和洗脫(條帶2～6)和由用FVIII示蹤的含FBS的細胞條件培養(yǎng)基純化(條帶7～12)得到的餾份的SDS-PAGE照片。條帶1:分子量標準樣品；條帶2:純FVIII；條帶3:用于柱的具有純FVIII的源溶液；條帶4:通過流；條帶5和6:洗脫餾分；條帶7:介質；條帶8:用于柱的具有FVIII的介質；條帶9:通過流；條帶10和11:用0.2M NaCl預洗滌的洗脫餾分；條帶12:用1M NaCl的洗脫餾分。
圖4是如實施例3所述的由純FVIII吸附和洗脫(條帶2-6)和由用FVIII示蹤的含FBS的細胞條件培養(yǎng)基純化(條帶8-12)的餾份的Western印跡照片。條帶1:純FVIII；條帶2:用于柱的具有純FVIII的源溶液；條帶3:通過流；條帶4和5:洗脫餾分；條帶6:用于柱的具有FVIII的介質；條帶7:通過流；條帶8和9:用0.2M NaCl預洗滌的洗脫餾分；條帶10用1M NaCl的洗脫餾分。
圖5(a)示出如實施例4所述的用于純化先前純化的FVIII的純化輪廓圖。
圖5(b)是如實施例4所述的由純化先前純化的FVIII得到的餾份的SDS-PAGE照片(條帶1-4)。條帶1:純FVIII；條帶2:通過流；條帶3:洗滌餾份；條帶4:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖5(c)示出如實施例4所述的由純化先前純化的FVIII得到的餾份的Western印跡分析照片。條帶5:純FVIII；條帶6:通過流；條帶7:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖6(a)示出如實施例4所述的用FVIII示蹤的由含FBS的DMEM條件培養(yǎng)基中進行純化的純化輪廓圖。
圖6(b)是如實施例4所述的用FVIII示蹤的由含FBS的DMEM條件培養(yǎng)基中進行純化得到的餾份的SDS-PAGE照片(條帶1-4)。條帶1:粗介質；條帶2:用于柱的源溶液；條帶3:通過流；條帶4:用1M NaCl洗脫的餾分。
圖6(c)是如實施例4所述的用FVIII示蹤的由純化含FBS的DMEM條件培養(yǎng)基得到的餾份的Western印跡照片。條帶5:純FVIII；條帶6:通過流；條帶7:用1M NaCl洗脫的餾分。

具體實施例方式 親合色譜法是沿用已久的強有力的技術，它是用于純化復雜分子如蛋白的的現有方法(Jack，G.W.；Beer，D.J.MethodsMoI.Biol.1996，59，187-196)。親合色譜法通過目標分子和配體之間的強相互作用提供了將具有優(yōu)良選擇性的目標蛋白與污染蛋白分離的獨特可能性，其中所述配體被固定在樹脂上。通常配體為多克隆或者單克隆抗體。單克隆抗體是優(yōu)選的，這是因為它們是單一特異性的并且可以精確形成(Scopes，R.K.Protein purification:Principles and Practice.Springer，NewYork，1994)。迄今為止，小的化學配體僅僅限于用于親合分離中。然而，組合庫的應用已經擴展用于肽配體的免疫親和層析工藝的專門技術(Lowe，C.R.Curr.Opin.Chem.Biol.2001，5，248-256)?；谏飳W或者化學系統(tǒng)，組合方法的使用已經形成了獨特的肽，其提供中等或者甚至高結合親合性，從而捕獲目標蛋白和在溫和條件下洗脫它。
例如，Huang，Ping Y.等人在＂Bioorganic & MedicinalChemistry＂，Vol.4，No.5，pp.699-708，1996中描述了固定肽用于免疫親和層析純化von Willebrand因子(vWF)的應用。多聚體vWF的純化是一種主要的挑戰(zhàn)，因為其分子量在0.5～10百萬道爾頓的巨大尺寸范圍內。von Willebrand因子是在凝血級聯系統(tǒng)中直接涉及的多功能血漿蛋白。在導致正常阻止失血的情形中，它具有突出的作用。vWF和FVIII之間的相互作用導致FVIII得到穩(wěn)定和運送。兩種高親合結合位點確保有效捕獲(Sadler.J.E.；Mannucci.P.M.；Berntorp.E.；Bochkov.N.；Boulyjenkov.V.；Ginsburg.D.；Meyer.D.；Peake.I.；Rodeghiero.F.；Srivastava.A.Thromb.Haemost，2000，84，160-174)。
FVIII是一種在凝血級聯系統(tǒng)中起重要作用并且具有強治療學重要性的大而復雜的蛋白。由遺傳突變引起的體內FVIII產生的缺乏可以導致血友病，其通過輸注純化的人類FVIII制劑進行治療(Lee，C.Thromb.Haemo st.1999，82，516-524)。用于治療血友病患者的人類FVIII的當前來源是血漿源FVIII和重組FVIII，后者在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(Kaufman，R.J.；Wasley，L.C；Dorner，A.J.J.Biol.Chem.1988，263，6352-6362)和小倉鼠腎(BHK)細胞(Boedeker，B.D.G.Sem.Thromb.Hemost.2001，27，385-394)中合成。除了高純度指標之外，確保免疫學和病毒安全性是至關重要的。
存在幾種已知利用色譜技術純化人類FVIII的方法。對于所有重組FVIII制劑和對于多種血漿源FVIII產品，應用免疫親和層析樹脂是常規(guī)的制造方法。包括親合色譜法的當前制造方法使用對于FVIII特異性的單克隆抗體(mAb)(Lee，C.，Recombinant clotting factors in the treatment of hemophilia.Thromb.Haemost.1999，82，516-524)。為了制造的目的，抗FVIII的抗體通過鼠雜交瘤細胞系產生，然后固定在色譜樹脂上。當前工業(yè)FVIII純化應用mAb免疫親合步驟，該步驟對方法相關的雜質(比如DNA和宿主細胞)提供優(yōu)良的除去作用。
然而，還存在多種與當前利用固定的單克隆抗體的免疫親和層析方法相關的疑慮和限制。一個缺點是樹脂容量的限制，因為幾種分子尺寸巨大的抗體分子將覆蓋樹脂表面的相當大的部分。此外，抗體制備是一種冗長和昂貴的方法，抗體的純度和活性將取決于各次重復制備而變化?？贵w通過作為生產宿主的雜交瘤來生產，這使得抗體對病毒，特別是逆轉錄病毒可能被引入到目標蛋白的制造工藝中的低但是非零的風險敏感。最后，抗體由載體基質(即，樹脂)中的滲漏可以引起嚴重的產品污染和由于免疫原性導致產品損失。由此，存在充分的動力，以用更精確的、低本高效的方法替換當前方法。通過在降低或者消除數種所述缺陷的免疫親和層析純化方法中提供其為化學合成的小肽或者擬肽衍生物的化合物，本發(fā)明滿足了該需求。
Pflegerl等人(J.Peptide Res.2002，59，174-182)報道了對FVIII具有高親合性的不同八肽的研制。發(fā)現必需的氨基酸序列是位于肽C-末端一側的WEY。
包含小肽或者擬肽衍生物的本發(fā)明化合物作為配體具有優(yōu)勢，因為在滲漏入產品中的情形中，它們不可能引起免疫應答。同抗體相比，小肽或者擬肽衍生物還更加穩(wěn)定。另一優(yōu)點是它們顯著較低的生產成本，因為它們可以容易地在良好制造規(guī)范(GMP)下大量無菌生產。小肽或者擬肽衍生物和本發(fā)明方法的應用獲得了不使用動物來源或者人類來源的原料的純化產品。最后但非最不重要，在此所述的完善化學合成使得精制步驟改進了小肽或者擬肽衍生物對它們的目標蛋白的親合性。
因此，本發(fā)明向本領域普通技術人員提供了化合物和改進通常使用的FVIII純化方法的工藝。
如本文中所述，本發(fā)明提供了FVIII純化方法，其對于FVIII的免疫親和純化避免使用鼠單克隆抗體。本發(fā)明包括化學合成的獨特高親合性肽和擬肽，其可以替換單克隆抗體并具有同上述已知的低聚肽相比改進的蛋白水解穩(wěn)定性。這將滿足當前對生物學安全性的需要。此外，我們的化合物適于大規(guī)模溶液合成，因此將使得親合性配體的生產成本最小。
本發(fā)明包括新穎化合物，優(yōu)選二肽、三肽和擬肽，其作為配體用于檢測、鑒定、分離和純化以及標記活性因子VIII和因子VIII-類似蛋白，所述蛋白來自含有所述蛋白的溶液中。本發(fā)明的因子VIII結合分子表現出顯著的穩(wěn)定性以及對于因子VIII和因子VIII類似蛋白的高親合性。除非另作說明或者指出，在此使用的術語“因子VIII和因子VIII類似蛋白”包括來源于任何動物、任何重組或者雜交的因子VIII或者任何改性的因子VIII。在優(yōu)選的實施方案中，所述“因子VIII和因子VIII類似蛋白”的特征在于活性(通過標準一期凝血法進行確定，例如，如Bowie，E.J.W.和C.A.Owen，Disorders of Hemostasis(Ratnoff和Forbes，eds.)pp.43-72，Grunn & Stratton，Inc.，Orlando，FIa.(1984)中所述)為因子VIII天然人類形式的活性的至少10％，更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少80％。
因子VIII類似蛋白還包括任何來源的因子VIII蛋白的結構域、片段和表位及其雜交組合物。此外，術語“因子VIII類似蛋白”進一步包括可以用作用于研究目的的探針或者用作診斷劑的因子VIII的片段，即使所述片斷幾乎沒有或者沒有表現出血液凝固活性。優(yōu)選所述蛋白或者多肽包含至少50個氨基酸，更優(yōu)選至少100個氨基酸。優(yōu)選的因子VIII和因子VIII類似蛋白的結構域、表位和片段包括其輕鏈，含有結構域A3-C1、C1-C2、A3、C1或者C2的輕鏈部分和單個結構域A3、C1和C2。可以根據本發(fā)明純化的因子VIII和因子VIII類似蛋白還包括描述在US7,122,634、US 7,041,635、US 7,012,132和US 6,866,848中的所有重組蛋白、雜交體、衍生物、突變體、結構域、片段和表位，所有這些文獻的全部內容都在此引入作為參考。除非在本文中另有說明，術語“氨基酸”包括含有至少一個氨基和至少一個酸性基團的任何有機化合物。所述氨基酸可以是任何天然存在的化合物或者合成來源的化合物。優(yōu)選氨基酸含有至少一個伯氨基和/或至少一個羧酸基團。術語“氨基酸”還指包含在來源于所述氨基酸化合物和通過肽鍵或者擬肽鍵鍵接在相鄰殘基上的較大分子(比如肽和蛋白)中的殘基。
本發(fā)明提供了確保快速分離和純化商業(yè)量的可用于血友病甲治療和研究中的蛋白和相關物質的低本高效方法。
本發(fā)明涉及包含式I的肽和/或擬肽的化合物以及它們的鹽。
(I)B-Q-X 其中 B是對FVIII和/或FVIII-類似蛋白提供親合性的二肽、三肽或者擬肽， Q不存在或者為有機間隔分子和 X不存在或者為錨定分子， 根據本發(fā)明的其它化合物包含兩個或者更多個可以彼此相同或者不同的基團B。這些基團B可以連接在相同的間隔物Q上，從而形成通式(B)r-Q-X所表示的化合物，r的范圍為2～4。作為選擇，它們可以通過其它間隔物Q(各個間隔物Q彼此相同或者不同)彼此連接，從而形成類型(B-Q)s-X的低聚化合物，s的范圍為2～4。
