一種人干性記憶t細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其包括盒體、可開啟的盒蓋、儲存單元和位于盒體內(nèi)部的凹槽，所述儲存單元位于凹槽內(nèi)，所述儲存單元包括細(xì)胞培養(yǎng)液儲存單元、細(xì)胞培養(yǎng)添加劑儲存單元、細(xì)胞激活添加劑儲存單元、細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑儲存單元和細(xì)胞因子添加劑儲存單元。本實(shí)用新型提供的試劑盒集誘導(dǎo)、培養(yǎng)于一體，使用方便、可操作性強(qiáng)，試劑盒組分明確，流程簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，利用其培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞可用于臨床前研究或入庫保存。
【專利說明】
一種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)増?jiān)噭┖?br>技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]干性記憶T細(xì)胞(stem memory T cells，TSCM)是T細(xì)胞中的一個亞群，其具有干細(xì)胞的特征，既能向中樞記憶T細(xì)胞、效應(yīng)記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞分化，保證機(jī)體具有持續(xù)不斷的抗腫瘤和抗感染能力，同時又能進(jìn)行自我更新，維持體內(nèi)TSCM數(shù)量的穩(wěn)定。在表型上，TSCM和初始T細(xì)胞具有共同的表型特征CD45RA+、CD45R0—、CCR7+和CD27+，區(qū)別是能其高表達(dá)⑶95和⑶122，而其他記憶T細(xì)胞亞群中也高表達(dá)⑶95和⑶122。在功能上，和其他類型T細(xì)胞相比，TSCM過繼性回輸后在體內(nèi)的存活更具持久性，可以產(chǎn)生更持續(xù)的免疫應(yīng)答，顯示更好的抗腫瘤響應(yīng)。同時TSCM具有干細(xì)胞的特性，在治療的制備和量的需求上相對于其他細(xì)胞會小很多，可以大大縮短制備的時間和體外擴(kuò)增所需要的費(fèi)用。因此，TSCM在免疫治療中顯示很好的應(yīng)用前景。
[0003]過繼性免疫治療需要足夠量的細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)才能發(fā)揮治療效應(yīng)。由于TSCM在人循環(huán)外周血中所占的比例很低，約占T細(xì)胞的2-4%，增加了其分離制備的難度。雖然可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選，但對血液量的需求太大，且費(fèi)用昂貴，限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有研究表明，TSCM由初始T細(xì)胞分化而來，因而可以在體外建立誘導(dǎo)方法進(jìn)行TSCM的制備和擴(kuò)增。因此，體外TSCM體外誘導(dǎo)、分離和擴(kuò)增試劑盒的開發(fā)，具有可操作性強(qiáng)，操作方法簡單，制備周期短，提高工作效率等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于TSCM研究和臨床研究所需細(xì)胞的誘導(dǎo)、分離和培養(yǎng)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒。本實(shí)用新型提供的試劑盒集誘導(dǎo)、培養(yǎng)于一體，使用方便、可操作性強(qiáng)，試劑盒組分明確，流程簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，利用其培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞可用于臨床前研究或入庫保存。
[0005]為達(dá)此目的，本實(shí)用新型采用以下技術(shù)方案:
[0006]—種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其包括盒體、可開啟的盒蓋、儲存單元和位于盒體內(nèi)部的凹槽，所述儲存單元位于凹槽內(nèi)，所述儲存單元包括細(xì)胞培養(yǎng)液儲存單元、細(xì)胞培養(yǎng)添加劑儲存單元、細(xì)胞激活添加劑儲存單元、細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑儲存單元和細(xì)胞因子添加劑儲存單元。
[0007]本實(shí)用新型中，所述人干性記憶T細(xì)胞可以是⑶8+TSCM細(xì)胞或⑶4+TSCM細(xì)胞等，在此不做特殊限定。
[0008]本實(shí)用新型中，所述細(xì)胞培養(yǎng)液儲存單元包括第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶和第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有至少兩個，例如2個、3個、4個或5個等等;所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有一個以上，例如I個，2個、3個或4個等等。對于第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶和第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的具體數(shù)量，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置。
[0009]根據(jù)本實(shí)用新型，對于第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶和第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的具體數(shù)量，優(yōu)選采用將第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶設(shè)置為兩個，并且最好上下并排設(shè)置，將第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶設(shè)置為一個，并且最好與其中一個第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶平行放置。采用這種設(shè)置可以方便各試劑的取用，操作更容易。
[0010]本實(shí)用新型中，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶，例如I個、2個、3個、4個或5個等等;所述細(xì)胞激活添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞激活添加試劑瓶，例如I個、2個、3個、4個或5個等等;所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶，例如I個、2個、3個、4個或5個等等;所述細(xì)胞因子添加劑儲存單元具有至少一個第一細(xì)胞因子添加試劑瓶和至少一個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶，例如I個、2個、3個、4個或5個等等。對于上述各試劑瓶的具體數(shù)量，可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置。
