專利名稱：：穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的免疫學(xué)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的免疫學(xué)分析方法，更具體地，涉及利用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的高靈敏度測(cè)定方法。對(duì)于本說明書中的用語"分析"，包含判斷有無分析對(duì)象物質(zhì)存在的"檢測(cè)"、和定量或半定量地決定分析對(duì)象物質(zhì)的量或活性的"測(cè)定"。
背景技術(shù)：
：人穩(wěn)定化纖維蛋白利用各種蛋白酶分解的分解物在臨床診斷法中作為診斷標(biāo)記來使用。例如，人穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物、即、作為基本單元的p-DD/E、以及其聚合物或者低聚物(作為別稱，例如稱作"D-D二聚物，，或者"DD/E復(fù)合物，，)被廣泛用于播散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)的診斷標(biāo)記。對(duì)于在生物樣品中含有的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定，一般使用由敏化膠乳引起的凝聚反應(yīng)來進(jìn)行，所述敏化膠乳使用了對(duì)于穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物是特異性的單克隆抗體。另一方面，下肢深部靜脈血栓癥(DVT)近年來受到重視。這種病癥在日本國內(nèi)不太受到重視，但隨著生活方式的歐美化，其成為逐漸增多的疾病。診斷或者預(yù)測(cè)血栓癥的狀態(tài)或血栓的有無是極其困難的，在DVT診斷中最可靠的方法是檢查穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物(非專利文獻(xiàn)1和2)。通過凝固過程而得到的交聯(lián)(crosslink)的穩(wěn)定化纖維蛋白在受到纖維蛋白溶酶分解時(shí)，形成以p-DD/E作為基本單元的p-DD/E的聚合物或低聚物、進(jìn)而形成p-DD/E，因此通過檢測(cè)p-DD/E或者其聚合物或低聚物，可以知道血栓形成和二次纖溶的動(dòng)態(tài)過程。因此，測(cè)定穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物在確認(rèn)血栓存在方面是極其有用的。近年來，作為經(jīng)濟(jì)艙綜合征所知的肺血栓栓塞癥(PE)正在接近人們的生活。PE大多由于深部靜脈血栓(DVT)通過下大靜脈、心臟右心系統(tǒng)到達(dá)肺動(dòng)脈、使血流阻斷而導(dǎo)致發(fā)病。測(cè)定穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物在對(duì)包括DVT的PE患者進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)是有用的(非專利文獻(xiàn)3，4)。作為可特異性檢測(cè)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的公知的單克隆抗體，已知有單克隆抗體JIF-23(非專利文獻(xiàn)5)。已知該抗體可以識(shí)別Di結(jié)構(gòu)域(domain)的N末端的立體結(jié)構(gòu)，所述D!結(jié)構(gòu)域是當(dāng)在人穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的d1a結(jié)構(gòu)域中的y鏈N末端的氨基酸序列63-85游離時(shí)所暴露出的區(qū)域。通過使用該JIF-23抗體、和可對(duì)在生物樣品中存在的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行特異性分析的測(cè)定方法，能夠容易地知道血栓形成和二次纖溶的動(dòng)態(tài)過程。這樣的測(cè)定方法沒有特別地限定，可以列舉例如膠乳凝聚法或ELISA法。作為使用了目前在臨床上廣泛使用的JIF-23抗體的、測(cè)定穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的方法，已知有膠乳凝聚法。對(duì)于穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的值，根據(jù)非專利文獻(xiàn)6,健康人為0.4jag/mLFEU，根據(jù)非專利文獻(xiàn)7，DIC患者為15.2±18.5pg/mL。因此，即使對(duì)于使用了JIF-23抗體的膠乳凝聚反應(yīng)(檢測(cè)靈敏度=約45ng/mL)，也能充分地進(jìn)行檢測(cè)，從而在實(shí)際臨床上被普遍應(yīng)用。另一方面，DVT情況下的臨床截?cái)嘀翟诜菍＠墨I(xiàn)8中報(bào)道為0.5jug/mLFEU。因此，與DIC診斷相比，需要識(shí)別與健康人的值相比所具有的微小變動(dòng)，期望開發(fā)一種具有更高靈敏度的測(cè)定法，其可以正確地對(duì)正常值域的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行定量。作為使用抗體的ELISA法，例如有公知的；、-^、74夕、、X(OII二一社)，所述抗體可識(shí)別穩(wěn)定化纖維蛋白分解物的D結(jié)構(gòu)域的新抗原(非專利文獻(xiàn)8，11)。根據(jù)非專利文獻(xiàn)9，報(bào)道了ELISA的靈敏度比膠乳凝聚法高，因此在DVT診斷中是有用的。作為穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定方法，可進(jìn)行高靈敏度測(cè)定的ELISA法正在被人們接受。