根據本發(fā)明的另一實施方案，所述基團B本身或者基團B和Q一起或者B和X一起或者B和Q和X一起可以形成環(huán)。任選該環(huán)可以包括選自有機二價基團的另外的環(huán)-形成部分，所述有機二價基團比如任選取代的亞烷基基團、氨基酸、二肽或者三肽及其組合。
術語“擬肽”包括能夠模擬或者拮抗親本肽的生物學作用的含有非肽結構成分的化合物。優(yōu)選所述化合物幾乎不含(或者不含)肽鍵。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案涉及由本發(fā)明的二肽和三肽通過用一個或者多個選自以下的官能團替換一個或者多個肽鍵衍生得到的擬肽:-CO-NR2-、-NR2-CO-、-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-、-CO-CHR2-、-CHR2-CO-、-CR2＝CR2-和-CR2＝CR2-，其中R2為如下關于通式(II)所定義的。應當理解，在含有基團-NR2-的選項中，取代基R2可以是各氨基酸(類肽氨基酸)的側鏈。在這種情況下，相鄰的Cα不帶有側鏈。另一方面，除了連接Cα的側鏈之外，還存在其它取代基R2。此外，如果多于一個R2存在，應當理解，各個R2可以相同或者彼此不同。
特別優(yōu)選的擬肽組包括含有殘基Z1-Z2-Z3(如下所定義)的那些化合物，其中(至少)Z2和Z3之間的肽鍵選自-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-、-CR2＝CR2-和-CR2＝CR2。
“親合性”是促使它們保持聯合的原子或者分子間吸引力。這是親合色譜法的基礎。在本發(fā)明上下文中，如果根據以下測試方案測量與FVIII的結合，認為肽或者擬肽對FVIII或者FVIII-類似蛋白表現出至少10％，優(yōu)選至少25％和最優(yōu)選至少40％的親合性。結合程度通過重現實施例1中所述的試驗，利用125I-標記的FVIII進行測量。
優(yōu)選本發(fā)明的肽或者擬肽衍生物B(在此使用的術語“擬肽”和“擬肽衍生物”可以互換使用)可以化學鍵接到載體基質的表面，從而形成肽包衣的載體基質。這優(yōu)選借助于錨定分子X和/或間隔分子Q實現，或者如果Q和X不存在，優(yōu)選借助于化合物B的SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、-CH2-L、C≡CH、羰基或者羧基實現。在本文中，L包括離去基團，比如Cl、Br或者I。
本發(fā)明還涉及所述肽包衣的載體基質。
術語“化學結合”包括兩個(或更多個)原子、或者一個(或者更多個)原子和一種(或更多種)化合物或者兩種(或更多種)化合物之間的共價、離子、疏水和/或其它配合相互作用及其混合和組合。
載體物質包括無機或者有機物質，特別是聚合物物質。因此，可以使用相同的聚合物物質(即直鏈多糖)，其通常用于生物聚合物的色譜分離。特別是，產生親水性表面的聚合物適宜作為色譜載體物質，即樹脂。例如，使用ToyoperalAF-Epoxy-650M樹脂。所述載體物質還可以具有另外的錨定分子，所述錨定分子提供用于固定如根據式I的肽或者擬肽的化合物的SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、-CH2-L、C≡CH、環(huán)氧基、羰基或者羧基。
由于本發(fā)明的優(yōu)選化合物與FVIII和/或FVIII-類似蛋白相互作用的事實，包含肽或者擬肽衍生物的優(yōu)選化合物適用于診斷設備和試劑盒中。優(yōu)選診斷設備或者試劑盒包含至少一種對FVIII或者FVIII相關蛋白具有高親合性的化合物，至少一種化合物可以任選化學鍵接的載體基質和必要時的其它試劑。
為了跟蹤本發(fā)明的化合物，優(yōu)選肽或者擬肽衍生物，與FVIII和/或FVIII-類似蛋白的反應結果，將化合物進行標記。標記化合物存在數種可能性，即通過使用放射性標記物進行標記，通過使用熒光配體進行標記，通過使用親和素/鏈霉親和素(avidine/steptavidine)系統(tǒng)進行標記，或者如ELISA工藝中通常應用的，通過使用引起顯色反應的酶進行標記。
本發(fā)明涉及含有適于標記、檢測、鑒定、分離和/或純化FVIII和/或FVIII-類似蛋白的肽和擬肽衍生物的化合物。
在上文和下文中給出的氨基酸縮寫表示以下氨基酸的殘基: Abu 4-氨基丁酸 Aha 6-氨基己酸 Ala 丙氨酸 Asn 天門冬酰胺 Asp 天冬氨酸 Arg 精氨酸 Bpa 對苯甲?；奖彼? Cys 半胱氨酸 Dab 2，4-二氨基丁酸 Dap 2，3-二氨基丙酸 GIn 谷氨酰胺 GIp 焦谷氨酸 GIu 谷氨酸 GIy 甘氨酸 His 組氨酸 homo-Cys 同型半胱氨酸 homo-Phe 同型苯丙氨酸 IAA 2-(吲哚-3-基)乙酸 IBA 4-(吲哚-3-基)丁酸 IPA 3-(吲哚-3-基)丙酸 Ile 異亮氨酸 Leu 亮氨酸 Lys 賴氨酸 Met 蛋氨酸 1-Nal 1-萘基丙氨酸 2-Nal 2-萘基丙氨酸 Nle 正亮氨酸 Orn 鳥氨酸 Phe 苯丙氨酸 Phg 苯基甘氨酸 4-Hal-Phe 4-鹵素-苯丙氨酸 Pro 脯氨酸 Ser 絲氨酸 Thr 蘇氨酸 Trp 色氨酸 Tyr 酪氨酸 Val 纈氨酸 此外，使用以下縮略語: Ac 乙?；? BOC 叔丁氧羰基 tBu 叔丁基 CBZ或者Z芐氧羰基 DCCI二環(huán)己基碳二亞胺 DIPEA N-乙基二異丙基乙胺 DMF 二甲基甲酰胺 EDCIN-乙基-N，N′-(二甲基氨基丙基)-碳二亞胺 Et乙基 Fmoc 9-芴基甲氧羰基 HOBt 1-羥基苯并三唑 Me甲基 MBHA 4-甲基-二苯甲胺 Mtr 4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺?；? HATU O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯； HONSu N-羥基琥珀酰亞胺 OtBu 叔丁基酯 Oct 辛?；? OMe 甲基酯 OEt 乙基酯 POA 苯氧基乙?；? Pbf 五甲基苯并呋喃基 Pmc 2，2，5，7，8-五甲基色滿(Pentamethylchroman)-6-磺?；? Sal 水楊?；? Su琥珀?；? TIPS 三異丙基硅烷 TFA 三氟醋酸 TFE 三甲基甲硅烷基溴 Trt 三苯甲基(三苯基甲基)。
如果式I化合物的結構單元(即上述的氨基酸)可以以多種光學異構形式存在，那么包括所有這些形式及其混合物(例如DL形式)。
此外，作為式I化合物組成部分的氨基酸可例如帶有自身已知的相應保護基。優(yōu)選基團為Asp和GIu的衍生物，特別是Tyr的側鏈或者衍生物的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯，特別是側鏈的甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯。此外，所述化合物可以帶有一個或者多個另外的保護基，所述保護基在以下結合本發(fā)明化合物的制備進行了描述。
此外，比如N-末端改性或者羧基-末端改性衍生物的結構部分同樣屬于本發(fā)明的一部分。優(yōu)選基團為氨基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-、苯基-或者芐基-基團，氨基-末端基團比如BOC、Mtr、CBZ、Fmoc和特別是乙酰基、苯甲酰基或者(吲哚-3-基)碳酸基團，此外，羧基-末端甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酯，甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、叔丁基-、新戊基-或者芐基酰胺，并且特別是羧酰胺。
α氨基可以由適宜的保護基保護，所述保護基選自芳香氨基甲酸酯型的保護基，比如烯丙氧羰基、芐氧羰基(Z)和取代的芐氧羰基，比如對-氯芐氧羰基、對-硝基芐氧羰基、對-溴芐氧羰基、對-聯苯-異丙氧羰基、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和對-甲氧基芐氧羰基(Moz)；脂族尿烷型的保護基，比如叔丁氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基和異丙氧羰基。在此，對于α氨基保護，Fmoc是最優(yōu)選的。
可以用于形成根據本發(fā)明的肽或者擬肽的氨基酸可以屬于天然存在和非蛋白氨基酸。氨基酸和氨基酸殘基可以進行衍生化，不過優(yōu)選N-甲基-、N-乙基-、N-丙基-或者N-芐基-衍生物。例如，如果使用甲基，酰胺鍵的N-烷基化作用會對相應化合物的活性具有強烈影響(Levian-Teitelbaum，D.；Kolodny，N.；Chorev，M.；Selinger，Z.；Gilon，C.Biopolymers 1989，28，51-64，其全文在此引入作為參考)。另外，可以應用的氨基酸的其它結構替換物包括在側鏈上具有改性的氨基酸、β-氨基酸、氮雜-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中α-CH-基團被N-原子取代)和/或類肽-氨基酸(α-氨基酸的衍生物，其中氨基酸側鏈鍵接在氨基上，而不是α-C-原子上)或者上述變型的環(huán)化衍生物。
根據本發(fā)明的一種實施方案，還可以將天然存在的氨基酸的同型-衍生物用作結構單元。它們是天然存在的氨基酸的衍生物，其中亞甲基基團被插入到側鏈中，直接與Cα相鄰。類似地，還可以使用根據本發(fā)明的天然存在的氨基酸的α-甲基化衍生物。在上下文中，除非另外明確說明，殘基B、Q和X為關于式I所定義的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，式I化合物如所附權利要求2～17中任一項中所定義。
在另一實施方案中，優(yōu)選B由以下通式表示 Z1-Z2-Z3， 其中Q、X或者載體可以直接鍵接到殘基Z1、Z2和Z3中任一殘基上。優(yōu)選經殘基Z1或者Z3進行鍵接，更優(yōu)選經殘基Z3進行鍵接。
在該實施方案中，Z1是具有大側鏈的天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物。這意味著側鏈含有至少3個碳原子，優(yōu)選至少5個碳原子和更優(yōu)選6～25個碳原子。一個或者多個所述碳原子可以被選自N、O和S的雜原子替代。優(yōu)選Z1的側鏈含有可以為單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)的環(huán)狀基團。此外，該環(huán)狀基團可以是飽和的、不飽和的或者芳香基團。更優(yōu)選芳香基團以及雙環(huán)基團。特別優(yōu)選芳香雙環(huán)基團。在所附權利要求4～17中對于另一實施方案詳述的特征描述了該實施方案的其它優(yōu)選化合物。
