突變型因子viii組合物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)要求享有于2013年6月24日提交的順序號(hào)為61/838867的美國臨時(shí)專利 申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。上述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此通過引用的方式并入本文。
[0002] 本發(fā)明涉及相比相應(yīng)的野生型人因子VIII顯示出更高的表達(dá)水平的重組人因子 VIII突變體。本發(fā)明還涉及制備和使用重組人因子VIII突變體的方法。
[0003] 政府許可權(quán)
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的授權(quán)號(hào)HL084381的美國政府支持下作出 的。美國政府因此對(duì)本發(fā)明具有一定許可權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 血友病A，是最常見的嚴(yán)重的遺傳性出血性疾病，由血漿蛋白因子VIII的缺乏或 缺陷引起。在患有血友病A的患者中，當(dāng)血友病患者受傷時(shí)，血液不正常凝結(jié)導(dǎo)致出血過 多。治療方法由使用（純化的）血漿或重組蛋白制品的替代療法組成。
[0006] 當(dāng)血小板附著到受傷血管的切口壁時(shí)，在受損部位凝血開始。隨后，在酶調(diào)節(jié)的反 應(yīng)的級(jí)聯(lián)中，可溶性纖維蛋白原分子通過酶凝血酶被轉(zhuǎn)變?yōu)槭寡“寰奂谘ㄖ械睦w維 蛋白的不溶性絲。在級(jí)聯(lián)中的每一步，蛋白前體被轉(zhuǎn)變?yōu)樵谙盗兄星懈钕乱粋€(gè)前體蛋白的 蛋白酶。在大多數(shù)步驟中需要輔因子。
[0007] 因子VIII作為非活性的非共價(jià)的金屬離子依賴性異源二聚體前體在血液中循 環(huán)，緊密和非共價(jià)地結(jié)合von Willebrand因子。蛋白質(zhì)的這種procofactor形式包含由 Al(al)A2(a2)B結(jié)構(gòu)域組成的重鏈（HC)和由（a3)A3ClC2結(jié)構(gòu)域組成的輕鏈（IX)，小寫字 體a代表酸性殘基中富含的短（~30-40個(gè)殘基）片段。因子VIII是在由凝血酶或因 子Xa催化的A1A2、A2B和A3A3結(jié)點(diǎn)通過溶蛋白性裂解而蛋白水解活化的，這用來使其與 von Willebrand因子分離并在級(jí)聯(lián)中活化其促凝血功能。在其活性形式，所述蛋白質(zhì)因子 Villa是在酶原因子X向絲氨酸蛋白酶（因子Xa)的膜依賴性轉(zhuǎn)變中將絲氨酸蛋白酶因子 IXa的催化效率以幾個(gè)數(shù)量級(jí)增加的輔因子。
[0008] 基因療法已經(jīng)被提出作為治療方式用于補(bǔ)充在血友病患者中的凝血因子缺乏， 并且已經(jīng)嘗試設(shè)計(jì)適合于治療人類的FVIII構(gòu)建體。例如，Connelly等人報(bào)道用編碼人 FVIII的腺病毒載體治療FVIII缺乏小鼠導(dǎo)致生物活性的人FVIII的表達(dá)（Connelly等人， Blood，第91卷，第9期（1998)，第3273-3281頁）。Sarkar等人報(bào)道在小鼠模型中與FVIII 組合使用AAV8血清型修正血漿FVIII活性（Sarkar等人，Blood，第103卷，第4期（2004)， 第 1253 至 1260 頁）。
[0009] 然而，如在基因療法的許多方面中，理論要比成功有效的實(shí)施簡(jiǎn)單得多。實(shí)施基因 療法技術(shù)的困難包括在使用病毒作為基因載體和FVIII的表達(dá)水平不足所遇到的問題。例 如，人FVIII分泌非常低效且產(chǎn)率相比相似的蛋白質(zhì)（如因子V)以對(duì)數(shù)形式降低。此外， 雖然病毒作為基因載體是有效的，因?yàn)樗鼈兛梢杂糜谵D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)，但是 包被病毒顆粒的蛋白質(zhì)可以激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。
[0010] 因此，鑒于上述情況，需要可以有效地表達(dá)足夠量的靶FVIII蛋白以將病毒載體 的所需劑量減少到可接受的水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 概要