例如，上述;、4義義的檢測(cè)靈敏度約為45ng/mLFEU。并且，上述各數(shù)值和單位是基于各非專利文獻(xiàn)的記述的數(shù)值和單位，單位"yg/mLFEU，，和"jug/mL，，可以利用下述換算式1jug/mL=2jug/mLFEU相互變換(但是，上述數(shù)值"2"為估算值)(非專利文獻(xiàn)IO)。非專利文獻(xiàn)l:ThrombosisandHaemostasis,德、國，1994年，71巻，p.l-6非專利文獻(xiàn)2:QualityJournalofMedicine,英國，1997年,90巻,p.437-442非專利文獻(xiàn)3:ThrombosisandHaemostasis,德國，1999年，81巻，p.493-497非專利文南大4:ThrombosisandHaemostasis,德、國，2000年，83巻，191-198非專利文獻(xiàn)5:ExceptaMedica,Amsterdam，才，^夕、、，1990年，p.43-48BloodCoagulation,ReportonSurvey142,英國，2004年5月非專利文獻(xiàn)7:ANNALESDEBIOLOGIECLINIQUE,法國，1988年，46巻，p.730-733非專利文南夫8:BiomerieuxVidasD-DimerPackageInsert,美國，2003年9月，008120-4非專利文獻(xiàn)9:AnnalsofInternalMedicine,美國，2004年，p.589-602非專利文南史10:JournalofThrombosisandHaemostasis,英國，2005年，p.377-384非專利文獻(xiàn)ll:BritishJournalofHaematology,英國，2004年，p.15-2
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供更高靈敏度的、穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的分析方法。通過與目前的高靈敏度分析法相比進(jìn)而高靈敏度化，也可以縮短分析時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明，上述課題可以利用對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行免疫學(xué)分析的方法來解決，所述方法的特征在于，使用(a)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體、和(b)通過與上述單克隆抗體(a)相比識(shí)別不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體的組合，上述單克隆抗體(a)或者(b)的一方方結(jié)合在磁性粒子上，另一方方單克隆抗體被酶標(biāo)記，且使用化學(xué)發(fā)光底物作為上述酶的底物。根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)分析方法優(yōu)選的方式，上述單克隆抗體(b)是與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的E結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體。即，(l)使可能含有穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶^分解物的檢驗(yàn)樣品、與上述單克隆抗體(a)、上述單克隆抗體(b)接觸的工序、(2)將通過穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物與磁性粒子結(jié)合單克隆抗體形成了免疫復(fù)合物的酶標(biāo)記單克隆抗體、與不形成上述免疫復(fù)合物的酶標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行分離的工序、(3)在用上述工序分離的磁性粒子結(jié)合單克隆抗體-穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物-酶標(biāo)記單克隆抗體免疫復(fù)合物中，添加化學(xué)發(fā)光底物、使其發(fā)光的工序、以及(4)對(duì)得到的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析的工序。物是1,2-二氧環(huán)丁烷。性磷酸酶。本發(fā)明涉及穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的免疫學(xué)分析用試劑盒，其特征在于，含有(a)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體、(b)通過與上述單克隆抗體(a)相比識(shí)別不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體、以及(c)化學(xué)發(fā)光底物，上述單克隆抗體(a)或者(b)的一方結(jié)合在磁性粒子上，另一方單克隆抗體用以上述化學(xué)發(fā)光底物為底物的酶進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明涉及下肢深部靜脈血4全癥和/或肺栓塞癥的4全測(cè)方法(診斷方法)，其特征在于，通過上述免疫學(xué)分析方法、或者上述免疫學(xué)分析用試劑盒，來分析在檢驗(yàn)樣品中含有的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)分析方法，可以高靈敏度以及高特異性地分析穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物，不僅可適用于目前的DIC的診斷，還適用于DVT和/或肺栓塞癥的診斷。