在該實施方案中，還可以優(yōu)選Z1為下式的殘基Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-A1(II) 其中 A1表示選自NR2、CO、OCO、CHR2、O或者S的基團， R1表示選自C1-4烷基、苯基、芐基和N(R2)2的基團，其中烷基、苯基或者芐基可以帶有一個或多個獨立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個或更多個A和/或兩個或更多R2可以彼此相同或者不同， Ar是具有6-14個碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者帶有1-3個獨立地選自A、Ar1、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2、Hal的取代基；或者Ar可以是Het， Hal選自F、Cl、Br或者I， Ar1是具有6-14個碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基，優(yōu)選苯基或者萘基基團，更優(yōu)選苯基。Ar1可以自身未被取代或者帶有1-3個獨立地選自A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2和Hal的取代基； Het表示具有5-12個環(huán)成員的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，其中環(huán)成員包含1-3個N-和/或1個S-或者O-原子。
雜芳基或者單環(huán)或者雙環(huán)5員-12員雜環(huán)環(huán)基團可以基于的雜環(huán)的實例為吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、異吲哚、吲唑、酞嗪、喹啉、異喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、β-咔啉或者這些雜環(huán)的苯并稠合、環(huán)戊基稠合、環(huán)己基稠合或者環(huán)庚基稠合衍生物。
氮雜環(huán)還可以作為N-氧化物存在。
可以為雜芳基或者單環(huán)或者雙環(huán)5員-12員雜環(huán)環(huán)的基團為，例如，2-或者3-吡咯基、苯基吡咯基(例如4-或者5-苯基-2-吡咯基)、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基(例如1-甲基-2-、-4-或者-5-咪唑基)、1，3-噻唑-2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、N-氧化-2-吡啶基、N-氧化-3-吡啶基或者N-氧化-4-吡啶基、2-吡嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基或者5-嘧啶基、2-吲哚基、3-吲哚基或者5-吲哚基、取代的2-吲哚基(例如1-甲基-、5-甲基-、5-甲氧基-、5-芐氧基-、5-氯-或者4，5-二甲基-2-吲哚基)、1-芐基-2-吲哚基或者1-芐基-3-吲哚基、4，5，6，7-四氫-2-吲哚基、環(huán)庚并[b]-5-吡咯基、2-喹啉基、3-喹啉基或者4-喹啉基、1-異喹啉基、3-異喹啉基或者4-異喹啉基、1-氧代-1，2-二氫-3-異喹啉基、2-喹喔啉基、2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或者2-苯并噻唑基，或者作為部分氫化或者完全氫化的雜環(huán)環(huán)的基團，還例如二氫吡啶基、吡咯烷基(例如2-或者3-(N-甲基吡咯烷基)、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、四氫噻吩基、苯并二噁烷基(benzodioxolanyl)。
表示基團Het的雜環(huán)基團可以在碳原子和/或環(huán)氮原子上未被取代或者被單取代或者多取代，例如被相同或者不同的取代基二取代、三取代、四取代或者五取代。碳原子可以被取代，例如，被(C1-C8)-烷基取代，特別是被(C1-C4)-烷基，被(C1-C8)-烷氧基取代，特別是被(C1-C4)-烷氧基取代(上述取代基的烷基部分可以自身未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代)，被鹵素、硝基、N(R2)2、三氟甲基、OCF3、羥基、氧代、氰基、COOR2、氨基羰基、(C1-C4)-烷氧基羰基、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基、四唑基取代，特別是被(C1-C4)-烷基(例如甲基、乙基或者叔丁基)、(C1-C4)烷氧基(例如甲氧基)、羥基、氧、苯基、苯氧基、芐基、芐氧基取代。硫原子可以被氧化成亞砜或者砜?；鶊FHet的實例為1-吡咯烷基、1-哌啶基、1-哌嗪基、4-取代的1-哌嗪基、4-嗎啉基、4-硫代嗎啉基、1-氧代-4-硫代嗎啉基、1，1-二氧代-4-硫代嗎啉基、全氫惡嗪-1-基(perhydroazepin-1-yl)、2，6-二甲基-1-哌啶基、3，3-二甲基-4-嗎啉基、4-異丙基-2，2，6，6-四甲基-1-哌嗪基、4-乙?；?1-哌嗪基和4-乙氧羰基-1-哌嗪基。
A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代， m和o獨立地選自0、1、2、3和4， n為0或者1，和 R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，為氨基酸側鏈。
更優(yōu)選的基團Z1包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特別是在其側鏈上帶有1-3個獨立地選自R6(如下所定義)的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般實例為Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。更優(yōu)選的基團Z1包括Tyr、Tyr(OMe)和Tyr(OBn)的衍生物，其中取代基連接在苯基的間位或者鄰位。其它更優(yōu)選的基團Z1包括環(huán)己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-噻吩丙氨酸、3-噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸(其中雙環(huán)環(huán)系統(tǒng)可以在環(huán)系統(tǒng)的任何位置上連接在分子的剩余部分上，優(yōu)選在噻吩基環(huán)的2-或者3-位)、苯基甘氨酸、對-苯甲酰基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、同型酪氨酸、同型色氨酸、同型組氨酸和以上關于天然氨基酸所述的它們的衍生物。
其它更優(yōu)選的基團Z1包括以上通式(II)表示的基團，其由以下通式(III)表示: Ar2-(CH2)m-(CHR3)n-(CH2)o-CO-(III) 其中 Ar2表示由Ar限定的芳香基團的優(yōu)選亞組(subgroup)，包括苯基、2-羥苯基、3-羥苯基、4-羥苯基、1-萘基、2-萘基、對-苯甲?；交?、(鄰、間或者對-)聯苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、2-硫代苯基、3-硫代苯基、2-苯并噻吩基、3-苯并噻吩基，其每一個可帶有1～3個獨立地選自A和Hal的取代基，和 其中式(III)的剩余取代基為如關于式(II)所定義的，和 R3為H、R6、-COR6、-COOR6和 R6表示H、C1-4烷基、苯基或者芐基，各自可以未被取代或者獨立地被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單取代、二取代或者三取代。
特別優(yōu)選的基團Z1選自Ac-Trp、Trp、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、對-苯甲?；奖彼岷鸵陨贤ㄊ?III)的基團，其中Ar表示3-吲哚基、1-萘基、2-萘基或者對-苯甲?；交?，和m＝0-3，n＝0，o＝0。
最優(yōu)選通式(III)表示的基團Z1，其中Ar為3-吲哚基，m＝1，n＝0，o＝0。
Z2不存在或者為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物。優(yōu)選Z2不是芳香族的。
更優(yōu)選Z2為包括Ser、Thr、Glu、Asp、Asn、Gln、Arg、Lys及其衍生物的極性氨基酸(包括，例如N-烷基化的和Cα-甲基化的極性氨基酸和具有改性側鏈長度的極性氨基酸衍生物，比如同型衍生物和Orn)。特別優(yōu)選的基團Z2選自在生理條件下帶有負電荷的如上所定義的極性氨基酸，比如GIu、Asp、同型-Glu和同型-Asp。最優(yōu)選的基團Z2為GIu或者Asp。
Z3是如以上對于Z1所定義的殘基。也就是說，Z3為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者通式(II)表示的基團，其中 A1表示NR2、CO、CHR2、O或者S， R1表示C1-4烷基、苯基或者芐基，和N(R2)，其中烷基、苯基或者芐基帶有至少一個基團N(R2)和任選一個或多個獨立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個或更多個A和/或兩個或更多個R2可以彼此相同或者不同，和 Ar是具有6-14個碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳香環(huán)系統(tǒng)的芳香基團，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者被一個、兩個或者三個獨立地選自A、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或Hal的基團取代，或者Het， Hal選自F、Cl、Br或者I， Het是如以上對于Z1所定義的雜環(huán)殘基， A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代， m和o獨立地選自0、1、2、3和4， n為0或者1，和 R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情況下，為氨基酸側鏈。
更優(yōu)選的基團Z3包括蛋白原芳香氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His)及其衍生物，特別是在其側鏈上帶有1～3個獨立地選自C1-4烷基、鹵素原子或者芐基的取代基的那些衍生物。所述衍生物的一般實例為Tyr(OMe)、Tyr(OBn)、Trp(Me)。其它更優(yōu)選的基團Z3包括環(huán)己基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、噻吩丙氨酸、苯并噻吩丙氨酸、苯基甘氨酸、對-苯甲?；彼?、高苯丙氨酸(homophenylalanine)、同型酪氨酸(homotyrosinc)、同型色氨酸(homotryptophane)、同型組氨酸(homohistidine)和如上關于天然氨基酸所述的它們的衍生物。