[0011]根據(jù)本實(shí)用新型，所述細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶、細(xì)胞激活添加試劑瓶和細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶均優(yōu)選具有一個;所述第一細(xì)胞因子添加劑試劑瓶和第二細(xì)胞因子添加劑試劑瓶均優(yōu)選具有一個。
[0012]本實(shí)用新型中，試劑盒的各儲存單元以及各試劑瓶的容量，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行設(shè)置，例如，第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量可以設(shè)置為50-500mL;第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量可以設(shè)置為5_5mL;細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶的容量可以設(shè)置為0.5-50mL;細(xì)胞激活添加試劑瓶的容量可以設(shè)置為2-5mL;細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶的容量可以設(shè)置為0.5-2mL;第一細(xì)胞因子添加劑試劑瓶的容量可以設(shè)置為0.5-2mL;第二細(xì)胞因子添加劑試劑瓶的容量可以設(shè)置為0.5-2mL。
[0013]根據(jù)本實(shí)用新型，所述盒體優(yōu)選設(shè)置為八個凹槽，其中第一凹槽和第二凹槽用于安放第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶;第三凹槽用于安放第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶;第四凹槽用于安放細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶;第五凹槽用于安放細(xì)胞激活添加試劑瓶;第六凹槽用于安放細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶;第七凹槽用于安放第一細(xì)胞因子添加試劑瓶;第八凹槽用于安放第二細(xì)胞因子添加試劑瓶。
[0014]本實(shí)用新型中，對于凹槽的數(shù)量是根據(jù)實(shí)際需要而定的，但優(yōu)選采用上述八個凹槽的形式。
[0015]本實(shí)用新型中，對于細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、細(xì)胞激活添加劑、細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑和細(xì)胞因子添加劑，均采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的試劑，典型但非限制性的實(shí)例如下:
[0016]根據(jù)本實(shí)用新型，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液可以采用含酚紅的RPMI1640液體培養(yǎng)基或低糖D-MEM液體培養(yǎng)基，優(yōu)選采用RPMI 1640液體培養(yǎng)基。
[0017]根據(jù)本實(shí)用新型，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液可以采用熱滅活的胎牛血清、小牛血清、新生牛血清或血清替代物中的任意一種，優(yōu)選為熱滅活的胎牛血清。
[0018]根據(jù)本實(shí)用新型，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑可以采用含150-250mML-谷氨酰胺、10000U的青霉素和1000yg的鏈霉素的生理鹽水或不含鈣和鎂離子的DPBS溶液，優(yōu)選采用含200mM L-谷氨酰胺、10000U的青霉素和1000yg的鏈霉素的質(zhì)量/體積百分比濃度為
0.85%的生理鹽水。
[0019]根據(jù)本實(shí)用新型，所述細(xì)胞激活添加劑可以采用含結(jié)合抗⑶3/⑶28磁珠的生理鹽水或磁珠濃度為1-4 X 18個磁珠/mL的不含I丐和鎂離子的DPBS溶液，優(yōu)選采用磁珠濃度為2X 18個磁珠/mL的不含鈣和鎂離子的DPBS溶液。
[0020]根據(jù)本實(shí)用新型，所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑可以采用含3-10mM TWS119或B1-Acetoxime的DMSO溶液，優(yōu)選采用含7mM TWSl 19的DMSO溶液。
[0021]根據(jù)本實(shí)用新型，所述第一細(xì)胞因子添加劑可以采用含0-20yg/mL的重組人白介素2、20-30yg/mL重組人白介素7和20-30yg/mL重組人白介素15的無菌蒸饋水溶液。
[0022]根據(jù)本實(shí)用新型，所述第二細(xì)胞因子添加劑可以采用含0-15yg/mL的重組人白介素2、3-8yg/mL重組人白介素7和3-8yg/mL重組人白介素15的無菌蒸饋水溶液。
[0023]根據(jù)本實(shí)用新型，所述試劑盒還包含說明書，用于介紹人干性記憶T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增步驟。
[0024]根據(jù)本實(shí)用新型，所述試劑瓶均為封閉無菌試劑瓶，可為平底、圓底或錐形底，在此不做特殊限定。
[0025]根據(jù)本實(shí)用新型，所述人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液的使用方法可為:第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、0.50%-2.00%的細(xì)胞激活添加劑D、0.10%的細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E和0.10%的第一細(xì)胞因子添加劑F。
[0026]根據(jù)本實(shí)用新型，所述人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液的使用方法可為:第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、0.50%-2.00%的細(xì)胞激活添加劑D和0.10%的第二細(xì)胞因子添加劑G。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本實(shí)用新型至少具有以下有益效果:
[0028]本實(shí)用新型提供的試劑盒集誘導(dǎo)、培養(yǎng)于一體，使用方便、可操作性強(qiáng)，試劑盒組分明確，流程簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，利用其培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞可用于臨床前研究或入庫保存。
【附圖說明】
[0029]圖1是本實(shí)用新型的試劑盒外觀結(jié)構(gòu)示意圖，其中1-盒體，2-盒蓋；
