一種免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究領(lǐng)域，涉及一種免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，更具體地說，涉及用于免疫細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞免疫治療技術(shù)是一種療效顯著的全新的抗腫瘤治療的方法。通過采集人體免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外富集、活化，并擴(kuò)增，使其靶向性殺傷力增強(qiáng)，再輸回到人體，達(dá)到治療多種免疫疾病的目的。然而體外培養(yǎng)擴(kuò)增，需要適合免疫細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增的培養(yǎng)基，包括適宜的滲透壓，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也要保護(hù)細(xì)胞免受代謝過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的損害。
[0003]傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)主要是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度的人或動(dòng)物血清。但由于血清成分復(fù)雜，雖含有許多對(duì)細(xì)胞有利成分，也含有對(duì)細(xì)胞有害的成分，并且本身有攜帶細(xì)菌、病毒、蛋白傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。人血清昂貴，不適宜大規(guī)模擴(kuò)增。由于血清供體的不同，導(dǎo)致批次間存在很大差異。因此，血清在細(xì)胞臨床大規(guī)模培養(yǎng)中有很多不利因素。
[0004]目前很多人研究無血清培養(yǎng)基，一些公司也已經(jīng)開發(fā)了無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品，比如LONZA公司開發(fā)的X-VIVO系列的無血清培養(yǎng)基等等，這些無血清培養(yǎng)基成分不明確，而且價(jià)格昂貴，大大增加了免疫細(xì)胞治療的成本，不利于廣泛推廣。中國(guó)專利申請(qǐng)201110081988公開了一種人源性無血清培養(yǎng)基及其制備方法，其配方包括用治療用人血清白蛋白溶液、人重組胰島素溶液、人轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、人膽固醇溶液、人過氧化氫酶溶液、2-巰基乙醇溶液、抗壞血酸溶液、亞油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻連蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液11種原料。添加人血白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白等人源性組分的無血清培養(yǎng)基雖然對(duì)原料血漿進(jìn)行了相關(guān)病原體的篩查，并在生產(chǎn)工藝中加入了去除和滅活細(xì)菌的措施，但在理論上仍存在傳播某些已知和未知病原體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明的用于培養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基包括重組人血白蛋白、重組人胰島素、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、巰基乙醇、乙醇胺、膽固醇、亞油酸、油酸、硫酸銅、硫酸鋅、檸檬酸鐵和碳酸氫鈉。
[0007]上述無血清培養(yǎng)基中，所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素和所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白均指能通過基因工程手段進(jìn)行體外表達(dá)得到的，是能夠重復(fù)人工制備的。避免了動(dòng)物源性和人源性所帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0008]上述無血清培養(yǎng)基中，
[0009]所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、所述β-巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵和所述碳酸氫鈉的質(zhì)量比為0.1-lOg: l-50mg:5-200mg: 1-1Omg: l_50mg: l_100mg:0.1-5mg:0.1-5mg:0.0001-0.01mg:0.l_5mg:0.l_10mg:3.024g。
[00?0] 上述無血清培養(yǎng)基中，
[0011]所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、所述β-巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵和所述碳酸氫鈉的質(zhì)量比為4g: 15mg: 70mg: 4mg: 5mg: 1mg: 0.4mg: 0.4mg: 0.0Olmg:
0.8mg:0.8mg:3.024g。
[0012]上述無血清培養(yǎng)基中，
[0013]所述培養(yǎng)基還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、重組人γ-干擾素和重組人白細(xì)胞介素-2;
[0014]所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基;所述細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基具體為IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基;
[0015]所述培養(yǎng)基由所述頂DM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、所述重組人血白蛋白、所述重組人胰島素、所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、所述巰基乙醇、所述乙醇胺、所述膽固醇、所述亞油酸、所述油酸、所述硫酸銅、所述硫酸鋅、所述檸檬酸鐵、所述碳酸氫鈉、所述重組人γ -干擾素和所述重組人白細(xì)胞介素-2組成。其中，所述重組人γ -干擾素和所述重組人白細(xì)胞介素-2是均在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中加入。
[0016]上述無血清培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基的pH為6.8-7.2。
[0017]上述無血清培養(yǎng)基中，
[0018]所述重組人血白蛋白在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.l-10g/L;
[0019]所述重組人胰島素在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為l-50mg/L;
[0020]所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為5_200mg/L;
[0021 ]所述β-巰基乙醇在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為l-10mg/L;
[0022]所述乙醇胺在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為l-50mg/L;
[0023]所述膽固醇在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為l-100mg/L;
[0024]所述亞油酸在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.l-5mg/L;
[0025]所述油酸在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.l_5mg/L;
[0026]所述硫酸銅在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.0001-0.0 lmg/L;
[0027]所述硫酸鋅在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.l_5mg/L;
[0028]所述檸檬酸鐵在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.l-10mg/L;
[0029]所述碳酸氫鈉在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為2.5-3.5g/L
[0030]所述重組人γ-干擾素在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為100-1000IU/mL;
