105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 處的一個(gè)或多個(gè)取代進(jìn)一步修 飾的已增加了在培養(yǎng)基中的分泌的因子VIII的核苷酸序列。
[0120] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述分離的核酸分子可以具有編碼連同在位置186、 Y105、A108、D115、Q117、F129、G132、H134、M147 和 / 或 L152 處的一個(gè)或多個(gè)取代一起的具 有一個(gè)或多個(gè)非天然發(fā)生的糖基化位點(diǎn)的因子VIII的核苷酸序列。
[0121] 在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述分離的核酸分子編碼用在位置186、Y105、A108、D115、 Q117、F129、G132、H134、M147和/或L152處的一個(gè)或多個(gè)取代修飾并且進(jìn)一步修飾成具有 下列修飾中的任何組合的重組因子VIII :修飾成無 B結(jié)構(gòu)域的、修飾成嵌合的、修飾成具有 融合的A2-A3結(jié)構(gòu)域、修飾成具有一個(gè)或多個(gè)改變的失活裂解位點(diǎn)的、修飾成具有增強(qiáng)的 因子IXa和/或因子X的親合力的、修飾成具有提高的分泌的、修飾成具有增加的循環(huán)半衰 期的以及修飾成具有一個(gè)或多個(gè)非天然發(fā)生的糖基化位點(diǎn)的。
[0122] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種用于表達(dá)本文描述的突變型因子VIII多核苷酸的 表達(dá)載體。如本文所用，術(shù)語"表達(dá)載體"是指一種病毒或非病毒載體，其以適合于在宿主 細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸的形式包含編碼本發(fā)明的新肽的多核苷酸。一種類型的非病毒的載體 是"質(zhì)粒"，質(zhì)粒包括可以連接另外的DNA片段到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另外，在本說明書 中，"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。
[0123] 當(dāng)制備表達(dá)載體時(shí)，可以將轉(zhuǎn)基因序列插入到含有用于在細(xì)菌以及真核細(xì)胞中復(fù) 制的合適細(xì)菌序列的質(zhì)粒?？梢允褂萌魏畏奖愕馁|(zhì)粒，所述質(zhì)?？梢园ㄔ试S在細(xì)菌中選 擇的標(biāo)記以及通常一個(gè)或多個(gè)獨(dú)特的、便利的定位的限制性位點(diǎn)。載體的選擇將取決于優(yōu) 選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化用的靶宿主。
[0124] 用于表達(dá)突變型因子VIII多肽的表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)可操作地連接到待表 達(dá)的多核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于如待 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等的這樣的因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可 以被引入宿主細(xì)胞，從而制得本文描述的突變型因子VIII蛋白。
[0125] 如本文所使用的，術(shù)語"控制序列"或"調(diào)節(jié)序列"指可操作連接的編碼序列在特 定宿主生物體中的表達(dá)所必需的DNA序列。術(shù)語"控制/調(diào)節(jié)序列"旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng) 子和其他表達(dá)控制元件（例如，多腺苷酸化信號(hào)）?？刂?調(diào)節(jié)序列包括在許多類型的宿主 細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的那些和僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的表 達(dá)的那些（例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列）。
[0126] 當(dāng)將一個(gè)核酸序列置于與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，所述一個(gè)核酸序列 "可操作地連接"到所述另一個(gè)核酸序列。例如，將前序列或分泌前導(dǎo)肽的DNA可操作地連 接到多肽的DNA，如果它表達(dá)為參與該多肽的分泌的前蛋白；將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地 連接到編碼序列，如果它影響序列的轉(zhuǎn)錄；或者將核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接到編碼序 列，如果它被定位以便促進(jìn)翻譯。通常，"可操作連接"意味著被連接的DNA序列是鄰接的， 并且在分泌前導(dǎo)的情況下是鄰接的且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強(qiáng)子不必是鄰接的。連接是 通過在方便的限制性位點(diǎn)連接來完成。如果此類位點(diǎn)不存在，依照常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡 核苷酸接頭或連接體。