其它更優(yōu)選的基團Z3包括以上通式(III)表示的基團，其中Ar表示苯基、2-羥苯基、3-羥苯基、4-羥苯基、1-萘基、2-萘基、對-苯甲酰基苯基、聯苯基、2-吲哚基、3-吲哚基、噻吩、苯并噻吩，它們各自帶有1～3個獨立地選自A和Hal的取代基，和其中式(III)的剩余取代基如以上關于Z1所定義的。
最優(yōu)選的基團Z3選自1-NaI、Phe、Tyr和Tyr(OMe)。本發(fā)明的二肽和三肽基團B中的殘基Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3各自經肽鍵進行連接。
本發(fā)明的優(yōu)選化合物包括選自以下殘基組合的那些二肽或者三肽基團B: (i)Z1的更優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (ii)Z1的特別優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (iii)Z1的最優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (iv)Z2的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (v)Z2的特別優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (vi)Z2的最優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的優(yōu)選實施方案的組合； (vii)Z3的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z2的優(yōu)選實施方案的組合； (viii)Z3的最優(yōu)選實施方案與Z1和Z2的優(yōu)選實施方案的組合； (ix)Z1的更優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (x)Z1的特別優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (xi)Z1的最優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (xii)Z2的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (xiii)Z2的特別優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (xiv)Z2的最優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的更優(yōu)選實施方案的組合； (xv)Z3的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z2的更優(yōu)選實施方案的組合； (xvi)Z3的最優(yōu)選實施方案與Z1和Z2的更優(yōu)選實施方案的組合； (xvii)Z1的更優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實施方案的組合； (xviii)Z1的特別優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實施方案的組合； (xix)Z1的最優(yōu)選實施方案與Z2和Z3的最優(yōu)選實施方案的組合； (xx)Z2的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的最優(yōu)選實施方案的組合； (xxi)Z2的特別優(yōu)選實施方案與Z1和Z3的最優(yōu)選實施方案的組合； (xxii)Z3的更優(yōu)選實施方案與Z1和Z2的最優(yōu)選實施方案的組合； 肽和/或擬肽序列的方向可以反轉(稱為“反式肽(retropeptide)”)。
Q為任選的有機間隔分子。
有機間隔分子在本質上是已知的?！坝袡C物”為除碳化物和碳酸鹽化合物的所有碳化合物，參見Beilstein′s Handbook ofOrganic Chemistry。通常，有機間隔分子是在一個或者兩個末端具有官能團的直鏈烴。所述烴鏈可以被改性。優(yōu)選的有機間隔分子包括氨基酸或者[-NH-(CH2)x-CO]w、[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w、[CO-(CH2)z-CO-]、[NH-(CH2)z-NH-]、[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]或者[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]殘基及其組合。標記w、x、y和z分別為1-8；1-5；1-6和1-6。此外，肽、糖和其它聚醚可以充當有機間隔分子。
X為任選的有機錨定分子。
有機錨定分子是可以用于連接片斷(即化合物和樹脂)的分子或者分子基團。所述有機錨定分子在本質上是已知的。通常，有機錨定分子包含兩個或者更多個可以形成化學鍵的官能團。
優(yōu)選的有機錨定分子包括天然存在或者非蛋白氨基酸或者-A1-(CH2)p-A2、-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2、A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2、＝CR2-(CH2)p-A2、-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、-A1-CH(COR4)(CH2)q-A2或者＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2殘基。
優(yōu)選A1為NH，還可以是CO、CHR2、O或者S，和優(yōu)選A2為SH，還可以是N3、C≡CH、NH-NH2、O-NH2、NH2、Hal1、CR5O或者羧基。
此外 R2為如上所定義的， R3為如上關于Z1所定義的， R4為-OR6或者-NHR3， R5為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基， R6如上關于Z1所定義， p為1-20， q為1-20， y為1-6， z為1-6， Hal如上所定義， Hal1為Cl、Br或者I。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，基團-Q-X的特征在于一個殘基選自-同型-Cys-OH、-Gly-Cys-OH、-Aha-Cys-OH、-Gly-Aha-Cys-OH及其衍生物。優(yōu)選的衍生物是含有硫醇基以及參與與相鄰殘基(優(yōu)選Z3)形成肽鍵的氮原子，和其中所述氮原子和硫醇基的硫原子通過2～14個獨立地選自C、N和O的原子的線性鏈進行連接。優(yōu)選所述衍生物未被取代或者帶有1～3個選自如以上對于Z1所定義的R3的取代基。
此外，本發(fā)明涉及制備式I化合物及其鹽的方法。預期比如N-末端改性或者羧基-末端改性的衍生物的結構單元屬于本發(fā)明的一部分。
所述式I化合物可具有一個或多個手性中心，并且因此可以以多種立體異構形式存在。本發(fā)明包括所有所述立體異構形式。
據此，本發(fā)明特別涉及其中至少一個所述殘基被提及作為優(yōu)選的式I化合物。
特別優(yōu)選給出以下式I的化合物(在此使用的結合分子B以粗體標記，間隔物Q以斜體標記): a)H-Trp-Glu-Tyr-Cys-OH (P1) b)Ac-Trp-Glu-Tyr-Cys-NH2 (P2) c)H-Trp-Glu-Tyr-homo-Cys-OH (P3) d)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Cys-OH (P4) e)H-Trp-Glu-Tyr-Aha-Cys-OH (P5) f)H-Trp-Glu-Tyr-Gly-Aha-Cys-OH (P6) g)H-D-Cys-D-Tyr-D-Glu-D-Trp-OH (P7) h)H-Trp-Glu-Phe-Cys-OH (P8) i)H-Trp-Glu-1-Nal-Cys-OH (P9) j)H-Trp-Glu-Tyr(OMe)-Cys-OH (P10) k)H-Trp-Asp-Tyr-Cys-OH (P11) l)H-Bpa-Glu-Tyr-Cys-OH (P12) m)H-1-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH (P13) n)H-2-Nal-Glu-Tyr-Cys-OH(P14) o)IAA-Glu-Tyr-Cys-OH (P15) p)IAA-Asp-Tyr-Cys-OH (P16) q)IBA-Glu-Tyr-Cys-OH (P17) r)IBA-Asp-Tyr-Cys-OH (P18) s)IPA-Glu-Tyr-Cys-OH (P19) t)IPA-Asp-Tyr-Cys-OH (P20) u)
n＝1 (P21) n＝2 (P22)
n＝1(P23) n＝2(P24) w)
式I化合物可以被理解為非天然肽或者擬肽衍生物，并且可以部分或者完全合成，例如利用本領域已知的溶液或者固態(tài)合成工藝(Gysin，B.F.；Merrifield，R.B.J.Am.Chem.Soc.1972，94，3102；或者Merrifield，R.B.Angew.Chemie Int.Ed.1985，24(10)，799-810)，應用適當的氨基或者羧基結構單元合成。順序合成是在被關注的。可以將其它有機合成方法用于根據式I的化合物的合成中，比如描述在Houben-Weyl，Methods ofOrganic Chemistry，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart中的方法。
如果期望，所述原料還可以原位形成，無需將它們從反應混合物中分離，而是隨后將它們進一步轉化為式I的化合物。
適宜的惰性溶劑為，例如，烴類如己烷、石油醚、苯、甲苯或者二甲苯；氯代烴如三氯乙烯、1，2-二氯乙烷、四氯甲烷、氯仿或者二氯甲烷；醇如甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇或者叔丁醇；醚如二乙醚、二異丙醚、四氫呋喃(THF)或者二噁烷；二醇醚如1，2-二甲氧基乙烷；乙酰胺如N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺或者二甲基甲酰胺(DMF)；腈如乙腈；亞砜如二甲亞砜(DMSO)；二硫化碳；羧酸如甲酸或者乙酸；硝基化合物如硝基甲烷或者硝基苯；酯如乙酸乙酯；水或者所述溶劑的混合物。