附圖的簡單說明是表示在2種測(cè)定體系中測(cè)定穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的一系列稀釋液的結(jié)果的曲線圖，所述2種測(cè)定體系包括利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記No.36-1抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(黑圓)、和利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記JIF-23抗體的組合的比較用測(cè)定方法(白圓)。是表示在3種測(cè)定體系中測(cè)定穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的一系列稀釋液的結(jié)果的曲線圖，所述3種測(cè)定體系包括利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記No.36-1抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(黑圓)、利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記No.l-l抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(白方塊)、和利用了JIF-23抗體固定化石茲性粒子與石咸性石粦酸酶標(biāo)記No.5-4抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(白三角)。具體實(shí)施例方式在本說明書中，用語"穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物"是指通過使用纖維蛋白溶酶將穩(wěn)定化纖維蛋白進(jìn)行消化而生成的分解物，是基本上由1個(gè)或者多個(gè)基本單元"p-DD/E"形成的分解物。在"穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物"中，例如包含由l個(gè)上述基本單元構(gòu)成的p-DD/E、或者由多個(gè)上述基本單元構(gòu)成的p-DD/E的聚合物或低聚物。作為"穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物"的別稱，例如可以使用"D-D二聚物，，或者"DD/E復(fù)合物"并且，在本說明書中，對(duì)于利用纖維蛋白溶酶消化而生成的分解物，通過在該分解物的名稱前面附加"p-"來表示。同樣，對(duì)于利用顆粒球彈性蛋白酶消化而生成的分解物，通過在該分解物的名稱前面附加"e-"來表示。試劑盒)中，作為單克隆抗體^:用抗原決定部位(表位)不同的2種單克隆抗體。并且，在本說明書的用語"抗體"中，不僅包含抗體自身，還包含其抗體片斷。上述抗體片斷可以使用例如Fab、Fab'、F(ab')2、或者Fv。作為用于通過夾心免疫測(cè)定來特異性檢測(cè)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的抗體，具有下述的特征是必須的條件，所述特征包括與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、或者纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解產(chǎn)物不形成夾心免疫復(fù)合物，但以在穩(wěn)定化纖維蛋白通過纖維蛋白溶酶消化而成的纖維蛋白分解產(chǎn)物中出現(xiàn)的部位(即、新抗原)作為抗原決定部位，可以形成夾心免疫復(fù)合物。在本發(fā)明中，作為一方單克隆抗體，使用與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體(以下，稱作第1抗體或者抗D結(jié)構(gòu)域新抗原抗體)，作為另一方單克隆抗體，使用通過與上述第1抗體相比識(shí)別不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體(以下，稱作第2抗體)。在本發(fā)明中使用的第l抗體、即、抗D結(jié)構(gòu)域新抗原抗體，只要是可識(shí)別通過穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原的單克隆抗體即可，沒有特別地限定，例如可以使用識(shí)別當(dāng)通過穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解、使包含由Y鏈的N末端起第63號(hào)~第85號(hào)的氨基酸序列的片斷從y鏈游離時(shí)所出現(xiàn)的d結(jié)構(gòu)域的新抗原的單克隆抗體(例如單克隆抗體JIF-23)。JIF-23是眾所周知的可對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行特異性檢測(cè)的單克隆抗體(例如，Matsuda,M.,Terukina,S.,Yamaz畫i,K.,Maekawa,H.,Soe,G.,AmonoclonalantibodythatrecognizestheNH2-terminalconformationoffragmentD,ExcerptaMedica,Amsterdam;1990,43畫38)。另夕卜，JIF-23抗體不僅與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物反應(yīng)，還與穩(wěn)定化纖維蛋白的顆粒球彈性蛋白酶分解物(即、作為基本單元的e-DD/E、以及其聚合物或者低聚物)反應(yīng)。在作為穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物基本單元的p-DD/E的分子內(nèi)，存在2處JIF-23抗體的抗原決定部位，因此單獨(dú)使用JIF-23抗體可特異性地檢測(cè)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物，使用了JIF-23抗體的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物測(cè)定用膠乳試劑在臨床上;故廣泛應(yīng)用。