[0127] 用于指導(dǎo)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的合適的表達(dá)載體通常包括啟動(dòng)子，以及本領(lǐng)域 中已知的其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)多核 苷酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類型中表達(dá)（例如，組織特異性調(diào)節(jié)元件用于表達(dá)多核苷酸）。組織特 異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的并且可以包括，例如，肝細(xì)胞特異性啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子（例 如，白蛋白啟動(dòng)子、α-l抗胰蛋白酶啟動(dòng)子、載脂蛋白E增強(qiáng)子）?；蛘?，可以使用在幾乎任 何細(xì)胞類型中都有活性的組成型啟動(dòng)子（例如，人巨細(xì)胞病毒）。
[0128] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，表達(dá)載體是病毒載體。病毒載體的一個(gè)或多個(gè)病毒基 因通常已被移除，并且病毒載體包括插入到用于插入外源轉(zhuǎn)基因（包括本文描述的突變型 因子VIII)的病毒基因組插入位點(diǎn)的基因/啟動(dòng)子盒。被移除的基因的必要的功能可以由 已被工程化以表達(dá)的轉(zhuǎn)基因中早期基因的基因產(chǎn)物的細(xì)胞系提供。示例性的病毒載體包 括，但不限于，腺相關(guān)病毒（AAV)載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，包括慢病毒載體、腺病毒載體、皰 疹病毒載體和甲病毒載體。其他病毒載體包括星狀病毒、冠狀病毒、正粘病毒、乳多空病毒、 副粘病毒、細(xì)小病毒、微小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒載體等。病毒載體可包括任何合 適的核酸構(gòu)建體，如DNA或RNA構(gòu)建體，并且可以是單鏈、雙鏈或雙螺旋。
[0129] -旦在本發(fā)明的DNA構(gòu)建體已被制備，它已準(zhǔn)備好被引入到宿主細(xì)胞中。因此，本 發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備包含因子VIII核酸的重組細(xì)胞的方法。基本上，這需要通過轉(zhuǎn) 化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體等將DNA構(gòu)建體引入到細(xì)胞，以及選擇已引入的DNA 以游離型或整合到宿主基因組中的細(xì)胞。
[0130] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含編碼本發(fā)明的重組因子VIII的分離的核酸 分子的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以包含分離的核酸分子作為以游離質(zhì)粒或穩(wěn)定整合到 宿主細(xì)胞基因組中的形式的DNA分子。此外，宿主細(xì)胞可以構(gòu)成用于產(chǎn)生重組突變型因 子VIII蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。合適的宿主細(xì)胞可以是，但不限于，動(dòng)物細(xì)胞（例如，幼倉鼠 腎（"ΒΗΚ"）細(xì)胞）、中國倉鼠卵巢細(xì)胞（"CH0"）、細(xì)菌細(xì)胞（如大腸桿菌）、昆蟲細(xì)胞 (例如，Sf9細(xì)胞）、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞（例如，酵母屬（Saccharomyces)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces))、植物細(xì)胞（例如，擬南芥屬或煙草細(xì)胞）、藻類細(xì)胞等。
[0131] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備本發(fā)明的重組因子VIII的方法。此方法包括使本 發(fā)明的宿主細(xì)胞在由此所述宿主細(xì)胞表達(dá)重組因子VIII的條件下生長(zhǎng)。然后，將所述重組 因子VIII分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中于體外生長(zhǎng)。在一個(gè)具體的 實(shí)施方式中，合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以包括，但不限于，含有von Willebrand因子的（本文中 稱為"VWF"）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在這個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以包含編碼VWF的轉(zhuǎn)基因，或 者可以將VWF引入到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中作為補(bǔ)充。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的VWF將允許重組因子VIII 的更高表達(dá)水平。一旦重組因子VIII被分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可以利用相關(guān)的重組DNA和 蛋白質(zhì)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員公知的技術(shù)（包括本文所述的那些）將其從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中分 離。在另一個(gè)實(shí)施方式中，制備本發(fā)明的重組因子VIII的方法進(jìn)一步包括在分離所述重組 因子VIII之前破壞宿主細(xì)胞。在此實(shí)施方式中，從細(xì)胞碎片中分離重組因子VIII。