此外，式I的化合物可以由官能衍生物通過溶劑解如水解或者氫解釋放獲得。
用于溶劑解或者氫解的優(yōu)選原料是具有相應的受保護氨基和/或羥基而不是一個或者多個游離氨基和/或羥基的那些，優(yōu)選帶有氨基保護基而不是鍵接到N原子上的H原子的那些，例如那些符合式I，但是含有NHR′基團(其中R′為氨基保護基，例如BOC或者CBZ)而不是NH2基團的那些。
此外，優(yōu)選給出帶有羥基保護基而不是羥基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″O-苯基(其中R″為羥基保護基，例如叔丁基或者芐基)而不是羥基-苯基的那些。換言之，通過保護基保護共價鍵接至芳香環(huán)上的羥基不被轉化。
此外，優(yōu)選給出帶有羧基保護基而不是羧基H原子的原料，例如符合式I，但是含有R″′O-CO基團(其中R″′為羧基保護基，例如叔丁基或者芐基)而不是羧基的那些。換言之，通過保護基保護羧基的氧原子不被轉化。
在分子中還可以存在多于一個相同或者不同的保護基。如果存在的多于一個的保護基彼此不同，這提供了以下優(yōu)點:它們可以選擇性地進行裂解。
術語“氨基保護基”是已知的通用術語，涉及適于防止(阻止)氨基進行化學反應但是容易除去的基團。所述基團一般為，特別是未被取代或者被取代的?；?、芳基、芳烷氧基甲基或者芳烷基。由于所述氨基保護基在期望的反應(或者反應順序)發(fā)生之后被除去，而且它們的類型和大小并非至關重要的；然而，優(yōu)選給出具有1～20個碳原子，特別是具有1～8個碳原子的那些。術語“?；卑ㄔ从谥?、芳脂族、芳族或者雜環(huán)羧酸或者磺酸的?；鶊F，并且尤其是烷氧基羰基、芳氧基羰基和特別是芳烷氧基羰基。所述?；膶嵗秊橥轷；缫阴；?、丙?；投□；?；芳烷?；绫揭阴；?；芳?；绫郊柞；蛘呒妆锦；环佳趸轷；鏟OA；烷氧基羰基如甲氧羰基、乙氧羰基、2，2，2-三氯乙氧羰基、BOC、2-碘乙氧羰基；芳烷氧基羰基如CBZ(“芐氧羰基”)、4-甲氧基芐氧羰基、Fmoc；芳基磺?；鏜tr、Pbf或者Pmc。優(yōu)選的氨基保護基為BOC、Mtr、CBZ、Fmoc、芐基和乙?；?。
術語“羥基保護基”同樣是已知的通用術語，是指適用于防止羥基進行化學反應、但是在期望的化學反應在分子其它位置已經進行之后易于被除去的基團。所述基團一般為上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者酰基，此外還可以為烷基。羥基保護基的本性和大小并不是至關重要的，因為它們在期望的化學反應或者反應序列之后會被再次除去；優(yōu)選給出具有1～20個，特別是1～10個碳原子的基團。羥基保護基的實例尤其是芐基、對硝基苯甲?；?、叔丁基和乙酰基，其中特別優(yōu)選芐基和叔丁基。
術語“羧基保護基”同樣是已知的通用術語，是指適用于防止羧基進行化學反應、但是在期望的化學反應在分子其它位置已經進行之后易于被除去的基團。所述基團一般為上述未被取代或者被取代的芳基、芳烷基或者?；?，此外還可以為烷基。羧基保護基的本性和大小并不是至關重要的，因為它們在期望的化學反應或者反應序列之后會被再次除去；優(yōu)選給出具有1～20個，特別是1～10個碳原子的基團。羧基保護基的實例尤其是芐基、叔丁基和乙?；渲刑貏e優(yōu)選芐基和叔丁基。
式I的化合物自它們的官能衍生物脫離(取決于所應用的保護基)，例如使用強酸(有利地使用TFA或者高氯酸)，而且也可以使用強無機酸(比如鹽酸或者硫酸)、強有機羧酸(比如三氯乙酸)或者磺酸(比如苯磺酸或者對甲苯磺酸)。也可以存在其它惰性溶劑，但是并不總是必需的。適宜的惰性溶劑優(yōu)選為有機溶劑，例如羧酸(比如乙酸)、醚(比如四氫呋喃或者二噁烷)、酰胺(比如DMF)、鹵代烴(比如二氯甲烷)，此外還可以為醇(比如甲醇、乙醇或者異丙醇)和水。此外，上述溶劑的混合物也是適宜的。優(yōu)選過量使用TFA而不加入其它溶劑，優(yōu)選高氯酸以比例9:1的乙酸和70％高氯酸的混合物形式應用。用于離解的反應溫度有利地為約0～約50℃，優(yōu)選15～30℃(室溫)。
BOC、OBut、Pbf、Pmc和Mtr基團可以，例如，優(yōu)選利用TFA在二氯甲烷中進行離解，或者利用大約3～5N HCl在二噁烷在15-30℃下進行離解，Fmoc基團可以利用大約5～50％的二甲胺、二乙胺或者哌啶的DMF溶液在15-30℃下進行離解。
三苯甲基基團用于保護氨基酸組氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸。它們利用TFA/10％苯硫酚、TFA/苯甲醚、TFA/茴香硫醚或者TFA/TIPS/H2O進行離解，三苯甲基基團從所有所述氨基酸上都被離解下來。
Pbf(五甲基苯并呋喃基)基團用于保護Arg。它利用例如TFA在二氯甲烷中進行離解。
可氫化除去的保護基(例如CBZ或者芐基)可以例如在催化劑(例如，貴金屬催化劑，比如鈀，有利地在比如碳的載體上)存在下通過氫氣處理得到離解。在此，適宜的溶劑為如上所述的那些溶劑，特別是，例如醇(比如甲醇或者乙醇)或者酰胺(比如DMF)。氫解通常在約0～100℃的溫度和在約1～200bar的壓力下進行，優(yōu)選在10～30℃和1～10bar下進行。在甲醇中的5～10％Pd/C上或者使用在甲醇/DMF中的Pd/C上的甲酸銨(而不是氫)在10～30℃下，CBZ基團的氫解可以充分完成。
將式I的堿可以利用酸轉化為相關的酸加成鹽，例如使等量的堿與酸在惰性溶劑(比如乙醇)中反應，隨后進行蒸發(fā)。由此，可以使用無機酸，例如硫酸、硝酸、氫鹵酸(比如，氫氯酸或者氫溴酸)、磷酸(比如正磷酸)或者氨基磺酸?？梢允褂糜袡C酸，包括脂族、脂環(huán)族、芳脂族、芳香族或者雜芳香一元或者多元羧酸、磺酸或者硫酸，例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸或者乙磺酸、乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、萘單磺酸和萘二磺酸以及月桂基硫酸。鹽，例如苦味酸鹽，還可以用于分離和/或純化式I的化合物。
另一方面，通過與堿反應，式I的酸可以轉化為它的一種金屬銨鹽。在此適宜的鹽為，特別是鈉、鉀、鎂、鈣和銨鹽，其它取代的銨鹽，例如二甲基-、二乙基-或者二異丙基-銨鹽，單乙醇-、二乙醇-或者二異丙酰基銨鹽，環(huán)己基銨鹽、二環(huán)己基銨鹽、二芐基亞乙基二銨鹽，此外，例如與精氨酸或者賴氨酸形成的鹽。
根據本發(fā)明的一種實施方案，提供了制備上述在Z2和Z3之間具有還原肽鍵的擬肽的有利方法: 為了獲得較大量的所述肽和擬肽，通常認為在溶液中進行合成是有利的，而不是利用固態(tài)合成方法。然而，與固態(tài)合成方法不同，在溶液中進行的合成包括一些在溫和酸性條件下進行的反應步驟，這可能潛在地導致酸敏感保護基(比如三苯甲基保護基)的不慎離解(Zervas，L.；Photaki，I.On Cysteine andCystine Peptides.1.New S-Protecting Groups for Cysteine.Journal of the American Chemical Society 1962，84，3887-3897)。
基于以下原因，該問題對本發(fā)明的多種化合物是特別顯著的。本發(fā)明的多種化合物在C-末端含有半胱氨酸殘基，因為半胱氨酸的硫醇基可以用于將化合物結合到樹脂載體上。然而，溶液態(tài)合成通常在C-末端至N-末端上進行，從而抑制了產生外消旋化副反應的問題。如果本發(fā)明化合物利用該方法實現，那么半胱氨酸殘基應當在多步反應序列的早期階段引入。這反過來意味著半胱氨酸殘基的三苯甲基保護基必須要經受相對大量的反應步驟。這顯然加重了所述的三苯甲基-相關的穩(wěn)定性問題。
根據本發(fā)明的該實施方案，提供了使所述三苯甲基-相關的穩(wěn)定性問題最小化同時保持低外消旋化副反應風險的合成方法。也就是說，現已發(fā)現，如果合成方向逆向使得半胱氨酸殘基在多步反應順序末引入到分子中，與三苯甲基-相關的穩(wěn)定性問題可以得到有效避免。此外，已經發(fā)現，與肽的合成相反，如果Z2和Z3之間的鍵不含有羰基，不會引發(fā)外消旋化問題。由此，本發(fā)明提供了制備根據本發(fā)明的擬肽的方法，其特征在于，在殘基Z2和Z3之間的鍵中不存在羰基，并且優(yōu)選含有半胱氨酸殘基作為錨定分子，其中所述方法在溶液中進行，使得半胱氨酸殘基成為最后被引入的殘基。
為了例證說明的目的，以下提供了根據本發(fā)明該實施方案的擬肽P22合成的一般說明: P22的溶液相合成。該合成由其中吲哚氮被叔丁氧羰基(Boc)基團根據文獻方法保護的3-吲哚乙酸(35)開始(途徑1):通過在甲醇中用SOCl2處理，將化合物35轉化為它的甲酯，隨后吲哚氮通過與二碳酸叔丁酯和DMAP在乙腈中反應而用Boc基團保護，從而獲得36。然后進行皂化，得到期望的吲哚乙酸37。
途徑1.N-取代的glutamol 40的合成。

試劑和條件:(a)SOCl2、MeOH，18h；(b)Boc2O、DMAP、乙腈，4h，(兩步)；(c)LiOH、THF、MeOH、H2O，18h；(d)哌啶、DMF，1h；(e)HOBt、TBTU、DIPEA，0℃→室溫，4h，(兩步)。
向40的轉化可以利用HOBt和TBTU作為偶聯劑，通過將37偶聯到側鏈受保護的glutamol 39上實現。通過用哌啶處理，39可以容易由市售Fmoc-Glutamol(OtBu)(37)獲得，其不需進一步純化即可使用。39中的游離羥基官能度的保護不是必需的，反應可以清潔地進行，從而給出N-取代的glutamol 40。目標化合物P22中連接谷氨酸和酪氨酸殘基的還原肽鍵由相應的醛41和市售Tyr(tBu)OMe的還原氨基化形成(途徑2)。
途徑2.擬肽P22(指定為化合物33)的合成
試劑和條件:(a)Dess-Martin過碘烷、DCM，6h；(b)1)Tyr(tBu)OMe*HCl、MgSO4、DCM，30min；2)NaB(OAc)3H，18h，(三步)；(c)LiOH、THF、二噁烷、H2O，1.5h；(d)Cys(Trt)OtBu*HCl、HOBt、TBTU、2，4，6-三甲基吡啶，10℃→室溫，18h，(兩步)；(e)TIPS、H2O、TFA，0→95％，8h。
在醛形成期間避免堿性反應條件是重要的，因為這會導致外消旋化。由此，通過利用Dess-Martin過碘烷氧化作用和在不存在堿下短期原位預形成亞胺，然后迅速加入還原劑，外消旋化可以得到完全避免。該方法通過三步給出期望的仲胺42。通過HPLC-MS，僅僅觀察到痕量的二烷基化副產品。通過皂化使42中的甲酯離解和使所得游離酸在HOBt/TBTU和弱堿2，4，6-三甲基吡啶存在下偶聯到Cys(Trt)OtBu*HCl上，得到43(兩步)。雖然應用的半胱氨酸叔丁酯不能市場購得，但是它優(yōu)于市售的甲酯，因為它易于合成并且允許43的一步去保護，從而在酸性條件下獲得期望的游離擬肽P22。此外，這可以避免皂化之后光學純度的顯著損失。
就P22的經濟生產而言，最終的去保護和純化是關鍵步驟。通過將P22懸浮在劇烈攪拌的水和TIPS(1:1)的混合物中和在8小時時間內緩慢加入TFA至95％的最后濃度，這些步驟可以進行而無副產品形成。通過該方法，副產品形成被大大降低，從而在醚/戊烷中沉淀之后以高產率和高純度獲得最終的游離擬肽P22。