[0031 ]所述重組人白細(xì)胞介素-2在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為100-500IU/mL。
[0032]上述無血清培養(yǎng)基中，
[0033 ]所述重組人血白蛋白在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為4g/L;
[0034]所述重組人胰島素在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為15mg/L;
[0035]所述重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為70mg/L;
[0036]所述β-巰基乙醇在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為4mg/L;
[0037]所述乙醇胺在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為5mg/L;
[0038]所述膽固醇在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為10mg/L;
[0039]所述亞油酸在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.4mg/L;
[0040]所述油酸在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.4mg/L；
[0041 ]所述硫酸銅在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.001mg/L;
[0042]所述硫酸鋅在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.8mg/L；
[0043]所述檸檬酸鐵在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為0.8mg/L;
[0044]所述碳酸氫鈉在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為3.024g/L;
[0045]所述重組人γ-干擾素在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為600IU/mL;
[0046]所述重組人白細(xì)胞介素-2在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為300IU/mL。
[0047]本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基在具體的使用中，先將一袋一升裝IMDM干粉(Gibco12200036)、重組人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重組人胰島素(大腸桿菌重組表達(dá)，LIFE公司)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(酵母重組表達(dá)，Invitria公司)、β-巰基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,Ε0135)、膽固醇(Sigma ,C1231)、亞油酸(Sigma,L1012)、油酸(Sigma, 01383)、硫酸銅(Sigma, C8027)、硫酸鋅(Sigma, Z0251)、檸檬酸鐵(Sigma, F3388)、碳酸氫鈉(Sigma，S5761)和水混勻，得到免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系;再將待培養(yǎng)的免疫細(xì)胞加入上述免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系中，并在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，加入重組人γ -干擾素(山東泉港藥業(yè))和重組人白細(xì)胞介素_2(北京雙鷺?biāo)帢I(yè))。
[0048]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述培養(yǎng)基的新用途。
[0049]本發(fā)明提供了上述培養(yǎng)基在細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)中的應(yīng)用。
[0050]本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)基在提高細(xì)胞存活率和/或菌落數(shù)和/或殺瘤率中的應(yīng)用。
[0051 ]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
[0052]本發(fā)明提供的細(xì)胞的培養(yǎng)方法包括如下步驟:用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
[0053]上述培養(yǎng)基或上述應(yīng)用或上述方法中，所述細(xì)胞為免疫細(xì)胞;所述免疫細(xì)胞具體為離體外周血單核細(xì)胞。
[0054]通過實(shí)驗(yàn)證明:用本發(fā)明的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的免疫細(xì)胞性狀更穩(wěn)定，細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖效果更好。且本發(fā)明的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基化學(xué)成分明確、具有批間差異小、質(zhì)量穩(wěn)定、可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，無動(dòng)物源性和無人源性，安全性高，克服了添加人或動(dòng)物血清帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)，有助于研究各種免疫細(xì)胞的作用機(jī)制，推動(dòng)國(guó)內(nèi)細(xì)胞治療的安全性的標(biāo)準(zhǔn)化，減少患者意外感染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)免疫治療的推廣應(yīng)用具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0055]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0056]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057]實(shí)施例1、免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的配制
[0058]將一袋一升裝IMDM干粉(Gibco 12200036 )、重組人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重組人胰島素(大腸桿菌重組表達(dá)，LIFE公司)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白(酵母重組表達(dá)，Invitria公司)、β-巰基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,E0135)、膽固醇(Sigma, C1231)、亞油酸(Sigma, L1012)、油酸(Sigma, 01383)、硫酸銅(Sigma, C8027)、硫酸鋅(Sigma，Z0251)、檸檬酸鐵(Sigma，F(xiàn)3388)、碳酸氫鈉(Sigma，S5761)和超純水混勻，得到免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系。攪拌溶解，調(diào)節(jié)PH值至7.0，并用0.22μπι濾膜過濾除菌。4 °C保存。
[0059]在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中再向上述免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系中加入重組人γ-干擾素(山東泉港藥業(yè))和重組人白細(xì)胞介素-2 (北京雙鷺?biāo)帢I(yè))，得到免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
[0060]其中，各個(gè)溶質(zhì)組分及其在免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中的濃度分別為:重組人血白蛋白4g/L；重組人胰島素15mg/L；重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白70mg/L；β_巰基乙醇4mg/L ；乙醇胺5mg/L ；膽固醇10mg/L ；亞油酸0.4mg/L；油酸0.4mg/L ；硫酸銅0.00 lmg/L ；硫酸鋅0.8mg/L ；朽1檬酸鐵0.8mg/L ；碳酸氫鈉3.024g/L ；重組人γ _干擾素(INF-r)600IU/mL ；重組人白細(xì)胞介素_2(IL-2)300IU/mLo
[0061 ]實(shí)施例2、免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基在培養(yǎng)免疫細(xì)胞中的應(yīng)用