[0132] 當(dāng)重組產(chǎn)生時(shí)，所述因子VIII蛋白質(zhì)或多肽（或其片段或突變體）在重組宿主細(xì) 胞（典型地，但不是排他地，真核生物）中表達(dá)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，真核宿主細(xì)胞 (如哺乳動(dòng)物細(xì)胞）用于產(chǎn)生如本文所述的突變型因子VIII多肽。適合用于實(shí)施本發(fā)明的 哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括，但不限于：C0S細(xì)胞（例如，ATCC No. CRL 1650或1651)，BHK細(xì)胞（例 如，ATCC No.CRL 6281)，CH0 細(xì)胞（ATCC No.CCL 61)，HeLa 細(xì)胞（如，ATCC No.CCL 2)，293 細(xì)胞（ATCC No. 1573)，CHOP 細(xì)胞和 NS-1 細(xì)胞。
[0133] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于治療患有因子VIII缺乏的患者的方法。在一個(gè)實(shí) 施方式中，這涉及向有此需要的患者施用對(duì)治療所述因子VIII缺乏有效量的（如本文所述 的）重組突變型因子VIII。
[0134] 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，根據(jù)相同的用于注入人或動(dòng)物因子VIII的程序，將重 組因子VIII單獨(dú)地或者以藥物組合物的形式（即，與穩(wěn)定劑、遞送賦形劑和/或載體組合） 靜脈內(nèi)注入患者體內(nèi)。重組因子VIII的合適的有效量可以包括，但不限于，約10至約500 單位/千克患者體重。
[0135] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，治療患有因子VIII缺乏的患者的方法包括向有此需要 的的患者施用對(duì)治療所述因子VIII缺乏有效量的包含編碼突變型因子VIII或其功能 片段的表達(dá)載體的藥物組合物。在某些實(shí)施方式中，重組因子VIII可以通過移植經(jīng)遺 傳改造以產(chǎn)生重組因子VIII的細(xì)胞（通常經(jīng)由含有這樣的細(xì)胞的裝置的植入）來施 用。這種移植通常包括使用重組皮膚成纖維細(xì)胞的非病毒方法（Roth等人，New Engl. J. Med. 344:1735-1742(2001))。
[0136] 向因子VIII缺乏的患者施用編碼FVIII的表達(dá)載體可導(dǎo)致FVIII多肽的足夠的 表達(dá)以在功能上重建凝血連鎖。表達(dá)載體可以單獨(dú)使用或與在藥學(xué)上可接受的或生物相容 的組合物中的其它治療劑組合使用。
[0137] 所述編碼FVIII的多核苷酸可以用作含有重鏈和輕鏈部分的單鏈分子（圖10)或 在用于遞送到患者的宿主細(xì)胞的病毒或非病毒載體中分成兩個(gè)或多個(gè)分子（如，重鏈和輕 鏈；圖11)。
[0138] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，包含編碼突變型FVIII突變體的核酸序列的表 達(dá)載體是病毒載體?？稍诒景l(fā)明中使用的病毒載體包括，但不限于，腺病毒載體（具有或不 具有組織特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子），多種血清型的腺相關(guān)病毒（AAV)載體（例如AAV-1至 AAV-12等）和雜種AAV載體，慢病毒載體和偽類型慢病毒載體[例如，埃博拉病毒、水泡性 口炎病毒（VSV)和貓免疫缺陷病毒（FIV)]，單純皰疹病毒載體，牛痘病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體，慢病毒載體，非病毒載體等。
[0139] 在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了用于施用包含編碼突變型FVIII或其功能片段 核酸序列的病毒載體的方法，其包括使用AAV載體或慢病毒載體。最優(yōu)選地，分別僅包括載 體的主要部分（例如，ITR和LTR元件）。直接遞送載體或離體轉(zhuǎn)導(dǎo)人類細(xì)胞接著注入體內(nèi) 將導(dǎo)致突變型FVIII的表達(dá)，從而通過增強(qiáng)促凝血活性發(fā)揮對(duì)止血的有益治療效果。