本發(fā)明化合物可以按照如下所述進行應用。
診斷應用:血友病甲的確切診斷通過進行FVIII測定和測量凝固時間進行評價。因此，將患者血漿與來自先天缺乏FVIII的患者或者來自人工排除來源(artificially depleted source)的FVIII-缺乏血漿混合。將縮短凝結時間的有效性程度與正常血漿的程度進行對比。標準曲線使用血友病血漿稀釋收集的新鮮正常人血漿和繪制凝結時間與稀釋液的曲線來形成。
雖然凝結測試仍然是用于手術前藥物篩選和用于治療監(jiān)控的最經常進行的測定，但是這些測試完全依賴于酶促步驟。血漿中的凝血因子通常是惰性的，第一步需要進行蛋白水解活化。此外，這些酶促步驟不僅需要活化的凝血因子，而且還需要活化的輔因子、磷脂和鈣離子。這意味著在測定中涉及相對不穩(wěn)定的蛋白的非常復雜混合物，這可能低估實際的FVIII水平。為了克服該問題，另外評價患者中FVIII的絕對水平是重要的。這通常通過應用不穩(wěn)定的抗-FVIII抗體的ELISA測試實現。這些抗體可以用本發(fā)明的肽和擬肽替換。當用于該目的時，同當前使用的用于ELISA測試中的不穩(wěn)定抗-FVIII抗體相比，根據本發(fā)明的肽具有顯著的優(yōu)點。用于檢測患者血漿中總FVIII量的敏感篩選試劑盒的研制受益于肽的優(yōu)點，發(fā)現它們具有更強的穩(wěn)定性、更高的敏感性和更低的測定成本。
用于穩(wěn)定目的:FVIII顯示出迅速失活作用和短的半衰期。FVIII的半衰期的定義為活性雜三聚FVIII(A1/A2/A3-C1-C2)的A2亞單位的自發(fā)分解速率，其中A2亞單位與A1和A3-C1-C2亞單位經離子相互作用微弱締合。對于活性FVIII的正常穩(wěn)定性，需要雜三聚體中存在A2。
本發(fā)明的肽和擬肽不僅對FVIII表現出高親合性，而且通過結合，它們還用于穩(wěn)定雜三聚體。由此，這些創(chuàng)造性的化合物與FVIII的結合可以在血友病甲治療中以有利的方式使用，從而增強治療期間FVIII的穩(wěn)定性和半衰期。替代治療期間FVIII的較長半衰期將緩解患者的安寧狀況(well-being)，因為這可以降低FVIII的輸注頻率。所述穩(wěn)定作用還可以用于有利地增強含FVIII藥物在它們給藥之前的貯存期限。
用于標記、檢測和鑒定:本發(fā)明化合物還可以帶有標記物基團，比如放射性同位素或者可以進行著色反應的官能團等等。本發(fā)明所述化合物與FVIII的接觸將導致標記物肽或者擬肽與FVIII的結合。這反過來允許檢測，和根據具體情況定量存在于樣品中的FVIII。在治療中的應用:除了上述穩(wěn)定作用之外，本發(fā)明化合物此外可以增強FVIII的生物活性。此外，本申請的化合物可能具有抑制抗體與給藥的FVIII結合的有利作用。通過使FVIII與本發(fā)明化合物在給藥之前接觸，這些有益作用可以用于治療中。本發(fā)明化合物將結合FVIII，由此形成配合物。該配合物而不是純FVIII的給藥會導致增強的生物學作用(或者，作為選擇，允許給藥更低的FVIII劑量)。此外，該配合物的給藥可能有助于降低抗體的失活作用。簡要地說，本發(fā)明化合物可以用于制造同通常的FVIII相比顯示出更高的穩(wěn)定性和優(yōu)良活性的基于FVIII的藥物。在所述常規(guī)的FVIII被抗體鈍化的情形中，所述基于FVIII的藥物還可以用于替代常規(guī)的FVIII。此外，本發(fā)明還涉及治療血友病甲的方法，包括將有效劑量的所述FVIII配合物和本發(fā)明化合物給藥至需要其的對象的步驟。在制造基于FVIII的藥物中的應用:本發(fā)明的另一實施方案涉及本發(fā)明化合物用于純化粗FVIII和FVIII-類似蛋白的用途。這優(yōu)選包括本發(fā)明化合物在固體載體上的固定。更優(yōu)選，親合色譜法利用由本發(fā)明化合物涂覆的樹脂進行。所述應用更詳細地描述在以下實施例3～5中。
在制造診斷學和/或研究工具中的應用:此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明化合物用于純化FVIII和FVIII-類似蛋白的結構域、表位和片段的用途。雖然所述純化的結構域等等可能不會表現出與FVIII相當的凝結活性，不過它們可以作為研究工具等等用于診斷試劑盒中。
實施例 根據以下參數使用層析法:RT＝保留時間(分鐘)，在HPLC上，在以下系統(tǒng)中: 柱:YMC ODS A RP 5C18，250×4.6mm 洗脫液A:在水中0.1％TFA 洗脫液B:在乙腈中0.1％TFA 流速:1mL/min 梯度:10->50％B/30min。
質譜(MS):ESI(電噴射離子化)(M+H)+ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE):FVIII SDS-PAGE利用10％Tris-Glycine Bio-Rad ReadyGel進行。將樣品稀釋于含有2-巰基乙醇的加樣緩沖液中并且施加到凝膠上。電泳在恒定電流(25mA/gel)下在置于冰上的Bio-Rad Mini-Protean 3裝置上進行。電泳之后，凝膠利用標準銀染色方案進行染色。
免疫印跡:將蛋白轉入在具有傳送阻塞(transfer block)的Bio-Rad Mini-Protean 3裝置中的硝化纖維膜上。傳送在恒定70V電壓(～250mA)下進行4小時，同時安裝冷凍的冷卻阻塞(cooling block)。膜用在TBS中的5％脫脂奶粉，pH8.0阻斷過夜。然后，膜用在含有0.1％Tween-20的TBS pH＝7.4中的5％脫脂奶粉溶液中稀釋至1μg/mL的一抗溫育1小時。
在含有0.1％Tween-20的TBS(pH＝7.4)中將膜洗滌3次，并且用在TBS pH＝7.4，0.1％Tween-20中的5％脫脂奶粉中稀釋至1:3000的過氧化物酶-標記的山羊抗鼠抗體(Mab C5和Mab 413)溫育1小時。用TBS，0.1％Tween-20洗滌3次之后，將膜在ECL化學發(fā)光基質中(Pharmacia)進行顯影和利用BioMax-XL膠片(Kodak)對化學發(fā)光進行檢測。
Rink-amid樹脂代表4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基樹脂，其使得例如具有C-末端-CONH2基團的肽和擬肽衍生物能夠合成，TCP樹脂表示三苯甲基氯-聚苯乙烯樹脂。
化合物P1～P20利用Fmoc-策略，分別在TCP樹脂和用于化合物P2的Rink-amide樹脂上經固相肽合成進行合成(參見Fields，G.B.；Nobie，R.L.Int.J.Pept.Protein Res.1990，35，161)。
N-末端乙?；?化合物P2)在固相下，通過在最終離解和去保護步驟之前，用NMP/Ac2O/DIPEA(91:7:2)混合物處理相應的N-末端去保護化合物實現(參見以下)。
化合物P21～P25在TCP樹脂上利用Fmoc-策略連續(xù)完全合成?！斑€原的肽鍵”在固相上，利用氨基酸相應的醛，經自身已知的還原烷基化反應形成(＂amino aldehyde＂，參見Krchnak，V.；Weichsel，A.S.；Cabel，D.；Flegelova，Z.；Lebl，M.MoI.Diversity1995，1，149)。反應在水截留(water trapping solvent)的溶劑(比如三甲氧基甲烷)中，在室溫下進行。形成為中間產物的相應亞胺化合物的還原在非質子溶劑(比如二氯甲烷)中，在室溫下進行。作為還原劑，使用配位硼氫化合物，比如NaBH(OAc)3。
利用90％TFA，5％H2O和5％TIPS，肽或者擬肽從固相的離解和它們的側鏈保護基的離解同時進行。
所有化合物都通過制備的HPLC進行純化。
實施例1:作為對于FVIII的親合性配體的化合物的制備和pd-FVIII的結合 將肽P1～P25固定在Toyopearl AF-Epoxy-650M樹脂(TosohBiosep)上，如Jungbauer等人所述。為了進行固定，將2.5mg各種肽溶于0.25mL固定緩沖液(0.2M碳酸氫鈉，pH10.3)中，并且將0.036g干燥樹脂粉末(相當于0.125mL溶脹樹脂)加入其中，隨后在溫和轉動下將混合物溫育48小時。在溫育48小時之后，樹脂用固定緩沖液洗滌一次，用1M NaCl洗滌一次，然后用結合緩沖液洗滌3次，并且對125I-標記的pd-FVIII與肽涂覆樹脂和對照樹脂的結合進行測試。在各個記錄的試驗中，各種肽的偶聯密度記載在表1中。在肽不存在下，在平行試驗中，對對照0.25mL樹脂部分進行類似地處理，并且隨后在125I-pd-FVIII結合試驗中將其用作對照(指定為背景)。125I-pd-FVIII結合/背景的比例計算如下，使結合到固定肽的125I-pd-FVIII的量除以結合到如上所述制備的未涂覆對照樹脂的量。該比例表示微珠測定的信號/噪聲比，因為與肽結合的125I-pd-FVIII表示信號值，肽未涂覆樹脂結合的125I-pd-FVIII表示背景(噪聲)值。
源于血漿(pd-)的人類因子VIII(FVIII)通過以下方法從濃縮物中純化，在抗-FVIII單克隆抗體柱上進行免疫親和層析，隨后通過離子交換色譜法，利用Resource Q HR5/5柱濃縮pd-FVIII。為了從vWf中分離FVIII，在親合性純化之前，在0.35MNaCl，0.04M CaCl2中對濃縮物進行溫育。
可能存在于pd-FVIII制劑中的痕量vWf通過使pd-FVIII制劑通過具有抗-vWf高親合性單克隆抗體的柱被除去，其中高親合性單克隆抗體以1.4mg/ml樹脂的密度固定。
利用乳過氧化物酶珠粒和0.5mCi Na125I，10μg純化的pd-FVIII得到碘化。
在結合緩沖液(0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80)中，對具有固定肽的樹脂進行洗滌。隨后，在結合緩沖液將樹脂稀釋為1:7漿液并且將試樣等分入Eppendorf管中(40μl/管)。將125I-pd-FVIII(100000cpm，10μl)加入到管中，并且通過加入50μl含有4％BSA的結合緩沖液將混合物的體積調節(jié)至100μl，從而給出2％的最終BSA濃度。在旋轉器上在室溫下溫育2小時之后，在結合下將樣品洗滌4次。在各次洗滌之后，在Eppendorf微量離心機中，在5000rpm下將管離心1分鐘，將上清液除去，將樹脂再懸浮在洗滌緩沖液中，隨后在相同條件下進行離心。四次洗滌之后，對具有丸粒而無上清液的管的放射能力進行讀數。對不存在肽的樹脂進行類似處理以說明與管和樹脂自身的非特異性pd-FVIII結合，并且將該對照管的放射能力認為是背景值。因為125I-pd-FVIII含有一些在放射性標記期間被破壞的組分，因此將結合計算為與用抗-FVIII Mab 8860-涂覆樹脂進行的分離試驗中確定的最大可實現結合的百分比。
所有測量都一式兩份進行。各試驗利用兩個獨立制備的固定肽樣品進行。存在于各個圖中的數據是四次測定的平均值:兩次測定中的重復測量利用肽在不同天數時獨立固定于其上的珠粒進行。以上四次重復測定(在兩次獨立試驗中重復進行測定)的標準偏差值一般小于與肽結合的125I-pd-FVIII的測量值的10％。