[0030]圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例1的試劑盒的盒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖，其中3-第一凹槽，4-第二凹槽，5-第三凹槽，6-第四凹槽，7-第五凹槽，8-第六凹槽，9-第七凹槽，10-第八凹槽；
[0031]圖3是本實(shí)用新型的試劑盒的各試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖，其中，11-第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶，12-第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶，13-細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶，14-細(xì)胞激活添加試劑瓶，15-細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶，16-第一細(xì)胞因子添加試劑瓶，17-第二細(xì)胞因子添加試劑瓶。
[0032]下面對本實(shí)用新型進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本實(shí)用新型的簡易例子，并不代表或限制本實(shí)用新型的權(quán)利保護(hù)范圍，本實(shí)用新型的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本實(shí)用新型的技術(shù)方案。
[0034]為更好地說明本實(shí)用新型，便于理解本實(shí)用新型的技術(shù)方案，本實(shí)用新型的典型但非限制性的實(shí)施例如下:
[0035]實(shí)施例1
[0036]本實(shí)施例提供了用于⑶8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒。
[0037]用于⑶8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其包括盒體I，可開啟的盒蓋2，位于盒體內(nèi)部的凹槽和存放于凹槽內(nèi)的試劑瓶，以及詳細(xì)介紹CD8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增步驟的說明書一份。
[0038]本實(shí)施例中的試劑盒含有2個第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11、I個第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12、I個細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13、I個細(xì)胞激活添加試劑瓶14、I個細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15、I個第一細(xì)胞細(xì)胞因子添加試劑瓶16和I個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17，盒體具有8個凹槽。
[0039]如圖2所示，第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11存放于盒體的第一凹槽3和第二凹槽4內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?50mL，均用于盛放第一細(xì)胞培養(yǎng)液A，該培養(yǎng)液為RPMI1640液體培養(yǎng)基。
[0040]第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12存放于盒體的第三凹槽5內(nèi)，總?cè)萘繛?0mL，用于盛放第二細(xì)胞培養(yǎng)液B，該培養(yǎng)液為熱滅活的胎牛血清。
[0041]細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13存放于盒體的第四凹槽6內(nèi)，總?cè)萘繛?mL，用于盛放細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C為含200mM L-谷氨酰胺、10000U的青霉素和1000yg的鏈霉素的質(zhì)量/體積百分比濃度為0.85%的生理鹽水。
[0042]細(xì)胞激活添加試劑瓶14存放于盒體的第五凹槽7內(nèi)，總?cè)萘繛?mL，用于盛放細(xì)胞激活添加劑D，所述細(xì)胞激活添加劑D選用濃度為2 X 18個磁珠/mL的不含鈣和鎂離子的DPBS溶液。
[0043]細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15存放于盒體的第六凹槽8內(nèi)，總?cè)萘繛?mL，用于盛放細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E，所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E選用含7mM TffSl 19的DMSO溶液。
[0044]第一細(xì)胞因子添加試劑瓶16存放于盒體的第七凹槽9內(nèi)，總?cè)萘繛?.5mL，用于盛放第一細(xì)胞因子添加劑F，所述第一細(xì)胞因子添加劑F為含10yg/mL的重組人白介素2( IL-2)、25yg/mL重組人白介素7(IL-7)和25yg/mL重組人白介素15(IL-15)的無菌蒸餾水溶液。
[0045]第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17存放于盒體的第八凹槽10內(nèi)，容量為0.5mL，用于盛放第二細(xì)胞因子添加劑G，所述第二細(xì)胞因子添加劑G為含5yg/mL重組人白介素7 (IL-7)和5μg/mL重組人白介素15 (IL-15)的無菌蒸餾水溶液。
[0046]實(shí)施例1的試劑盒的使用方法，具體包括如下步驟:
[0047](I)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制
[0048]將第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、1.00%的細(xì)胞激活添加劑D、0.10%的細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E和0.10%的第一細(xì)胞因子添加劑F，使用前混勻。
[0049](2)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液的配制
[0050]將第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、1.00%的細(xì)胞激活添加劑D和0.10%的第二細(xì)胞因子添加劑G，使用前混勻。
[0051 ] (3)PBMC 的制備
[0052]健康供者簽署知情同意書后，采集外周血50mL，利用Ficoll-Paque梯度離心法進(jìn)行PBMC的分離，按照其操作說明進(jìn)行操作。
[0053](4)初始CD8+T細(xì)胞的分離
[0054]采用實(shí)施例1的試劑盒對所得PBMC中的初始CD8+T細(xì)胞進(jìn)行分離，按照操作說明進(jìn)行操作。
[0055](5)CD8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)