在本發(fā)明中，將與第l抗體(例如，JIF-23抗體)相比識(shí)別不同部位的第2抗體、與第1抗體組合來構(gòu)建穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的檢測(cè)體系。作為上述第2抗體，只要是特異性識(shí)別通過穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶消化而新暴露出的氨基酸序列或者其立體結(jié)構(gòu)的抗體即可，沒有特別地限定，可以使用例如，特異性識(shí)別E結(jié)構(gòu)域的新抗原的抗體(例如，單克隆抗體No.36-1、No.1-1、No.5-4)、單克隆抗體DD3B6/22(AmericanDiagnostica;ThrombosisResearch,1983年,31巻，p87畫96或者DrugCoagulation&Fibrinolysis,1979年，8巻,p87畫96)、單克隆抗體MA8D3(IL等；ThrombosisandHaemostasis,1989年，58巻,p.1024-1029)、單克隆抗體P10B5E12C9(Biomerieux;ClimcalChemistry,1996年，42巻，p410-415)、單克隆抗體P2C5A10(Biomerieux;ClinicalChemistry,1996年，42巻，p410-415)?？勺鳛榈?抗體使用的、特異性識(shí)別E結(jié)構(gòu)域的新抗原的抗體(以下，稱作抗E結(jié)構(gòu)域新抗原抗體)，只要是與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的E結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體即可，沒有特別地限定，例如可以使用在參考實(shí)施例1的表1中記述的具有反應(yīng)特異性的抗體(例如，單克隆抗體No.36-1、No.1-1、No.5-4)。No.36-1抗體與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物反應(yīng)，但與穩(wěn)定化纖維蛋白的顆粒球彈性蛋白酶分解物不反應(yīng)。在本發(fā)明中，以與磁性粒子結(jié)合的狀態(tài)使用單克隆抗體的一方，另一方的單克隆抗體以酶標(biāo)記的狀態(tài)使用。在本發(fā)明中使用的磁性粒子只要具有磁力、可作為免疫反應(yīng)的固相載體使用即可，沒有特別地限定，可以使用例如以下的》茲性粒子。粒子的組成可以由浸漬了可磁化物質(zhì)的聚合物來構(gòu)成。對(duì)于粒子的表面結(jié)構(gòu)，只要可使抗體固定化即可，沒有特別地限定，當(dāng)通過物理吸附使抗體固定化時(shí)，優(yōu)選粒子表面的特性為疏水性，當(dāng)通過化學(xué)鍵使抗體固定化時(shí)，優(yōu)選在粒子表面引入官能團(tuán)(例如，羧基、琥珀酰亞氨基、異硫氰酸酯基、氯磺?；?、馬來酰亞氨基、酰肼基、氨基、或者SH基等)的結(jié)構(gòu)。磁性粒子的粒徑可以使用例如0.1~10|am,優(yōu)選使用l5ium。將抗體結(jié)合在i茲性粒子上的方法可以應(yīng)用>知的技術(shù)。例如可以通化學(xué)結(jié)合法結(jié)合抗體時(shí)，可以利;例如i基、琥詢酰亞氨基]異:氰酸酯基、氯磺?；?、馬來酰亞氨基、酰肼基、或者氨基。對(duì)于上述羧基的情況，可以使用碳二亞胺使羧基活化、并使其與抗體的氨基結(jié)合。上述琥珀酰亞氨基、異硫氰酸酯基、或者氯磺?；梢耘c抗體的氨基直接反應(yīng)。上述馬來酰亞氨基例如可以與SH基反應(yīng)，可以使用SH基引入試劑將SH基引入抗體、或者將抗體還原而利用其鉸合部位的SH基而使其結(jié)合。上述的酰肼基可以與抗體的糖鏈反應(yīng)。上述氨基可以使用戊二醛將粒子上的氨基變換為醛基，從而使其與抗體的氨基反應(yīng)。在本發(fā)明中，對(duì)于標(biāo)記單克隆抗體所使用的酶，只要是可應(yīng)用化學(xué)發(fā)光的酶即可，沒有特別地限定，可以進(jìn)行高靈敏度的分析。例如，當(dāng)?shù)孜餅轸斆字Z時(shí)，可以使用過氧化物酶作為標(biāo)記酶，當(dāng)?shù)孜餅閊纟，'7PPD時(shí)，可以使用堿性磷酸酶作為標(biāo)記酶。特別地，當(dāng)使用堿性磷酸酶作為酶、使用1,2-二氧環(huán)丁烷[更具體地，CDP-Star(卜口匕°少夕7社)]作為底物時(shí)，從S/N比的方面考慮是有用的，因而是優(yōu)選的。報(bào)道了CDP-Star與AMPPD或CSPD同樣、利用堿性磷酸酶進(jìn)行水解，通過中間體發(fā)光，但其發(fā)光強(qiáng)度與AMPPD或CSPD相比非常強(qiáng)[Bronstein,I.，Edwards，B.,Voyta,丄C.,1,2-Dioxetanes:NovelChemil畫inescentEnzymeSubstrates.ApplicationtoImmunoassays,JournalofBiohiminescenceandChemiluminescence;i,99-111(1989);Beck,S.,Koster,H.,ApplicationsofDioxetaneChemiluminescentProbestoMolecularBiology,AnalyticalChemistry;位，2258—2270(1990);Tizard,R.,Cate,R丄.，Ramachandran，K丄.，Wysk，M.，Voyta,J.C.，Murphy，O.J.,Bronstein，I.,ImagingofDNASequenceswithChemiluminescence,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.;經(jīng)4514-4518(1990);或Bronstein,I.,Voyta,J.C.