比較例1:制備具有錯義序列(scrabled sequence)的比較化合物作為用于FVIII的比較配體和與pd-FVIII的結合 利用具有任意的錯義氨基酸序列(ECYYEHWS)的肽，重復實施例1中描述的方法。隨后，按照與以上實施例1中所述的相同方式，對FVIII與帶有該錯義肽的樹脂的結合以及FVIII與未涂覆樹脂的結合進行研究。結果示于下表2中。
表2:125I-標記的因子VIII與固定在

AF-Epoxy-650M上的比較化合物和與未涂覆形式的相同樹脂的結合。
a序列:ECYYEHWS；b未涂覆樹脂 實施例1中報道的結果與比較例1的結果對比表明，同錯義肽相比，本發(fā)明化合物對FVIII表現出顯著更高的親合性。
實施例2:利用P15涂覆的樹脂和P22涂覆的樹脂的重組FVIII的結合

和

是分別從Bayer以及Wyeth-AyerstPharmacia and Upjohn商購獲得的FVIII重組形式。


由總量4000IU(5管形瓶)利用免疫親合色譜法，隨后利用使用具有NaCl線性梯度的Resource Q HR5/5柱的離子交換色譜來純化。純化

的濃度為130μg/ml，活性740IU/mL，和比活性5700IU/μg。

由總量5000IU(5管形瓶)利用免疫親合色譜法，隨后利用使用Resource Q HR5/5柱的離子交換色譜來純化。經純化的

的濃度為89μg/ml，活性864IU/mL，和比活性97071U/μg。
按照與實施例1中關于pd-FVIII所述相同的方式，對

和

進行碘化。利用與以上實施例1所述相同的方法，對蛋白結合進行測量。這些試驗的結果概述于下表3中。
表3重組FVIII與P15涂覆的樹脂和P22涂覆的樹脂的結合 該試驗的結果表明，本發(fā)明化合物還對FVIII-類似蛋白如重組FVIII表現出高親合性。
實施例3:利用P22涂覆的樹脂進行的活性pd-FVIII的純化 如實施例1中所述，將擬肽衍生物P22固定在Toyopearl上樹脂。使用25mg肽和360mg樹脂。將所得樹脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。利用Waters 650E Advanced ProteinPurification System進行純化工藝。緩沖液A為0.01M Hepes，0.1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80，緩沖液B為0.01MHepes，1M NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween-80(pH6.8)。通過流經UV檢測器(Waters 490 E)通過在280nm(OD280)下的光密度，對洗脫進行監(jiān)控。然后，通過確定OD280分析洗脫餾分的蛋白含量，FVIII活性在一期APTT分析中利用MLA Electra-800自動凝血計時器進行確定。來自于洗脫餾分的樣品通過10％PAGE，隨后銀染色和利用抗FVIII的單克隆抗體的Western印跡法進行分析。
如上所述的預先通過免疫親合和離子交換色譜法純化的FVIII(0.5mg)，用0.01M Hepes，5mM CaCl2，0.01％Tween-80稀釋至最終0.1M NaCl的鹽濃度。將混合物施加到P22-柱上，隨后用緩沖液A洗滌，直至OD280重新回到背景值為止。結合的蛋白用20％緩沖液A、80％緩沖液B洗脫。所得洗脫圖形示于圖1中。
FVIII的純化從含FBS的SF9細胞條件培養(yǎng)基中進行，用FVIII示蹤。如上所述的預先通過免疫親合和離子交換色譜法純化的FVIII(0.5mg)與含FBS的SF9細胞條件培養(yǎng)基混合，所述介質用0.01M Hepes、5mM CaCl2、0.01％Tween-80稀釋至最終0.1MNaCl的鹽濃度。將混合物施加到柱上，隨后用緩沖液A洗滌，直至OD280重新回到背景值為止。用85％緩沖液A、15％緩沖液B進行洗滌，從而洗脫一些結合污染的蛋白。結合的蛋白用40％緩沖液A、60％緩沖液B洗脫。所得洗脫圖形示于圖2中。
表4.在含FBS的培養(yǎng)基中進行FVIII純化的定量參數。

在兩次純化中，都實現了高度滿意的柱保留和成功洗脫(圖3和4)。在從含FBS的培養(yǎng)基中純化FVIII期間，相對于FVIII過量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(圖3和4，表4)。
擬肽-純化的FVIII樣品視覺上不同于以下譜帶，使用商購的純FVIII制劑作為陽性對照(條帶2，圖3，條帶2圖4):230-90kDa重鏈譜帶，由于B-結構域的不同蛋白水解而不均質，和～80kDa輕鏈雙重譜帶(由于不同的糖基化(glycosilation))，其通常不能再溶解，分子量～55kDa的個別蛋白水解譜帶，和分子量～45kDa的另一蛋白水解譜帶。兩種制劑都未含有可檢測量的一些源于45kDa重鏈蛋白水解譜帶的更深度蛋白水解。SDS-PAGE表明，用FVIII示蹤的由先前純化的FVIII的純化和由含FBS的DMEM條件培養(yǎng)基的純化的洗脫餾分具有基本上相同數目的蛋白譜帶，和譜帶之間的物質分布基本上沒有不同于陽性對照FVIII。這些結果證實，同市售免疫親合純化的FVIII對照相比，由細胞條件培養(yǎng)基或者純背景得到的肽-純化FVIII制劑顯示出相同的SDS-PAGE和Western blot圖案。
實施例4:用P1涂覆的樹脂的FVIII的純化 如實施例1中所述，將肽P1鍵接至樹脂上。使用25mg肽和360mg樹脂。將所得樹脂(～1ml)填塞到玻璃柱(Pharmacia-Biotech)中。如關于實施例3所述對含FVIII的樣品進行純化，兩次試驗之間的唯一差異在于在本試驗中不存在用緩沖液A的預洗脫步驟。
純化的細節(jié)概括于以下表5中:
在兩次純化中，都實現了高度滿意的柱保留和成功洗脫(圖5和6)。在從含FBS的培養(yǎng)基中純化FVIII期間，相對于FVIII過量存在于源溶液中的污染蛋白被成功除去(圖6，表5)。
權利要求
1.式I的化合物以及它們的鹽，
B-Q-X (I)
其中B表示Z1-Z2-Z3，
其中Z1為具有單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)側鏈的天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，所述單環(huán)、雙環(huán)或者三環(huán)側鏈具有6～25個碳原子，其中這些碳原子中的一個或者多個可以被選自N、O和S的雜原子替換，或者其中
Z1為下式的殘基
Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-A1(II)
其中
A1表示選自NR2、CO、OCO、CHR2、O或者S的基團，
R1表示選自C1-4烷基、苯基、芐基和N(R2)2的基團，其中烷基、苯基或者芐基可以帶有一個或多個獨立地選自A和N(R2)2的取代基，其中兩個或更多個A和/或兩個或更多個R2可以彼此相同或者不同，
Ar是具有6-14個碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳環(huán)體系的芳香基團，飽和或者部分不飽和的C5-14單-或者雙環(huán)烷基，它們各自未被取代或者帶有1-3個獨立地選自A、Ar1、O-Ar1、C(O)-Ar1、CH2-Ar1、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2、Hal的取代基；或者Ar可以是Het，
Hal選自F、Cl、Br或者I，
Ar1是具有6-14個碳原子的單-、雙-或者三環(huán)芳環(huán)體系的芳香基團，優(yōu)選苯基或者萘基，更優(yōu)選苯基，Ar1可以自身未被取代或者帶有1-3個獨立地選自A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2和Hal的取代基；
Het表示具有5-12個環(huán)成員的任選取代的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，該環(huán)成員包含1-3個N-和/或1個S-或者O-原子，
A表示COOR2、N(R2)2或者具有1-6個C原子的直鏈、支鏈或者環(huán)狀烷基，其可以未被取代或者被COOR2或者N(R2)2取代，
m和。獨立地選自0、1、2、3和4，
n為0或者1，和
R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，其為氨基酸側鏈；
Z2表示天然存在或者非天然氨基酸，在其側鏈上不帶有芳香基團；
Z3表示如上對于Z1所定義的基團，其中Z1和Z3可以彼此相同或者不同，條件是化合物內Z1和Z3的不同位置通過在鍵合或者游離價的位置上不存在或者存在的另外的氫原子分別確定；
Q不存在或者是具有1～100個骨架原子的有機間隔分子；
X不存在或者是具有選自SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、Cl、Br、I、C≡CH、CR5O或者羧基的末端基團的有機錨定分子，其中
R5選自H、C1-4烷基或者苯基或者芐基，該苯基或者芐基可以為未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal獨立地單、二或者三取代。
2.式I的化合物及其鹽，
B-Q-X(I)
包括:
B是提供對FVIII和/或FVIII-類似蛋白的親合性的二肽、三肽或者擬肽，
Q不存在或者為有機間隔分子，和
X不存在或者為有機錨定分子。
3.根據權利要求2所述的化合物，其中
B為Z1-Z2-Z3，
包括:
Z1天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者Ar-(CH2)m-(CHR1)n-(CH2)o-Al，
Z2不存在或者為天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，
Z3天然存在或者非蛋白氨基酸殘基或者其衍生物，或者Ar-(CH2)n-(CHR1)m-(CH2)o-A1，
A1NR2、CO、CHR2、O或者S，
R1C1-4烷基、苯基或者芐基，
Ar未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基，其可以為被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基，以此方式形成未被取代或者取代的聯苯基，或者Het，
HalF、Cl、Br或者I，
Het具有5-12個環(huán)成員的飽和、部分或者完全不飽和的單-或者雙環(huán)雜環(huán)殘基，該環(huán)成員包含1-3個N-和/或1個S-或者O-原子，其中雜環(huán)殘基可以被CN、Hal、OH、NH2、COOH、OA、CF3、A、NO2、Ar或者OCF3單取代或者二取代，
ACOOH、NH2或者具有1-6個C原子的、未被取代或者被COOH或者NH2取代的烷基，
m，o 0、1、2、3或者4，