[0056]生理鹽水洗滌初始⑶8+T三次，400g離心5min，用細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮，使細(xì)胞終濃度約為I X 106個/1^，放置于371€、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-9天。
[0057](6)CD8+TSCM細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)
[0058]收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的⑶8+TSCM細(xì)胞，生理鹽水洗滌三次，400g離心5min，加入體外擴(kuò)增培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞終濃度為I X 16個/mL左右，放置于37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5 X 16個/mL或培養(yǎng)基變黃，進(jìn)行細(xì)胞分流培養(yǎng)。
[0059]實(shí)施例2
[0060]與實(shí)施例1相比，除試劑盒采用如下結(jié)構(gòu)外，其它與實(shí)施例1相同。
[0061]試劑盒包括盒體I，可開啟的盒蓋2，位于盒體內(nèi)部的凹槽和存放于凹槽內(nèi)的試劑瓶，以及詳細(xì)介紹CD8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增步驟的說明書一份。
[0062]本實(shí)施例中的試劑盒含有4個第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11、I個第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12、I個細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13、I個細(xì)胞激活添加試劑瓶14、I個細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15、I個第一細(xì)胞細(xì)胞因子添加試劑瓶16和I個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17，盒體共有10個凹槽。
[0063]第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11存放于盒體的第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽和第四凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?25mL;第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12存放于盒體的第五凹槽內(nèi)，總?cè)萘繛?0mL;細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13存放于盒體的第六凹槽內(nèi)，總?cè)萘繛?mL;細(xì)胞激活添加試劑瓶14存放于盒體的第七凹槽內(nèi)，總?cè)萘繛?mL;細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15存放于盒體的第八凹槽內(nèi)，總?cè)萘繛?mL;第一細(xì)胞因子添加試劑瓶16存放于盒體的第九凹槽內(nèi)，總?cè)萘繛?br>0.5mL;第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17存放于盒體的第十凹槽內(nèi)，容量為0.5mL。
[0064]實(shí)施例3
[0065]與實(shí)施例1相比，除試劑盒采用如下結(jié)構(gòu)外，其它與實(shí)施例1相同。
[0066]試劑盒包括盒體I，可開啟的盒蓋2，位于盒體內(nèi)部的凹槽和存放于凹槽內(nèi)的試劑瓶，以及詳細(xì)介紹CD8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增步驟的說明書一份。
[0067]本實(shí)施例中的試劑盒含有2個第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11、2個第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12、2個細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13、2個細(xì)胞激活添加試劑瓶14、2個細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15、2個第一細(xì)胞細(xì)胞因子添加試劑瓶16和2個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17，盒體共有14個凹槽。
[0068]第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11存放于盒體的第一凹槽和第二凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?50mL;第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12存放于盒體的第三凹槽和第四凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?5mL;細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13存放于盒體的第五凹槽和第六凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?br>2.5mL;細(xì)胞激活添加試劑瓶14存放于盒體的第七凹槽和第八凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?.5mL;細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15存放于盒體的第九凹槽和第十凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛镮mL;第一細(xì)胞因子添加試劑瓶16存放于盒體的第^^一凹槽和第十二凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?.25mL;第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17存放于盒體的第十三凹槽和第十四凹槽內(nèi)，每瓶容量為0.25mL。
[0069]實(shí)施例4
[0070]與實(shí)施例1相比，除試劑盒采用如下結(jié)構(gòu)外，其它與實(shí)施例1相同。
[0071]試劑盒包括盒體I，可開啟的盒蓋2，位于盒體內(nèi)部的凹槽和存放于凹槽內(nèi)的試劑瓶，以及詳細(xì)介紹CD8+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增步驟的說明書一份。
