hMOF及其小肽在制備緩解或治療人砷中毒藥物方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及hMOF及其小肽在制備緩解或治療人砷 中毒藥物方面的應(yīng)用，進而用于制備治療與砷急性、尤其是慢性環(huán)境污染所致砷中毒的相 關(guān)解毒藥物、緩解藥物或藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 砷（又叫砒霜）作為飲用水中的主要污染源，已成為一個全球性的環(huán)境污染問題。 盡管如此，砷化合物仍作為藥物，尤其是作為治療急性早幼粒細胞白血病的最有效藥物之 一，應(yīng)用于臨床幾個世紀。但是，由于其對心臟、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等的毒性作用，它的 應(yīng)用受到了極大限制。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長期暴露或攝入砷化合物與各種癌癥包括肺癌、腎 癌、前列腺癌、膀胱癌以及其它惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。最近研宄發(fā)現(xiàn)砷化合物可以改 變細胞內(nèi)組蛋白的翻譯后修飾，如將外周血單核細胞暴露于飲用水，就可以使組蛋白H3K9 的乙酰基化水平降低。去除UROtsa(膀胱尿路上皮）細胞中的MOF(Malesabsentonthe first，多臟器功能衰竭蛋白），不僅導(dǎo)致細胞內(nèi)的組蛋白H4賴氨酸第16位點（H4K16)的 乙?；浇档停€可以使細胞對砷化合物的敏感性增加，說明hMOF及其所修飾的組蛋 白H4K16的乙?；揎椩诒Ｗo細胞對砷化合物敏感性起著重要的作用。因此，可以推測 提高細胞內(nèi)的hMOF的含量并增加其所修飾的組蛋白H4K16的乙?；?，1)可以增加保 護細胞對砷化合物的敏感性；2)預(yù)防長期暴露于砷環(huán)境中可能導(dǎo)致的癌癥的發(fā)生；3)治療 生中毒所致的細胞內(nèi)組蛋白H4K16的乙酰基化水平的降低，進而改善中毒癥狀。
[0003] 人源MOFQiumanM0F，hMOF)，又叫組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶MYSTl，由431個 氨基酸組成，基因庫編號為AF218501，其三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定（WuH，MinJ，Loppnau PjWeigeltJ，SundstromM，ArrowsmithCHjEdwardsAM,BochkarevA,PlotnikovAN.The CrystalStructureofHumanMYSThistoneacetyltransferaseIincomplexwith acetylcoenzymeA.RCSB-PDB，2006)。hMOF最初是在果蠅中作為雄性X染色體的劑量補償 系的重要組成成分而被發(fā)現(xiàn)（HilfikerA，Hilfiker-KleinerD，PannutiA，andLucchesi JC.MofjaputativeacetyltransferasegenerelatedtotheTip60andMOZhuman genesandtotheSASgenesofyeast,isrequiredfordosagecompensationin Drosophila.EMBOJ，1997，15:2054-60.)。人源hMOF是果蠅dMOF蛋白的直系同源，在體 內(nèi)普遍存在和被表達。目前的研究結(jié)果顯示，如果去除人細胞中的MOF不僅引起廣范圍的 H4K16乙?；臏p少，進而導(dǎo)致DNA修復(fù)反應(yīng)異常，而且還可以導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，自發(fā) 的染色體畸變，細胞周期失調(diào)以及核形態(tài)的改變等（ReaSJouriG，andAkhtarA.Males absentonthefirst(MOF):fromfliestohuman.Oncogene，2007,26:5385-94.)〇 最 近還發(fā)現(xiàn)在人的乳腺癌或髓母細胞瘤中，MOF無論是在mRNA水平還是在蛋白表達量上 與正常組織相比都有明顯的降低，而且組蛋白H4K16的乙?；潭扰cMOF的蛋白表達 量成正[:匕（PfisterSjReaS，TaipaleM,MendrzykF，StraubB，IttrichC，Thuerigen 0,SinnHP，AkhtarA，andLichterP.ThehistoneacetyltransferasehMOFis frequentlydownregulatedinprimarybreastcarcinomaandmedulloblastoma andconstitutesabiomarkerforclinicaloutcomeinmedulloblastoma.Int. J.Cancer, 2008, 122:1207-13.)，由此說明MOF的蛋白表達量及其酶活性可能與這些腫瘤 的發(fā)生有著密切的關(guān)系。
[0004] 關(guān)于砷化合物的急性中毒作用眾所周知，近年來的研宄還證實許多癌癥的發(fā)生可 能也與慢性砷中毒相關(guān)。因此，預(yù)防、治療和緩解砷化合物中毒藥物的開發(fā)也開始受到極大 重視。尋找和發(fā)現(xiàn)能夠及時清除細胞內(nèi)的砷化合物、并盡早恢復(fù)細胞的生物學(xué)功能、從而緩 解砷中毒所致的一些癥狀已經(jīng)成為急需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供hMOF及其小肽在在制備緩解或治療人砷中毒藥物方面的應(yīng) 用。