[0012] 本發(fā)明提供修飾的因子VIII(FVIII)蛋白、編碼FVIII的核酸和FVIII表達(dá)載體， 以及在FVIII缺乏（如血友病A)的治療中使用所述修飾的FVIII基因的方法。
[0013] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種相比野生型因子VIII具有增加的表達(dá)或分泌的 突變型人因子VIII。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147、L152和其組合中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T、L152P和其組合中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和L152各氨基酸的氨基酸取代。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括I86V、Y105F、A108S、 D115E、Q117H、F129L、G132K、H134Q、M147T 和 L152P 氨基酸取代。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自186、A108、G132、 M147、L152和其組合中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括選自I86V、A108S、G132K、 M147T、L152P和其組合中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括I86V、A108S、G132K、 M147T和L152P各自的氨基酸取代。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組突變型人因子VIII包括氨基酸取代I86V、A108S、 G132K、M147T 和 L152P。
[0022] 在其他實(shí)施方式中，所述人因子VIII突變體還包括在人因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中 的缺失。
[0023] 在其他實(shí)施方式中，所述人因子VIII突變體還包括人因子VIII的a2和/或a3 結(jié)構(gòu)域。
[0024] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸序列，其編碼本文描述的人因子 VIII突變體。
[0025] 在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可操作地連接編碼本文描述的人因子VIII突變體 的多核苷酸的表達(dá)載體。
[0026] 在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含可操作地連接編碼本文 描述的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達(dá)載體。
[0027] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有因子VIII缺乏的患者的方法，其 包括向有此需要的患者施用對(duì)治療所述因子VIII缺乏有效量的含有可操作地連接編碼本 文描述的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達(dá)載體的藥物組合物。
[0028] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)人因子VIII多肽突變體的方法，其包括： (a)用可操作地連接編碼根據(jù)本發(fā)明的人因子VIII突變體的多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞；(b)在適合表達(dá)人因子VIII多肽突變體的條件下使宿主細(xì)胞生長；和（c)從表達(dá) 所述突變體的宿主細(xì)胞中純化人因子VIII多肽突變體。
【附圖說明】
[0029] 圖1示出了人因子VIII重和輕鏈的結(jié)構(gòu)域，包括本發(fā)明中所用的幾個(gè)重鏈結(jié)構(gòu)。
[0030] 圖2是顯示與具有10個(gè)示例性的取代以增強(qiáng)分泌的經(jīng)修飾的因子VIII并排的分 泌的人因子VIII重鏈的前200個(gè)氨基酸的排列的圖。
[0031] 圖3是顯示與具有5個(gè)示例性的取代以增強(qiáng)分泌的經(jīng)修飾的人因子VIII并排的 分泌的人因子VIII重鏈的前200個(gè)氨基酸的排列的圖。
[0032] 圖4總結(jié)了確定為影響人因子VIII分泌的示例性氨基酸。
