一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)是一群具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)和抗炎癥反應(yīng)方面效果顯著，因此被大量應(yīng)用于臨床研究和治療，其適應(yīng)癥涵蓋移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、肝病等多種重大疾病。
[0003]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是從新生兒臍帶中分離獲得，具有更加原始、增殖能力更強(qiáng)和免疫原性更低等特點(diǎn)，同時(shí)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源豐富、取材方便且沒有倫理等因素的限制，是目前間充質(zhì)干細(xì)胞最重要的來源。
[0004]研究表明，每厘米臍帶中理論上含有約IXlO6個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞。目前國內(nèi)外常用的分離方法主要有酶消化法和組織塊貼壁法兩種:酶消化法成本高，容易對細(xì)胞造成的損傷甚至細(xì)胞突變，臨床應(yīng)用存在極大風(fēng)險(xiǎn)；組織塊貼壁法具有操作簡便，成本低廉和細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，因而更合適臨床的應(yīng)用，但現(xiàn)有常規(guī)的組織塊貼壁法得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期較長，效率低，導(dǎo)致獲得的原代細(xì)胞數(shù)量較少，且純度不高，易混雜內(nèi)皮細(xì)胞，不能達(dá)到MSC臨床使用的國際標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致臨床應(yīng)用較為困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決前述問題，本發(fā)明提供了一種改良的組織塊貼壁法。
[0006]本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，它包括如下步驟:
[0007](I)取新鮮臍帶，剪短，去除血污；
[0008](2)剪碎成體積為2?3mm3的組織塊，均勻平鋪于包被了細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)皿中，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)I?4h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
[0009](3)在培養(yǎng)第5天時(shí)，對培養(yǎng)基進(jìn)行半換液；在培養(yǎng)第8天時(shí)，去掉所有組織塊，并對培養(yǎng)基進(jìn)行全換液；在細(xì)胞融合度為30-40%時(shí)收獲細(xì)胞，即可。
[0010]細(xì)胞外基質(zhì):存在于組織中，由細(xì)胞合成并分泌至胞外的一組蛋白質(zhì)混合物，幫助細(xì)胞附著和生長，包括纖維性成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子(主要為蛋白聚糖)等。明膠或者Cellstart基質(zhì)均屬于細(xì)胞外基質(zhì)。
[0011]半換液:去除培養(yǎng)皿中一半培養(yǎng)基，再補(bǔ)充一半新鮮的培養(yǎng)基。
[0012]全換液:除去培養(yǎng)皿中所有的培養(yǎng)基，再補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基。
[0013]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述剪短是剪為長度為I?1.5cm小片段。
[0014]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述去除血污的方法是PBS溶液清洗。
[0015]優(yōu)選地,步驟(2)中,所述細(xì)胞外基質(zhì)是明膠或者Cellstar基質(zhì)。
[0016]其中，所述明膠的濃度為0.1?0.5% (w/v);所述Cellstart基質(zhì)的濃度為1%?2% (w/v)。優(yōu)選地,所述明膠的濃度為0.2% (w/v);所述Cellstart基質(zhì)的濃度為2% (w/
V) O
[0017]優(yōu)選地，步驟(2)中，添加培養(yǎng)基之前的培養(yǎng)時(shí)間為2h。
[0018]本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基可以是含血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基或無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，但動物血清帶來的異源污染會為臨床使用帶來風(fēng)險(xiǎn)，因此，優(yōu)選為無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0019]其中，無血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基可以為STEMPRO MSC SFM。
[0020]本發(fā)明還提供了前述方法制備的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0021]本發(fā)明方法可以促進(jìn)細(xì)胞從臍帶組織中爬出，有效地提高了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離效率，使得單位長度臍帶組織獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量大大提升，也可以提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的純度并達(dá)到了 MSC臨床使用的國際標(biāo)準(zhǔn)，能夠臨床使用。同時(shí)，本發(fā)明方法操作簡便，成本低廉，應(yīng)用前景良好。
[0022]下面通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是并不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【附圖說明】
[0023]圖1基質(zhì)濃度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0024]圖2與傳統(tǒng)方法的比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0025]圖3第5天顯微鏡下觀察結(jié)果；左圖:未包被基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組；右圖:包被基質(zhì)實(shí)驗(yàn)組；
[0026]圖4本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組第8天顯微鏡下觀察結(jié)果；左圖:去除組織塊前右圖:去除組織塊后;
[0027]圖5本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組第11天顯微鏡下觀察結(jié)果；
[0028]圖6生長曲線；
[0029]圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果；