，Lazzari,K.G.，Murphy,O.,Edwards,B.,Kricka,L.J.,RapidandSensitiveDetectionofDNAinSouthernBlotswithChemiluminescence,BioTechniques;g，310—314(1990)]。另外，由CDP-Star引起的化學(xué)發(fā)光的上升比AMPPD或CSPD快，且該發(fā)光持續(xù)24小時(shí)以上，因此優(yōu)選作為使用了堿性磷酸酶的高靈敏度分析法的底物。對(duì)抗體的酶標(biāo)記可以使用7>知的方法?？梢粤信e例如，使用戊二醛將酶的氨基與抗體的氨基進(jìn)行交聯(lián)的方法、通過酶的氨基引入可與氨基結(jié)合的官能團(tuán)(例如琥珀酰亞氨基、異硫氰酸酯基等)、使其與抗體的氨基結(jié)合的方法、通過酶的氨基引入馬來酰亞氨基、利用抗體鉸合部位的SH基等使其結(jié)合的方法、當(dāng)酶是西洋芥末過氧化物酶等的糖蛋白時(shí)、利用高碘酸將糖鏈變換為醛基，使其與抗體的氨基結(jié)合的方法等。外，可以與目前^^知的免疫學(xué)分析方法一樣、Y吏用例如人工(手動(dòng))或者自動(dòng)化系統(tǒng)來進(jìn)行。例如，使檢驗(yàn)樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣品、與結(jié)合在;茲性粒子上的單克隆抗體、酶標(biāo)記了的單克隆抗體在反應(yīng)管內(nèi)接觸，接著在規(guī)定的溫度下(例如3040。C)進(jìn)行溫育。通過使磁鐵與上述反應(yīng)管的外壁接觸，而將抗體結(jié)合磁性粒子捕獲在反應(yīng)管的內(nèi)壁上，在該狀態(tài)下對(duì)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行任選的洗滌，接著，在反應(yīng)管內(nèi)添加化學(xué)發(fā)光底物4吏其發(fā)光。檢測(cè)得到的信號(hào)，分析在檢驗(yàn)樣品或者標(biāo)準(zhǔn)樣品中存在的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的量。通過使用磁性粒子，在溫育后使用》茲鐵準(zhǔn)確地進(jìn)^亍其與樣品液的分離、以及與洗滌液的分離，因此在空白的降低等方面也是有利的。作為利用本發(fā)明可進(jìn)行分析的檢驗(yàn)樣品，可以列舉有可能含有穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的生物樣品，例如有血液、血漿、血清、或者尿等。本發(fā)明人分別使用JIF-23抗體作為第1抗體、No.36-l抗體(識(shí)別通過纖維蛋白溶酶消化而暴露出的E結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的抗體)作為第2抗體，通過人血漿中穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定來評(píng)價(jià)其與目前的膠乳試劑的相關(guān)性。對(duì)于(l)"單獨(dú)用JIF-23抗體構(gòu)建的膠乳凝聚法"和"使用了單獨(dú)用JIF-23抗體構(gòu)建的抗體固定化磁性粒子和堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的測(cè)定體系，，、以及(2)"單獨(dú)用JIF-23抗體構(gòu)建的膠乳凝聚法"和"使用了JIF-23抗體固定化^1性粒子和識(shí)別纖維蛋白溶酶消化后的E結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記物的測(cè)定體系"，在使用含有穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的人血漿(50個(gè)樣本)作為樣本組的相關(guān)試驗(yàn)中，回歸直線的斜率、截距、和相關(guān)系數(shù)沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，因此，對(duì)于將識(shí)別通過纖維蛋白溶酶消化暴露出的E結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的抗體與JIF-23抗體進(jìn)行組合而構(gòu)建的測(cè)定體系，其特異性相對(duì)于單獨(dú)用JIF-23抗體構(gòu)建的測(cè)定體系，在測(cè)定血漿中的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物方面沒有差異。根據(jù)Francis等的報(bào)道，推測(cè)在體內(nèi)，由于血流和ot2纖維蛋白溶酶抑制劑的作用，穩(wěn)定化纖維蛋白利用纖維蛋白溶酶的分解沒有進(jìn)行至階段4[分解進(jìn)行至基本單元DD/E、或者片斷D二聚體(DD)和片斷E的狀態(tài)]、而止于階段3(基本單元DD/E的聚合物或者低聚物)，徐等才艮道了證實(shí)該推測(cè)的It據(jù)[Francis,C.W.,Marder,V丄，Barlow,G.H.,Plasmicdegradationofcrosslinkedfibrin,JournalofClinicalinvestigation;66,1033-1043,1980;徐吉夫、河野功、櫻井錠治、松田道生，使用了識(shí)別片斷D的氨基末端結(jié)構(gòu)的單克隆抗體(JIF-23)的纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解產(chǎn)物的解析，血栓止血學(xué)會(huì)志，5,105-113，1994]。這些報(bào)道強(qiáng)烈暗示了上述相關(guān)試驗(yàn)(1)和(2)的相關(guān)性沒有差異這一結(jié)果。