[0033] 圖5和圖6描繪了示例性的用于表達(dá)B結(jié)構(gòu)域缺失的人因子VIII突變體或人因 子VIII重鏈的AAV載體。
[0034] 圖7顯示了在BHK細(xì)胞（圖A)或293細(xì)胞（圖B)中不同的人因子VIII突變體 的分泌的比較。
[0035] 圖8顯示了在體內(nèi)就分泌而言不同的人因子VIII突變體的分泌的比較。將質(zhì)粒 pAAV-CB-hBDDF8 (攜帶B結(jié)構(gòu)域缺失的人因子VIII)、質(zhì)粒pAAV-CB-hBDDF8-X10 (攜帶具有 10個(gè)取代的hF8-BDD)、質(zhì)粒pAAV-CB-hBDD-F8-X5 (攜帶具有5個(gè)取代的hBDDF8)或質(zhì)粒 pAAV-CB-hBDD-F8-G312K(具有G132K取代的hF8)注射于因子VIII雙基因敲除Blab/c小 ￡3 邱U
[0036] 圖9顯示了在293細(xì)胞中不同的人因子VIII突變體分泌的比較。hBDD-F8-X10 中的氨基酸被恢復(fù)到其相應(yīng)的野生型氨基酸。在hBDD-F8-X10-6p中，不同于野生型F8的 hBDD-F8-X10中的10個(gè)氨基酸中的6個(gè)被恢復(fù)到它們的野生型氨基酸。
[0037] 圖10顯示了在AAV載體構(gòu)建體中的突變體因子VIII(F8)重鏈（HC1690-X10)與 野生型hF8-HC1690AAV載體構(gòu)建體（AAV/hF8HC1690)在體內(nèi)的表達(dá)和分泌的比較。
[0038] 圖11顯示了在293細(xì)胞中不同的G132因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0039] 圖12顯示了在因子VIII雙基因敲除Blab/c小鼠中就表達(dá)/分泌而言不同的因 子VIII的重鏈突變體的分泌的比較。
[0040] 圖13顯示了在293細(xì)胞中不同的L152因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0041] 圖14顯示了在293細(xì)胞中不同的A108因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0042] 圖15顯示了在293細(xì)胞中不同的M147因子VIII重鏈突變體的分泌的比較。
[0043] 圖16顯示了在F8-/-大鼠模型中沒有形成針對(duì)5個(gè)突變氨基酸的中和抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 詳細(xì)說明
[0045] 有關(guān)本發(fā)明的生物分子的各種術(shù)語的定義同上，也可用于整個(gè)說明書和權(quán)利要求 書。
[0046] 短語"分泌增強(qiáng)因子VIII (seFVIII，seF8) "是指一種修飾的FVIII (F8)，其已被遺 傳改變使得所編碼的蛋白質(zhì)在與未經(jīng)修飾的FVIII相比時(shí)表現(xiàn)出至少10%或20%或50% 或100%的在分泌方面的增長。本文描述的核苷酸序列可容易地從GenBank中獲得。對(duì)于 人FVIII，請(qǐng)見登錄號(hào)NG-011403. 1。
[0047] 短語"BDD"指的是缺少B結(jié)構(gòu)域的"無 B結(jié)構(gòu)域"因子VIII (F8或FVIII)突變體。
[0048] 短語"一個(gè)或多個(gè)"，后跟要素或種類的列表，旨在包含列表中的要素或種類的任 何排列。因此，例如，短語"選自A、B、C、D、E和F中的一個(gè)或多個(gè)取代突變"可以包括含有 A、B、C、D、E和/或F的取代突變的任何組合。
[0049] 如本文所用，范圍可以表示為從一個(gè)特定整數(shù)值至另一個(gè)特定整數(shù)值。在表達(dá)這 樣的范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在此范圍內(nèi)的任一和全部整數(shù)值定義了根據(jù)本發(fā)明的單獨(dú)的 實(shí)施方式，并且實(shí)施方式的全部范圍包括在所述范圍內(nèi)進(jìn)一步包括在最初范圍中的整數(shù)值 的任何配對(duì)之間的任一和全部子范圍。
[0050] 關(guān)于本發(fā)明的核酸，術(shù)語"分離的核酸"，在應(yīng)用于DNA時(shí)，指的是一種DNA分子， 所述DNA分子與其從中起源的生物體的天然存在的基因組中的與它緊鄰的（在5'和3'方 向）序列分離。例如，"分離的核酸"可以包括插入到載體（如質(zhì)粒或病毒載體）中的DNA 或cDNA分子，或整合到原核生物或真核生物的DNA。核酸密碼子可被最優(yōu)化以增強(qiáng)在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