[0140] 重組AAV載體和慢病毒載體已發(fā)現(xiàn)對(duì)各種基因治療應(yīng)用具有廣泛的效用。其對(duì)這 些應(yīng)用的效用主要是由于在各種器官背景下取得的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的高效率。AAV和慢病毒 顆?？捎欣厥褂米鳛檫M(jìn)行有效的基因遞送的載體。這樣的病毒粒子對(duì)于這樣的應(yīng)用具有 許多理想的特性，包括分裂和不分裂細(xì)胞的向性。用這些載體的早期臨床經(jīng)驗(yàn)還沒有表現(xiàn) 出持續(xù)的毒性，并且免疫反應(yīng)甚微或測(cè)不出。已知AAV通過受體介導(dǎo)的胞吞作用或通過胞 轉(zhuǎn)而感染體內(nèi)和體外的各種各樣的細(xì)胞類型。這些載體系統(tǒng)已在靶向人類的視網(wǎng)膜上皮、 肝、骨骼肌、呼吸道、腦、關(guān)節(jié)和造血干細(xì)胞中進(jìn)行了測(cè)試。它很可能是基于質(zhì)粒DNA或小環(huán) 的非病毒載體也將是對(duì)于如編碼FVIII的大基因合適的基因轉(zhuǎn)移載體。
[0141] 所期望的是引入能夠提供，例如，期望的基因的足夠表達(dá)和最小的免疫原性 的載體。改良的AAV和慢病毒載體和生產(chǎn)這種載體的方法已經(jīng)詳細(xì)描述在許多參考 文獻(xiàn)、專利和專利申請(qǐng)中，包括描述生產(chǎn)臨床級(jí)載體的Wright J.F. (Hum Gene Ther 20:698-706, 2009)。慢病毒載體可以在CHOP生產(chǎn)，并且其他載體可以購自NHLBI基因治療 資源計(jì)劃（GTRP)-慢病毒載體生產(chǎn)核心實(shí)驗(yàn)室的慢病毒載體生產(chǎn)核心實(shí)驗(yàn)室。
[0142] 對(duì)于一些應(yīng)用，表達(dá)構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括用于驅(qū)動(dòng)在特定細(xì)胞或組織類型中表 達(dá)的調(diào)節(jié)元件。這樣的調(diào)節(jié)元件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的并且在Sambrook等人 (1989)和Ausubel等人（1992)中深度討論。在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中引入組織特異性調(diào) 控元件提供了至少部分的用于表達(dá)突變型FVIII或其功能片段的組織嗜性。例如，編碼在 巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子控制下的突變型FVIII的核酸序列可用于骨骼肌表達(dá)或用于肝特 異性表達(dá)的hAAT-ApoE等。在慢病毒載體中的造血特異性啟動(dòng)子也可以有利地用于本發(fā)明 的方法。
[0143] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供突變型FVIII序列作為在衣殼中包裝的病毒載體 的組分。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，AAV載體用于在體內(nèi)遞送突變型FVIII (Gnatenko 等人，Br.J. Haematol. 104:27-36(1999))。在這種情況下，AAV載體包括至少一個(gè)突變型 FVIII和用于控制該突變型FVIII序列的表達(dá)的相關(guān)表達(dá)控制序列。如圖10和圖11所示， 示例性的用于表達(dá)突變型FVIII序列AAV載體可包括用于FVIII表達(dá)的啟動(dòng)子-增強(qiáng)子調(diào) 節(jié)區(qū)和起到確保促進(jìn)復(fù)制以及將突變型FVIII核酸包裝入AAV衣殼并將突變型FVIII核酸 整合到靶細(xì)胞基因組中的作用的順式作用的ITR。優(yōu)選地，所述AAV載體具有rep和cap基 因缺失，并由突變型hFVIII序列和與其相關(guān)的表達(dá)控制序列代替。如圖10和圖11所示， 所述突變型FVIII序列通常被插入與對(duì)病毒復(fù)制足夠的一個(gè)或兩個(gè)（即，側(cè)翼的）AAV TR 或TR元件相鄰。也可以包括其他的適合于促進(jìn)突變型hFVIII序列在靶細(xì)胞中的組織特異 性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
[0144] 包裝的病毒載體的病毒衣殼組分可以是細(xì)小病毒衣殼。AAV Cap和嵌合衣殼是優(yōu) 選的。合適的細(xì)小病毒病毒衣殼組分的實(shí)例是來自細(xì)小病毒家族（例如，自主性細(xì)小病毒 或依賴病毒）的衣殼組件。例如，病毒衣殼可以是AAV衣殼（例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV 9、AAV10、AAV11或AAV12衣殼；本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道存在有 可能執(zhí)行相同或相似功能的尚未確定的其它變體）或者可以包括來自兩個(gè)或更多個(gè)AAV衣 殼的組分。AAVCap蛋白質(zhì)的完整補(bǔ)體包括VP1、VP2和VP3。包含編碼AAVVP衣殼蛋白的 核昔酸序列的0RF可包含小于完整補(bǔ)體AAV Cap蛋白，或者可以提供AAV Cap蛋白的完整 補(bǔ)體。
[0145] 如在Rabinowitz等人的第6491907號(hào)美國專利中所述，在一個(gè)或多個(gè)所述AAV Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括來自兩個(gè)或更多個(gè)病毒（優(yōu)選兩個(gè)或更多個(gè)AAV)的氨基酸 序列AAV Cap。例如，嵌合病毒衣殼可以包括AAVICap蛋白或亞單位和至少一個(gè)A