[0006] 我們在研宄中發(fā)現(xiàn)暴露于砷化合物中的HeLa或293T細胞中的H4K16乙酰基化水 平明顯減少，而hMOF(多臟器功能衰竭蛋白）及其H4K16ac(組蛋白H4第16位賴氨酸的乙 酰基化）酶活性在多種腫瘤發(fā)生時也明顯降低。因此，我們推測慢性砷中毒所導(dǎo)致的細胞 內(nèi)組蛋白H4K16的乙?；介L期低下，可能是誘發(fā)腫瘤的原因之一。
[0007]hMOF作為組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，在細胞內(nèi)主要乙酰基化組蛋白H4第16位賴氨 酸位點。我們的實驗研宄證實砷化合物導(dǎo)致細胞內(nèi)H4K16ac水平的低下可能和砷化合物 與hMOF間的相互結(jié)合有關(guān)。砷與hMOF直接結(jié)合后抑制了其乙?；富钚裕瑥亩辜毎麅?nèi) H4K16ac水平低下。相反，過表達hMOF不僅可以降低細胞對砷化合物的敏感性，同時還可以 提高細胞內(nèi)組蛋白H4K16的乙酰基化水平，從而減輕細胞的凋亡。因此，hMOF及其與砷結(jié) 合區(qū)域小肽（hMOF作為一個蛋白質(zhì)可以緩解砷中毒；而能使hMOF發(fā)揮解毒功能的關(guān)鍵部位 是由24個氨基酸組成的區(qū)域小肽，這部分區(qū)域小肽可以直接結(jié)合砷，起到解毒作用。該區(qū) 域小肽作為藥物開發(fā)更有意義）的應(yīng)用，將對緩解砷化合物的中毒副作用具有實際臨床意 義。
[0008] 本發(fā)明以293T(-種轉(zhuǎn)染了腺病毒ElA基因且同時表達SV40大T抗原的永生化 人源腎胚上皮細胞株）和HeLa(子宮頸癌細胞）細胞株為研宄材料，通過細胞內(nèi)瞬轉(zhuǎn)并結(jié) 合免疫印跡實驗、雙熒光報告基因檢測實驗以及體外試管內(nèi)乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性檢測實驗等 手段確定hMOF蛋白及其區(qū)域小肽（WLCEYCLKYMKYEKSYRFHLGQCQ)對砷毒性具有高效專一的 緩解或解毒作用。
[0009] 我們的實驗表明，先瞬轉(zhuǎn)hMOF質(zhì)粒，再用砷處理細胞24小時后進行 MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽）實驗（圖6A)，結(jié)果證明hMOF可以 直接緩解或抑制砷對細胞的毒性，即減輕了細胞對砷的敏感性，說明hMOF對砷中毒有一定 的預(yù)防作用；在圖6B實驗中與對照組相比，砷（0.2~0.4yM，第2~3列）對組蛋白H4K16 乙?；囊种谱饔猛ㄟ^瞬轉(zhuǎn)hM0F(lyg)而改善，證明hMOF進入細胞后能與細胞內(nèi)的游 離砷直接結(jié)合，降低了細胞內(nèi)的砷濃度，從而減輕了砷對細胞的毒副作用，說明hMOF對砷 的毒副作用有一定的治療或緩解作用；圖6C實驗中砷處理細胞導(dǎo)致細胞死亡數(shù)增加（第一 行），但是，砷處理細胞同時加入hMOF質(zhì)粒（Iyg和2yg)，貝帳著劑量的增加，細胞死亡數(shù) 減少，再一次證明hMOF對砷中毒的緩解和治療作用，也說明hMOF可以提高細胞對砷的對抗 能力。以上實驗結(jié)果說明hMOF通過與細胞內(nèi)的砷直接結(jié)合來緩解和中和砷的毒性，進而改 善細胞的生長環(huán)境，逆轉(zhuǎn)由砷化合物所致的全細胞組蛋白H4上的第16位賴氨酸位點的乙 ?；降慕档?，因此，hMOF可以在緩解砷中毒癥狀或砷中毒解毒劑方面得以應(yīng)用。
【附圖說明】
[0010] 圖1 :三氧化二砷（As2O3)處理子宮頸癌細胞HeLa(A)或人胚腎細胞293T(B)后對 hMOF蛋白表達量及其所修飾的組蛋白H4K16乙酰基化水平水的影響。（A)細胞染色結(jié)果 (藍色箭頭所示）；(B)免疫印跡實驗結(jié)果（藍色箭頭所示）；圖1相關(guān)實驗細節(jié)見實施例 1〇
[0011]A.細胞免疫染色分析結(jié)果圖。砷處理HeLa細胞導(dǎo)致組蛋白H4K16的乙?；?平明顯降低。
[0012] 在人HeLa細胞（子宮頸癌細胞）培養(yǎng)液中加入As2O3，使其最終濃度達到0? 8yM。 48小時后，用hMOF和組蛋白H4K16位點乙?；目贵w進行細胞免疫熒光染色，然后在熒 光顯微鏡下觀察hMOF的蛋白表達量和組蛋白H4K16乙?；?。結(jié)果證實雖然hMOF的 表達量沒有明顯的改變，但是組蛋白H4K16的乙酰基化水平明顯低下（圖A箭頭所示）。
[0013]B.蛋白經(jīng)電泳分離后的WesternBlot分析結(jié)果圖。砷處理293T細胞（人源胚胎 腎細胞）致組蛋白H4K16的乙?；矫黠@降低（實施例1):
[0014]用0. 2~0. 8yM砷處理293T細胞，雖然hMOF的蛋白表達量沒有改變（第一行）， 但是其所修飾的組蛋白H4第16位賴氨酸位點的乙?；℉4K16ac)水平隨著砷濃度的增 加而降低（圖B第二行箭頭所示，與第一列相比，2~4列的H4K16ac水平逐漸降低），而其 他位點如H4K5ac(第三行）和H4K8ac(第四行）位點的乙酰基化水平?jīng)]有明顯改變。組蛋 白H2B(第五行）和GAPDH(最下行，磷酸甘油醛脫氫酶）是內(nèi)參蛋白，表示電泳各泳道的總 蛋白上樣量是一致的。
[0015] 圖2:三氧化二砷（As2O3)處理293T細胞后對hM