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但這些實(shí)施例不限定本發(fā)明的范圍。《實(shí)施例1:利用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定》(1)抗D結(jié)構(gòu)域新抗原單克隆抗體JIF-23固定化磁性粒子的制作JIF-23抗體利用胃蛋白酶消化的F(ab')2組分的制作按照松屋等的報(bào)道(Matsuya,T.,Tashiro,S.,Hoshino,N.,Shibata,N.,Nagasaki,Y.,Kataoka,K.,Acore-shell-typefluorescentnanospherepossessingreactivePEGtetheredchainsonthesurfaceforzeptomoledetectionofproteinintime-resolvedfluorometricimmunoassay;Anal.Chem.,75,6124-6132,2003)來進(jìn)行。向懸濁液(lOmL)中添加lOOmg/mL的碳二亞胺水溶液(lmL)，在室溫下顛倒混合1小時(shí)，所述懸濁液是JSR社制的引入羧基的磁性粒子(粒徑2.5juM)在50mmol/L-MES緩沖液(pH6.5)中的1%懸濁液。在14000rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)4亍15分鐘離心分離來回收i茲性粒子，用50mmol/L-MES緩沖液(pH6.5)洗滌2次。將用50mmol/L-MES緩沖液(pH6.5)制備的JIF-23抗體F(ab')2溶液(200|_ig/10mL)、與上述磁性粒子混合，在室溫下顛倒混合l小時(shí)。之后，在14000rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)4亍15分鐘離心分離來除去未反應(yīng)的抗體溶液，添加^f吏用O.lmol/L-Tris-HCl(pH8.0)制備的0.3%牛血清白蛋白溶液(10mL)，在室溫下顛倒混合30分鐘。在14000rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行15分鐘離心分離來除去牛血清白蛋白溶液，用含有0.01%吐溫-20的10mmol/L-Tris-HCl(pH8.0)緩沖液將抗體固定化磁性粒子進(jìn)行洗滌后，供以后的實(shí)驗(yàn)使用。(2)抗E結(jié)構(gòu)域新抗原單克隆抗體No.36-l、No.1-1、或者No.5-4的石咸性磷酸酶標(biāo)記物的制作識(shí)別胃蛋白酶消化后的E結(jié)構(gòu)域的No.36-l抗體、No.l-l抗體、或者No.5-4抗體的Fab'組分的制作，按照松屋等的報(bào)道(Matsuya,T.,Tashiro,S.,Hoshino,N.,Shibata,N.,Nagasaki,Y.,Kataoka,K.,Acore-shell-typefluorescentnanospherepossessingreactivePEGtetheredchainsonthesurfaceforzeptomoledetectionofproteinintime-resolvedfluorometricimmunoassay;Anal.Chem.,75,6124-6132,2003)來進(jìn)行。單克隆抗體No.36-l、No.l-l、No.5-4的反應(yīng)性如下述參考實(shí)施例1所示的那樣。對(duì)得到的單克隆抗體No.36-l、No.l-l、或者No.5-4的Fab'組分用石咸性磷酸酶進(jìn)4亍標(biāo)記4安照石川等的報(bào)道(Ishikawa,E.,Imagawa,M.,Hashida,S.,Yoshitake,S.,Hamaguchi,Y.，&Ueno,T.,Enzyme-labelingofantibodiesandtheirfragmentsforenzymeimmunoassayandimmunohistochemicalstaining;J.Immunoassay，4,209-327,1983和Ishikawa,E.,Hashida,S.,Kohno,T.&Tanaka,K.，Methodsforenzyme-labelingofantigens,antibodiesandtheirfragments;In:NonisotopicImmunoassay,T.T.Ngo(ed.),p27-55,PlenumPublishingCorporation,NewYork,1988)來進(jìn)行。另外，作為比較用的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，除了使用JIF-23抗體以外，通過重復(fù)上述操作，制備單克隆抗體JIF-23的Fab'組分的堿性磷酸酶標(biāo)記物。(3)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的制備穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的制備按照Olexa等的報(bào)道[Olexa,S.A.,Budzynski,A.Z.,Primarysolubleplasmicdegradationproductofhumancross-linkedfibrin.Isolationandstoichiometryofthe(DD)Ecomplex;Biochemistry,18,991-995,1979]來進(jìn)行。另夕卜，穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)而分解生成的片斷D和片斷E按照Masci等的才艮道[Masci,P.P.,Whitaker,A.N.Winzor,D丄，AsimplechromatographicprocedureforthepurificationoftheDdimmerfragmentfromcrosslinkedfibrin;AnalyticalBiochemistry,147,128-135,1985]來進(jìn)行制備。