[0051 ] 對(duì)于本發(fā)明的RNA分子，術(shù)語"分離的核酸"主要是指由如上定義的分離的DNA分 子編碼的RNA分子?；蛘?，該術(shù)語可以指的是一種RNA分子，所述RNA分子已充分地與在天 然狀態(tài)下（即，在細(xì)胞或組織中）將會(huì)與它相關(guān)的RNA分子分離，使得它以"基本上純的"的 形式存在（術(shù)語"基本上純的"在下面定義）。
[0052] 對(duì)于蛋白質(zhì)，術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)"或"分離和純化的蛋白質(zhì)"有時(shí)也用于本發(fā)明。 此術(shù)語主要是指由本發(fā)明的分離的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；蛘?，該術(shù)語可指已充 分地與會(huì)與它天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)分離以便以"基本上純的"形式存在的蛋白質(zhì)。
[0053] 術(shù)語"啟動(dòng)子區(qū)域"是指基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其可在編碼區(qū)的5'或3'側(cè)、或在編 碼區(qū)內(nèi)、或內(nèi)含子中找到。
[0054] 術(shù)語"載體"是指一種小載體DNA分子，DNA序列可被插入其中以引入到宿主細(xì)胞 中，在宿主細(xì)胞中其將被復(fù)制。"表達(dá)載體"是包含具有在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需要的必要調(diào) 節(jié)區(qū)的基因或核酸序列的專用載體。
[0055] 術(shù)語"可操作地連接"是指編碼序列表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)序列置于相對(duì)于所述編碼 序列的適當(dāng)位置上的DNA分子中，以便實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。此相同的定義有時(shí)應(yīng)用于表 達(dá)載體中的編碼序列和轉(zhuǎn)錄控制元件（例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止元件）的排列。此定義 有時(shí)也應(yīng)用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中產(chǎn)生雜種核酸分子。
[0056] 術(shù)語"基本上純的"是指包含至少50-60重量％的目的化合物（例如，核酸、寡核 苷酸、蛋白質(zhì)等）的制品。更優(yōu)選地，所述制品包含至少75重量％且最優(yōu)選90-99重量％ 的目的化合物。純度通過適合于所述目的化合物的方法（例如，色譜法、瓊脂糖或聚丙烯酰 胺凝膠電泳、HPLC分析等）測(cè)定。
[0057] "基本上由…組成"一詞，在指特定核苷酸序列或氨基酸序列時(shí)，指的是具有給定 序列號(hào)（SEQ ID N0)的屬性的序列。例如，在用于參照氨基酸序列時(shí)，該詞包括序列本身和 將不會(huì)影響序列的基本和新穎特征的分子修飾。
[0058] 本文所用術(shù)語"寡核苷酸"是指本發(fā)明的引物和探針，并且被定義為由兩個(gè)或多個(gè) 核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸（優(yōu)選超過三個(gè)）組成的核酸分子。寡核苷酸的準(zhǔn)確尺寸 將取決于各種因素，并且取決于使用寡核苷酸的特定應(yīng)用。如本文所用的術(shù)語"探針"是指 寡核苷酸、多核苷酸或核酸，無論是RNA或DNA，無論是如在純化的限制性酶消化中自然存 在的或是合成產(chǎn)生的，所述探針能夠與具有與所述探針互補(bǔ)的序列的核酸退火或特異性雜 交。探針可以是單鏈的或雙鏈的。探針的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、探針的來 源和使用方法。例如，對(duì)于診斷應(yīng)用，根據(jù)靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸探針通常含有15-25 個(gè)或更多個(gè)核苷酸，盡管它可含有更少的核苷酸。
[0059] 本文所用術(shù)語"百分比相同"參考核酸或氨基酸序列之間的比較。核酸和