n 0或者1，
由此
Z1和Z3或者Z1和Z2以及Z2和Z3可以通過酸-酰胺鍵-CO-NR2-或者-NR2-CO-，優(yōu)選通過所謂的還原肽鍵-CH2-NR2-或者-NR2-CH2-以及通過-CO-CHR2-、-CHR2-CO-、-CR2＝CH-或者-CH＝CR2-鍵進行結合，
其中
R2為H、C1-4烷基、苯基或者芐基，或者在類肽-氨基酸的情形中，其為氨基酸側鏈。
4.根據權利要求2或者3所述的化合物，其中Q為選自以下基團之一的有機間隔分子
[-NH-(CH2)x-CO]w、
[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w、
[CO-(CH2)z-CO-]、
[-NH-(CH2)z-NH-]、
[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]、
[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]、
氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它們的組合，
其中w分別獨立地為1～8，
x為1-5，
y為1-6和
z為1-6。
5.根據權利要求2、3或者4所述的化合物，其中X為選自以下基團之一的有機錨定分子
天然存在或者非蛋白氨基酸、
-A1-(CH2)p-A2、
-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2、
-A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2、
＝CR2-(CH2)p-A2、
-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、
＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2、
-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2或者
＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
其中
A1為NR2、CO、CHR2、O或者S，
A2為SH、N3、NH-NH2、O-NH2、NH2、Hal1、C≡CH、CR5O或者羧基，
R2為如權利要求2中所定的義的，
R3為H、R6、-COR6、-COOR6，
R4為-OR6或者-NHR3，
R5為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
R6為H、C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
p為1-20，
q為1-20，
y為1-6，
z為1-6，
Hal為如權利要求3中所定義的，
Hal1為Cl、Br或者I。
6.根據權利要求2～5任一項所述的化合物，其特征還在于Z1為Ar-(CH2)m-(CHR3)n-(CH2)o-CO-
由此
Ar為
和m、n和。為如權利要求3中所定義的。
7.根據權利要求2～6任一項所述的化合物，其特征還在于，m為1、2或者3，n為0和o為0。
8.根據權利要求2～5任一項所述的化合物，其特征還在于，
Z1為1-NaI、2-NaI、Bpa或者R7-Trp
由此
R7為H、R8、-COR8、-COOR8，
其中R8為C1-4烷基或者未被取代或者被A、OH、OA、CF3、OCF3、CN、NO2或者Hal單、二或者三取代的苯基或者芐基，
以及A和Hal為如權利要求3中所定義的。
9.根據權利要求2～8任一項所述的化合物，其特征還在于，
R7為H或者-COR8
其中R8為甲基。
10.根據權利要求2～9任一項所述的化合物，其特征還在于，
Z2是具有谷氨酸或者天冬氨酸側鏈的氨基酸殘基。
11.根據權利要求2～10任一項所述的化合物，特征還在于，
Z3是具有1-萘基丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或者O-甲基化酪氨酸側鏈的氨基酸殘基。
12.根據權利要求2～11任一項所述的化合物，其特征還在于，
Q為[-NH-(CH2)x-CO]w，
x和w為如權利要求4中所定義的。
13.根據權利要求2～12任一項所述的化合物，其特征還在于，
x為1或者5，w為0或者1。
14.根據權利要求2～13任一項所述的化合物，其特征還在于，
X為-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
其中
A1為NH，
R4為OH或者NH2，
A2為SH，
和q為如權利要求5中所定義的。
15.根據權利要求2～14任一項所述的化合物，其特征還在于，
q為1或者2。
16.根據權利要求2～15任一項所述的化合物，其特征還在于，
X為-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
其中
A1為CO，
R3為H
A2為SH
和q為如權利要求5中所定義的。
17.根據權利要求2～16任一項所述的化合物，其特征還在于，
q為1。
18.根據權利要求1～17任一項所述的化合物，其特征還在于，
氨基酸殘基可以獨立地選自α-氨基碳酸殘基、β-氨基碳酸殘基、氮雜-氨基碳酸殘基和類肽-氨基碳酸殘基。
19.根據權利要求1～18任一項所述的化合物，其特征還在于，
氨基酸殘基選自α-氨基酸殘基。
20.根據權利要求1～19任一項所述的化合物，其特征還在于，
殘基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分別通過酸-酰胺鍵-CO-NH-彼此結合。
21.根據權利要求1～20任一項所述的化合物，其特征還在于，
一個或多個肽鍵可以根據權利要求2獨立地進行改性。
22.根據權利要求1～21任一項所述的化合物，其特征還在于，
殘基Z1和Z3或者Z1和Z2或者Z2和Z3分別通過-CHH2-NH-鍵彼此結合。
23.根據權利要求1～22任一項所述的化合物，其特征還在于，
肽和/或擬肽的方向被逆轉(“反式肽”)。
24.根據權利要求1～23任一項所述的化合物，其用于疾病的治療。
25.一種載體基質，其表面鍵合有根據權利要求1～23任一項所述的化合物。
26.根據權利要求25所述的載體基質，其包含無機或者有機材料，特別是聚合物材料。
27.根據權利要求25或者26所述的載體基質，其中根據權利要求1～23任一項所述的化合物化學結合到該載體基質的表面，例如結合在樹脂上。
28.根據權利要求25或者26所述的載體基質，其中根據權利要求1～23任一項所述的一種或多種化合物通過有機間隔物結合到載體基質的表面，例如結合在樹脂上。
29.根據權利要求25或者26所述的載體基質，其中權利要求1～23任一項所述的一種或多種化合物通過有機錨定分子結合到載體基質的表面，例如結合在樹脂上。
30.根據權利要求25或者26所述的載體基質，其中權利要求1～23任一項所述的化合物通過有機間隔物和有機錨定分子結合到載體基質的表面，例如結合在樹脂上。
31.一種診斷設備或者試劑盒，其含有根據權利要求1～23任一項所述的化合物，根據權利要求25～30任一項所述的載體基質，和必要時的輔助工具以及任選的用于化合物標記的另一工具。
32.根據權利要求1～23任一項所述的化合物的用途，其用于標記、檢測、鑒定、分離和純化FVIII或者FVIII-相關蛋白。
33.一種檢測、鑒定、分離和純化FVIII或者FVIII-相關蛋白的方法，其包括使含有FVIII或者FVIII-相關蛋白的樣品與包含已固定有根據權利要求1～22任一項所述的化合物的基質，在適于FVIII或者FVIII-相關蛋白和所述化合物之間結合的條件下接觸。
34.根據權利要求33所述的方法，其中將根據權利要求1～23任一項所述的化合物固定在載體上，該載體為聚合物材料。
35.根據權利要求33或者34所述的方法，其中根據權利要求1～23任一項所述的化合物選自由P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24和P25組成的組。
36.根據權利要求33或者34所述的方法，其中該聚合物材料為樹脂。
37.根據權利要求33～35任一項所述的方法，其中該樣品為細胞培養(yǎng)上清液。
38.根據權利要求33～35任一項所述的方法，其中該樣品為體液。
39.根據權利要求38所述的方法，其中該體液包括血液。
40.一種凹坑或者孔，其包含(1)根據權利要求1～23任一項所述的化合物，(2)包括聚合物材料的基質，其中所述化合物被固定在該聚合物材料上。
41.根據權利要求40所述的凹坑或者孔，其中該化合物進一步包括標記物。
42.根據權利要求33或者34所述的方法，其中該化合物經與所述聚合物材料化學結合而被固定在該聚合物材料上。
43.根據權利要求33或者34所述的方法，其中肽或者擬肽經化學結合在所述聚合物材料上的有機錨定分子被固定在該聚合物材料上。
44.根據權利要求33或者34所述的方法，其中該有機錨定分子為
-A1-(CH2)p-A2，
-A1-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-A2，
-A1-CH2CH2-(OCH2CH2)y-A2，
＝CR2-(CH2)p-A2，
-A1-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
＝CR2-CH(NHR3)-(CH2)q-A2，
-A1-CH(COR4)-(CH2)q-A2，
＝CR2-CH(COR4)-(CH2)q-A2
其中A1、A2、R2、R3、R4、p、q和y為如權利要求5中所定義的。
45.根據權利要求33、34或者44所述的方法，其中肽或者擬肽進一步包含有機間隔分子。
46.根據權利要求45所述的方法，其中該有機間隔分子選自以下基團的一種:
[-NH-(CH2)x-CO]w，
[-NH-(CH2CH2-O-)yCH2-CO]w，
[CO-(CH2)z-CO-]，
[NH-(CH2)z-NH-]，
[CO-CH2-(OCH2CH2)y-O-CH2-CO-]，
[NH-CH2CH2-(OCH2CH2)y-NH-]，
或者氨基酸、肽、糖或者聚醚以及它們的組合，
其中w、x、y和z為如權利要求4中所定義的。
全文摘要
本發(fā)明涉及對因子VIII和因子VIII-類似蛋白表現出高親合性的化合物和它們的用途。所述化合物的特征在于通式B-Q-X，其中B表示二肽、三肽或者擬肽；Q表示間隔物和X表示錨定分子；Q和X是任選的。這些化合物可以用于涂覆固體載體物質。所得的經涂覆的固體載體物質可以用于通過親合色譜法純化因子VIII。此外，本發(fā)明化合物可以用于穩(wěn)定因子VIII和用于增強它的活性。由此，本發(fā)明還涉及制造含有增強活性的藥物的穩(wěn)定因子VIII的方法。此外，本發(fā)明化合物可以用于診斷試劑盒中和作為研究工具。
文檔編號C07K5/08GK101379077SQ200680052567
公開日2009年3月4日 申請日期2006年12月7日 優(yōu)先權日2005年12月7日
發(fā)明者塞巴斯蒂安·諾爾, 霍斯特·凱瑟勒, 夏洛特·豪澤, 愛麗克西·克倫諾夫, 伊夫岡尼·薩恩科 申請人:夏洛特·豪澤