(4)使用了抗體固定化磁性粒子和堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定使用穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的一系列稀釋液作為樣品，所述稀釋液使用含有3%牛血清白蛋白的20mmol/L-Tris-HCl(pH7.0)的緩沖液來配制。首先，將樣品(50juL)、No.36-l抗體、No.l-l抗體、或者No.5-4抗體Fab'組分的堿性磷酸酶標(biāo)記物(50mL)、和JIF-23抗體F(ab')2組分固定化磁性粒子(1%磁性粒子、50nL)進(jìn)行混合，在37。C下使其反應(yīng)5分鐘。接著，使用以TritonX-100作為主成分的洗滌液，除去無助于免疫反應(yīng)的樣品成分、或剩余的標(biāo)記抗體后，將結(jié)合了免疫復(fù)合物的磁性粒子與作為化學(xué)發(fā)光底物的CDP-Star(卜口匕°:7夕只社)(100pL)混合，利用光電倍增管計(jì)測(cè)1分鐘后的發(fā)光。另外，作為比較例，除了使用JIF-23抗體Fab'組分的堿性磷酸酶標(biāo)記物來代替No.36-抗體Fab'組分的石成性磷酸酶標(biāo)記物以外，其他重復(fù)上述操作。(5)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的測(cè)定結(jié)果圖l表示在2種測(cè)定體系中，對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的一系列稀釋液進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，所述2種測(cè)定體系包括利用了JIF-23抗體固定化》茲性粒子與石咸性磷酸酶標(biāo)記No.36-1抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(圖1中的黑圓)、和利用了JIF-23抗體固定化眉茲性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記JIF-23抗體的組合的比較用測(cè)定方法(圖1中的白圓)。通過使用識(shí)別的抗原決定部位不同的2種單克隆抗體(JIF-23抗體和No.36-1抗體)，與單獨(dú)用JIF-23抗體構(gòu)建的測(cè)定體系相比，對(duì)于穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的反應(yīng)性提高約6倍。其檢測(cè)靈敏度在約17分鐘的分析時(shí)間下為0.005ng/mLFEU，相對(duì)于使用了識(shí)別穩(wěn)定化纖維蛋白分解物的D結(jié)構(gòu)域的新抗原的抗體的目前的ELISA法(匕'>y-—社；二^、74夕、、只大約35分鐘的分析時(shí)間)(非專利文獻(xiàn)8，11)的檢測(cè)靈敏度45ng/mLFEU,提高約9倍，通過高靈敏度化、同時(shí)實(shí)現(xiàn)了分析時(shí)間的縮短。圖2表示在本發(fā)明3種測(cè)定方法中，對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的一系列稀釋濃度進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，包括利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記No.36-1抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(圖2中的黑圓)、利用了JIF-23抗體固定化磁性粒子與堿性磷酸酶標(biāo)記No.l-l抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(圖2中的白方塊)、和利用了JIF-23抗體固定化^f茲性粒子與^5威性磷酸酶標(biāo)記No.5-4抗體的組合的本申請(qǐng)發(fā)明的測(cè)定方法(圖2中的白三角)。對(duì)于任何一種抗體的組合，通過對(duì)^5咸性磷酸酶標(biāo)記抗體使用識(shí)別穩(wěn)定化纖維蛋白的E結(jié)構(gòu)域的新抗原的抗體，可以得到與No.36-1同等程度的反應(yīng)性，對(duì)于用于堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的、識(shí)別穩(wěn)定化纖維蛋白分解物E結(jié)構(gòu)域的新抗原的抗體的使用，顯示高的普遍性?！秴⒖紝?shí)施例l:單克隆抗體No.36-1、No.1-1、和No.5-4的識(shí)別部位的確定》單克隆抗體No.36-1、No.1-1、和No.5-4的反應(yīng)特異性通過如特公平5-48119號(hào)公報(bào)的實(shí)施5中所述的方法來確定。即，根據(jù)A^f才，7卜'3土的Zeta-ProbeBlottingMewbrauesInstructionManual,利用蛋白質(zhì)印跡法來確定。其大致內(nèi)容是在Ca2、1者EGTA的存在下對(duì)纖維蛋白原進(jìn)行纖維蛋白溶酶處理，將30分鐘、60分鐘、和24小時(shí)反應(yīng)后的纖維蛋白原分解物在二硫蘇糖醇(DTT)存在下或不存在下進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，實(shí)施使用了No.36-1抗體的蛋白質(zhì)印跡法。另外，代替上述纖維蛋白原分解物，對(duì)于穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物、片段D和片段E重復(fù)上述操作。結(jié)果示于表1。在表1中，記號(hào)"(-)"表示沒有結(jié)合反應(yīng)性,記號(hào)"(+)"表示具有結(jié)合反應(yīng)性。