一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)?；苽涞姆椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)?；苽涞姆椒?。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)作為一種成體干細(xì)胞廣泛分布在于全身多種組織中，可在體外大量培養(yǎng)擴(kuò)增，并在特定條件下向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞分化。MSC是繼胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞之后的又一科研熱點(diǎn)，已成為二十一世紀(jì)治療多種系統(tǒng)疾病的實(shí)用性干細(xì)胞。它在免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)已逐步應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、骨和肌肉衰退性疾病、心腦血管疾病、肝病、腦及骨髓神經(jīng)損傷、老年癡呆等疾病的治療。
[0003]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是以干細(xì)胞治療為基礎(chǔ)的全新生物制品。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)此類產(chǎn)品上市，國(guó)外率先開發(fā)該類產(chǎn)品的是美國(guó)Osiris公司，其產(chǎn)品(商品名=Prochymar)已于2012年先后獲得加拿大和新西南政府批準(zhǔn)上市。Prochymal?是來(lái)源于人骨髓的異體間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Bone Marrow MesenchymalStem Cells，hBM_MSC)，用于治療造血干細(xì)胞移植中所產(chǎn)生的移植物抗宿主病(Graftvs.Host Disease，GvHD)，其主要功能之一為免疫調(diào)節(jié)作用。除此之外，Prochymal?還于2008年首先用于治療I型糖尿病的II期臨床研究。另外，韓國(guó)也有類似的產(chǎn)品(商品名:Heaticellgram-ΑΜΓ)于2011年在韓國(guó)上市，該產(chǎn)品為自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，適應(yīng)癥為急性心肌梗死；以色列Pluristem公司的在研產(chǎn)品(商品名:PluriPacf)于2011年在美國(guó)獲得FDA臨床研究批準(zhǔn)，用于糖尿病造成的肢體末端組織壞死的修復(fù)治療，其成分為人胎盤/臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的有關(guān)MSC細(xì)胞治療的臨床方案還包括:①M(fèi)SC靜脈輸注治療Crohn病MSC局部應(yīng)用治療牙周疾病MSC靜脈輸注治療心肌梗死；④MSC修復(fù)本月板及⑤G-CSF動(dòng)員的骨髓MSC治療心肌梗塞等。國(guó)內(nèi)的臨床研究中MSC適應(yīng)癥的選擇較為廣泛，擬用于預(yù)防或治療GvHD、心肌梗死、骨缺損、糖尿病足壞死、肝臟損傷或股骨頭壞死等。
[0004]MSC的組織來(lái)源廣泛，如骨髓、脂肪、臍帶。其中臍帶是連于胚胎臍部與胎盤間索狀結(jié)構(gòu)，其中富含造血、間充質(zhì)、神經(jīng)及內(nèi)皮等多種干/祖細(xì)胞。與骨髓來(lái)源的MSC相比較，人臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于:收集過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、胎盤屏障使臍帶受病毒與細(xì)菌污染少、臍血免疫系統(tǒng)的原始性降低了移植后受體發(fā)生排斥反應(yīng)的機(jī)率，在體外培養(yǎng)體系中能快速增值，傳代后3-5天能增值4-5倍，傳代培養(yǎng)10代以上細(xì)胞可增加5-10倍，且增速速度無(wú)明顯降低，傳代穩(wěn)定。此外，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不存在倫理學(xué)問(wèn)題、較強(qiáng)的歸巢能力和易于基因轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)使其成為實(shí)施細(xì)胞治療的理想細(xì)胞，并在腫瘤的靶向治療、組織工程和組織修復(fù)方面具有骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和其他成體干細(xì)胞無(wú)可比擬的優(yōu)越性。
[0005]MSC在細(xì)胞治療、基因治療以及組織工程中的應(yīng)用前提是MSC規(guī)?；⒁?guī)范化培養(yǎng)。為了實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化，達(dá)到精密控制生產(chǎn)過(guò)程、降低生產(chǎn)成本、便于下游工作及提高生物制品的質(zhì)量以及安全性，使得不斷優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、優(yōu)化和選擇適宜的細(xì)胞培養(yǎng)工藝顯得尤為重要。因此建立人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞簡(jiǎn)便、高效、安全的培養(yǎng)工藝十分必要。
[0006]但傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝制備的hUC-MSC往往存在諸多問(wèn)題，因?yàn)橹苽溥^(guò)程中需要引入多種外源物質(zhì)。因此帶來(lái)的各種殘留問(wèn)題限制了 hUC-MSC臨床應(yīng)用產(chǎn)品的開發(fā)，如牛血清、抗生素、胰酶等，其中牛血清殘留問(wèn)題最具代表性。