[0072]本實(shí)施例中的試劑盒含有4個第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11、2個第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12、2個細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13、2個細(xì)胞激活添加試劑瓶14、2個細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15、2個第一細(xì)胞細(xì)胞因子添加試劑瓶16和2個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17，盒體共有16個凹槽。
[0073]第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11存放于盒體的第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽和第四凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?25mL;第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12存放于盒體的第五凹槽和第六凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?5mL;細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13存放于盒體的第七凹槽和第八凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?.5mL;細(xì)胞激活添加試劑瓶14存放于盒體的第九凹槽和第十凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?.5mL;細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15存放于盒體的第^^一凹槽和第十二凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛镮mL;第一細(xì)胞因子添加試劑瓶16存放于盒體的第十三凹槽和第十四凹槽內(nèi)，每瓶總?cè)萘繛?.25mL;第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17存放于盒體的第十五凹槽和第十六凹槽內(nèi)，每瓶容量為0.25mL0
[0074]實(shí)施例5
[0075]與實(shí)施例1相比，除試劑盒用于CD4+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增外，其它與實(shí)施例1相同。
[0076]實(shí)施例6
[0077]與實(shí)施例1相比，除試劑盒中所用試劑如下外，其它與實(shí)施例1相同。
[0078]第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶11用于盛放第一細(xì)胞培養(yǎng)液A，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液A為低糖D-MEM液體培養(yǎng)基。
[0079]第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶12用于盛放第二細(xì)胞培養(yǎng)液B，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液B為小牛血清。
[0080]細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶13用于盛放細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C為不含鈣和鎂離子的DPBS溶液。
[0081]細(xì)胞激活添加試劑瓶14用于盛放細(xì)胞激活添加劑D，所述細(xì)胞激活添加劑D為含結(jié)合抗⑶3/⑶28磁珠的生理鹽水。
[0082]細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶15用于盛放細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E，所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E為含3-1OmM TWSl 19的DMSO溶液。
[0083]第一細(xì)胞因子添加試劑瓶16用于盛放第一細(xì)胞因子添加劑F，所述第一細(xì)胞因子添加劑F為含10yg/mL的重組人白介素2 (IL-2)、30yg/mL重組人白介素7 (IL-7)和20yg/mL重組人白介素15 (IL-15)的無菌蒸餾水溶液。
[0084]第二細(xì)胞因子添加試劑瓶17用于盛放第二細(xì)胞因子添加劑F，所述第二細(xì)胞因子添加劑G為含15yg/mL的重組人白介素2 (IL-2)、3yg/mL重組人白介素7 (IL-7)和8yg/mL重組人白介素15 (IL-15)的無菌蒸餾水溶液。
[0085]實(shí)施例7
[0086]與實(shí)施例6相比，除試劑盒采用如下使用方法外，其它與實(shí)施例6相同。
[0087](I)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配制
[0088]將第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、2.00%的細(xì)胞激活添加劑D、0.10%的細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑E和0.10%的第一細(xì)胞因子添加劑F，使用前混勻。
[0089](2)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液的配制
[0090]將第一細(xì)胞培養(yǎng)液A和第二細(xì)胞培養(yǎng)液B以9:1的體積比進(jìn)行混合，再添加1.00%的細(xì)胞培養(yǎng)添加劑C、1.00%的細(xì)胞激活添加劑D和0.10%的第二細(xì)胞因子添加劑G，使用前混勻。
[0091](3)PBMC 的制備
[0092]簽署知情同意書后，采集健康供者外周血50mL，利用Ficoll-Paque梯度離心法進(jìn)行PBMC的分離，按照其操作說明進(jìn)行操作。
[0093](4)初始⑶4+T細(xì)胞的分離
[0094]初始⑶4+T細(xì)胞分離試劑盒對所得PBMC中的初始⑶4+T細(xì)胞進(jìn)行分離，按照操作說明進(jìn)行操作。
[0095](5)CD4+TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)
[0096]生理鹽水洗滌初始⑶4+T細(xì)胞三次，400g離心5min，用細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮，使細(xì)胞終濃度約為I X 1MVmL，放置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天。
[0097](6)CD4+TSCM細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)
[0098]收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的⑶4+TSCM細(xì)胞，生理鹽水洗滌三次，400g離心5min，加入體外擴(kuò)增培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞終濃度達(dá)到1.5 X 106f/mL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5 X 16個/mL或培養(yǎng)基變黃，進(jìn)行細(xì)胞分流培養(yǎng)。