根據(jù)表1的結(jié)果，判明No.36-1抗體、No.1-1抗體、和No.5-4抗體與利用穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的E結(jié)構(gòu)域的新抗原進(jìn)4于反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>產(chǎn)業(yè)利用可能性本發(fā)明的免疫學(xué)分析方法可以適用于各種診斷、例如DIC、DVT、肺栓塞癥的診斷的用途。以上，通過特定的方式說明本發(fā)明，但對(duì)于本行業(yè)者是顯而易見的變形或改良也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行免疫學(xué)分析的方法，其特征在于，使用(a)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)而與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體、和(b)通過識(shí)別與上述單克隆抗體(a)相比不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體的組合，其中上述單克隆抗體(a)或者(b)的一方結(jié)合在磁性粒子上，另一方單克隆抗體被酶標(biāo)記，并且使用化學(xué)發(fā)光底物作為上述酶的底物。2.如權(quán)利要求1所述的免疫學(xué)分析方法，上述單克隆抗體(b)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)而與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的E結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)。3.如權(quán)利要求1或者2所述的免疫學(xué)分析方法，含有下述的工序(1)使可能含有穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的檢驗(yàn)樣品、與上述單克隆抗體(a)、上述單克隆抗體(b)接觸的工序、(2)將通過穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物與磁性粒子結(jié)合單克隆抗體形成了免疫復(fù)合物的酶標(biāo)記單克隆抗體、與不形成上述免疫復(fù)合物的酶標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)4亍分離的工序、(3)在用上述工序分離的磁性粒子結(jié)合單克隆抗體-穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物-酶標(biāo)記單克隆抗體免疫復(fù)合物中，添加化學(xué)發(fā)光底物、使其發(fā)光的工序、和(4)對(duì)得到的發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析的工序。4.如權(quán)利要求1~3中任意一項(xiàng)所述的免疫學(xué)分析方法，化學(xué)發(fā)光底物是1,2-二氧環(huán)丁烷。5.如權(quán)利要求1~4中任意一項(xiàng)所述的免疫學(xué)分析方法，標(biāo)記酶是石咸性磷酸酶。6.穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物的免疫學(xué)分析用試劑盒，其特征在于，含有(a)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)而與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體、(b)通過識(shí)別與上述單克隆抗體(a)相比不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體、以及(C)化學(xué)發(fā)光底物，其中上述單克隆抗體(a)或者(b)的一方結(jié)合在磁性粒子上，另一方單克隆抗體用以上述化學(xué)發(fā)光底物作為底物的酶標(biāo)記。7.下肢深部靜脈血纟全癥和/或肺一全塞癥的4全測(cè)方法，其特征在于，利用如權(quán)利要求1~5中任意一項(xiàng)所述的免疫學(xué)分析方法、或者如權(quán)利要求6所述的免疫學(xué)分析用試劑盒，對(duì)在檢驗(yàn)樣品中含有的穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行分析。全文摘要本發(fā)明公開了對(duì)穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物進(jìn)行免疫學(xué)分析的方法，其特征在于，使用(a)與穩(wěn)定化纖維蛋白、纖維蛋白原、和纖維蛋白原的纖維蛋白溶酶分解物不反應(yīng)、但與因穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解而出現(xiàn)的D結(jié)構(gòu)域的新抗原反應(yīng)的單克隆抗體、和(b)通過與上述單克隆抗體(a)相比識(shí)別不同的部位、而與穩(wěn)定化纖維蛋白的纖維蛋白溶酶分解物發(fā)生特異性反應(yīng)的單克隆抗體的組合，其中上述單克隆抗體(a)或者(b)的一方結(jié)合在磁性粒子上，另一方單克隆抗體被酶標(biāo)記，使用化學(xué)發(fā)光底物作為上述酶的底物。文檔編號(hào)G01N33/53GK101166977SQ20068001473公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2006年4月27日優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日發(fā)明者松屋毅申請(qǐng)人:株式會(huì)社三菱化學(xué)藥得論