[0007]傳統(tǒng)的MSC培養(yǎng)液通常都采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基如DMEM或a MEM添加一定比例FBS作為完全培養(yǎng)液。雖然這些傳統(tǒng)組分能夠維持MSC體外培養(yǎng)的干細(xì)胞特性，但FBS成分的不確定性及異源性限制了 MSC的下游研究及治療應(yīng)用。因此胎牛血清的殘留問(wèn)題為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用亟待解決的問(wèn)題。吳祖澤、裴雪濤等在文獻(xiàn)“臨床研究用間充質(zhì)干細(xì)胞的體外制備策略”中報(bào)道使用無(wú)血清培養(yǎng)體系解決牛血清殘留的問(wèn)題。目前市面上已經(jīng)有商品化MSC無(wú)血清培養(yǎng)基在售，但其價(jià)格昂貴，因此，無(wú)血清培養(yǎng)基應(yīng)用于MSC產(chǎn)業(yè)化擴(kuò)增十分不理想。同時(shí)根據(jù)《人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，干細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程中如使用商品化培養(yǎng)基必須提供其詳細(xì)成分，但由于涉及商業(yè)秘密商家通常并不告知詳細(xì)成分，因此其臨床應(yīng)用的安全性仍然存在隱患。此外，有諸多研究文獻(xiàn)中提及各種牛血清替代因子，如血小板裂解因子等，但其屬于血液類制品及其價(jià)格同樣限制了在MSC產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用?！吨袊?guó)藥典》2010版第3部《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中明確規(guī)定細(xì)胞培養(yǎng)液中不得含有人血清。而對(duì)于必須使用FBS作為原輔料的藥品，中國(guó)藥典均提出了相關(guān)質(zhì)量要求，其中最為重要且最有代表的一項(xiàng)指標(biāo)便是牛血清殘留量，通常以牛血清白蛋白作為檢測(cè)指標(biāo)。目前，尚無(wú)任何法律法規(guī)對(duì)細(xì)胞類產(chǎn)品的牛血清殘留進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范?！吨袊?guó)藥典》2010版第3部對(duì)疫苗類產(chǎn)品作出了明確的質(zhì)量要求，要求其牛血清殘留量不得超過(guò)50ng/劑。hUC-MSC臨床擬用給藥劑量參考文獻(xiàn):Jun Liang.Allogenic mesenchymal stem cells transplantat1n in refractory systemic lupuserythematosus:a pilot clinical study.Ann Rheum Dis 2010;69:1423 - 1429，通常為IXlO6個(gè)細(xì)胞/kg。若以平均體重50kg計(jì)，一劑MSC的細(xì)胞量為6X10 7個(gè)細(xì)胞。參考《中國(guó)藥典》中疫苗牛血清殘留質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，則注射用hUC-MSC牛血清殘留量不得超過(guò)Ing/百萬(wàn)細(xì)胞。使用傳統(tǒng)胎牛血清培養(yǎng)MSC的工藝很難達(dá)到此質(zhì)量要求。牛血清殘留量的超標(biāo)可直接導(dǎo)致MSC臨床應(yīng)用上的過(guò)敏反應(yīng)，安全性不容忽視。因此建立一種規(guī)?；⒂行Э刂婆Ｑ鍤埩袅康娜四殠чg充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于解決上述問(wèn)題，提供一種可有效控制hUC-MSC原料細(xì)胞中的牛血清殘留量的方法。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模化制備的方法，包括以下步驟:
(1)取臍帶組織，用含雙抗的D-hank’S液浸泡消毒；
(2)將臍帶剪成I?2cm;
(3)再采用D-hank’s液反復(fù)洗滌，去除殘留血液；
(4)將臍帶繼續(xù)減碎洗滌，至洗滌液澄清無(wú)血色；
(5)從臍帶中分離提取hUC-MSC單細(xì)胞懸液； (6)以DMEM/F12+10%FBS為完全培養(yǎng)液，將hUC-MSC單細(xì)胞于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，且每2?3天更換一次培養(yǎng)液；
(7)待細(xì)胞融合度約80%時(shí)，消化傳代；
(8)重復(fù)步驟(6)?(7)若干次；
(9)重復(fù)步驟(8)，其中以DMEM/F12+5%FBS+5%PHE 代替 DMEM/F12+10% FBS ；
(10)重復(fù)步驟(8)若干次，其中以DMEM/F12 + 10% PHE 代替 DMEM/F12 +10% FBS ；
(11)待細(xì)胞融合度約80%時(shí)，胰酶消化；
(12)收集細(xì)胞懸液，2000Xg，5min離心；
(13)棄上清液，獲得hUC-MSC細(xì)胞沉淀。
[0010]其中，F(xiàn)BS為胎牛血清，PHE為胎盤勻漿液。
[0011]上述胎盤勻漿液的制備方法如下:
(1)取臍帶同源胎盤，剝離羊膜，收集絨毛組織；
(2)緩沖液充分洗滌絨毛組織中殘留血液；
(3)將絨毛組織進(jìn)行勻漿，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋組織勻漿；
(4)在-80°C的條件下凍存；
(5)在4°C的條件下解凍；
(6)重復(fù)步驟(4)?(5)，使組織勻漿反復(fù)凍融兩次；
(7)在4°C的條件下解凍后，采用超聲波進(jìn)行破碎；
(8)12000Xg，20min，4°C離心，收集上清液，然后對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，即得胎盤勻漿液。
[0012]值得說(shuō)明的是，胎盤勻漿液需在-80°C的條件下進(jìn)行保存。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
(I)本發(fā)明的方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞，其牛血清殘留量符合中國(guó)藥典對(duì)相關(guān)制劑的要求，并能夠長(zhǎng)時(shí)間保存而不失其活性，且操作簡(jiǎn)單易行。經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)，以及體外分化實(shí)驗(yàn)鑒定，胎盤勻漿液代替FBS培養(yǎng)得到的hUC-MSC其細(xì)胞形態(tài)、分子表面抗原及成脂成骨分化潛能與FBS培養(yǎng)獲得的MSC —致，均符合國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)對(duì)MSC鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。安全性方面，通過(guò)體外致瘤性檢查，結(jié)果表明無(wú)明顯變化。本發(fā)明的方法具有廣闊臨床應(yīng)用前景。
[0014](2)本發(fā)明中將胎牛血清和臍帶同源胎盤勻漿液相結(jié)合，用于hUC-MSC的體外規(guī)模化制備，既保