[0099]通過上述實(shí)施例可以看出，本實(shí)用新型提供的試劑盒集誘導(dǎo)、培養(yǎng)于一體，使用方便、可操作性強(qiáng)，試劑盒組分明確，流程簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，利用其培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞可用于臨床前研究或入庫保存。
[0100]
【申請人】聲明，本實(shí)用新型通過上述實(shí)施例來說明本實(shí)用新型的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本實(shí)用新型并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本實(shí)用新型必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本實(shí)用新型的任何改進(jìn)，對本實(shí)用新型所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
[0101]以上詳細(xì)描述了本實(shí)用新型的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本實(shí)用新型并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本實(shí)用新型的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本實(shí)用新型的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
[0102]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本實(shí)用新型對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0103]此外，本實(shí)用新型的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本實(shí)用新型的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本實(shí)用新型所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人干性記憶T細(xì)胞體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增試劑盒，其特征在于，其包括盒體、可開啟的盒蓋、儲存單元和位于盒體內(nèi)部的凹槽，所述儲存單元位于凹槽內(nèi)，所述儲存單元包括細(xì)胞培養(yǎng)液儲存單元、細(xì)胞培養(yǎng)添加劑儲存單元、細(xì)胞激活添加劑儲存單元、細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑儲存單元和細(xì)胞因子添加劑儲存單元。2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液儲存單元包括第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶和第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有至少兩個，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有一個以上。3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有兩個，所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶具有一個。4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶;所述細(xì)胞激活添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞激活添加試劑瓶;所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加劑儲存單元具有一個以上細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶;所述細(xì)胞因子添加劑儲存單元具有至少一個第一細(xì)胞因子添加試劑瓶和至少一個第二細(xì)胞因子添加試劑瓶。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶、細(xì)胞激活添加試劑瓶和細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶均具有一個;所述第一細(xì)胞因子添加劑試劑瓶和第二細(xì)胞因子添加劑試劑瓶均具有一個。6.如權(quán)利要求3或5所述的試劑盒，其特征在于，所述盒體設(shè)置有八個凹槽，其中第一凹槽和第二凹槽用于安放第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶;第三凹槽用于安放第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶;第四凹槽用于安放細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶;第五凹槽用于安放細(xì)胞激活添加試劑瓶;第六凹槽用于安放細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶;第七凹槽用于安放第一細(xì)胞因子添加試劑瓶;第八凹槽用于安放第二細(xì)胞因子添加試劑瓶。7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量設(shè)置為50-500mL;所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量設(shè)置為5_50mL;所述細(xì)胞培養(yǎng)液添加試劑瓶的容量設(shè)置為0.5-5mL;所述細(xì)胞激活添加試劑瓶的容量設(shè)置為2-5mL;所述細(xì)胞誘導(dǎo)添加試劑瓶的容量設(shè)置為0.5-2mL;所述第一細(xì)胞因子添加劑試劑瓶的容量設(shè)置為0.5-2mL;所述第二細(xì)胞因子添加劑試劑瓶的容量設(shè)置為0.5-2mL。8.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述第一細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶中的第一細(xì)胞培養(yǎng)液為RPMI 1640液體培養(yǎng)基； 所述第二細(xì)胞培養(yǎng)液試劑瓶中的第二細(xì)胞培養(yǎng)液為熱滅活的胎牛血清、小牛血清、新生牛血清或血清替代物中的任意一種。9.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含說明書。
【文檔編號】C12M1/24GK205603606SQ201620383731
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】孫長斌, 張曦, 周欣, 張家文
【申請人】深圳華大基因研究院