[0030]圖8體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1本發(fā)明分離純化方法
[0032]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用Iml 0.2%明膠包被過夜，去除殘留明膠；
[0033]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成Icm長度，用PBS清洗臍帶血污；每Icm長度臍帶剪碎至2?3_3大小組織塊，并均勻平鋪于培養(yǎng)皿中；放置370C 5% CO2條件下培養(yǎng)2h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(STEMPRO MSC SFMJgg LifeTechnologies公司)1ml在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)；第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；在細(xì)胞融合度為30?40%時(shí)收獲細(xì)胞。
[0034]實(shí)施例2本發(fā)明分離純化方法
[0035]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用Iml 2%的Cellstart基質(zhì)包被過夜，去除殘留Cellstart 基質(zhì)；
[0036]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成Icm長度，用PBS清洗臍帶血污；每Icm長度臍帶剪碎至2?3_3大小組織塊，并均勻平鋪于培養(yǎng)皿中；放置37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)2h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng);第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；在細(xì)胞融合度為30?40%時(shí)收獲細(xì)胞。
[0037]實(shí)施例3本發(fā)明分離純化方法
[0038]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用Iml 0.1 %明膠包被過夜，去除殘留明膠；
[0039]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成1.5cm長度，用PBS清洗臍帶血污；每1.5cm長度臍帶剪碎至2?3mm3大小組織塊，并均勻平鋪于明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中；放置37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)2h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(STEMPRO MSCSFM) 1ml在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)；第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；在細(xì)胞融合度為30?40%時(shí)收獲細(xì)胞。
[0040]實(shí)施例4本發(fā)明分離純化方法
[0041]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用Iml 0.5%明膠包被過夜，去除殘留明膠；
[0042]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成Icm長度，用PBS清洗臍帶血污；每Icm長度臍帶剪碎至2?3_3大小組織塊，并均勻平鋪于培養(yǎng)皿中；放置370C 5% CO2條件下培養(yǎng)lh，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng);第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；在細(xì)胞融合度為30?40%時(shí)收獲細(xì)胞。
[0043]實(shí)施例5本發(fā)明分離純化方法
[0044]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿用Iml 1% Cellstart基質(zhì)包被過夜，去除殘留Cellstart 基質(zhì)；
[0045]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成Icm長度，用PBS清洗臍帶血污；每Icm長度臍帶剪碎至2?3_3大小組織塊，并均勻平鋪于培養(yǎng)皿中；放置370C 5% CO2條件下培養(yǎng)4h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(STEMPRO MSC SFM) 1ml在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng);第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；在細(xì)胞融合度為30?40%時(shí)收獲細(xì)胞。
[0046]實(shí)施例6基質(zhì)濃度篩選試驗(yàn)
[0047]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0048]培養(yǎng)皿預(yù)處理:10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿分別用Iml I %的Cellstart基質(zhì)、0.2 %的Cellstart基質(zhì)、0.2%的明膠包被過夜，去除殘留基質(zhì)；對照組不包被基質(zhì)。
[0049]組織塊法分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞:用眼科剪將新鮮臍帶剪成Icm長度，用PBS清洗臍帶血污；每Icm長度臍帶放置在明膠包被的培養(yǎng)皿中，添加Iml胎牛血清后將臍帶剪碎至2?3_3大小組織塊并均勻平鋪于培養(yǎng)皿中；放置37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)2h，然后添加間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(LG-DMEM/F12及10%胎牛血清)1ml繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)；第5天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液；第8天全換液并去掉所有組織塊；第11天收獲細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0050]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0051]如圖1所示,預(yù)先用0.2%明膠或者0.2?I %的Cellstart基質(zhì)處理1cm細(xì)胞培養(yǎng)皿后，能夠明顯提升原代細(xì)胞數(shù)量；其中1% cellsart預(yù)處理效果最好。
[0052]本發(fā)明方法中，細(xì)胞外基質(zhì)可以為明膠或者Cellstart基質(zhì)，優(yōu)選為Cellstart基質(zhì)。
[0053]以下用實(shí)驗(yàn)例的方式說明本發(fā)明的有益效果:
[0054]實(shí)驗(yàn)例I與傳統(tǒng)方法的比較
[0055]1、試驗(yàn)方法
[0056]培養(yǎng)皿預(yù)處理:
[0057]未包對照組:未包被任何基質(zhì)；
[0058]明膠包被實(shí)驗(yàn)組:明膠(0.2