一種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法、建庫(kù)試劑 盒、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒，屬于基因測(cè)序領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀(guān)遺傳學(xué)修飾方式之一，真核生物中的甲基化主 要發(fā)生于胞喀晚，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(面MTs)的作用下使CpG二核巧酸5'-端的胞喀晚 (C)轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞喀晚(5mC)。甲基化的主要功能是調(diào)控基因表達(dá)。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DNA 甲基化在分化細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定;相比之下，在早期胚胎發(fā)育和原始生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中會(huì) 發(fā)生基因組范圍的去甲基化和DNA甲基化譜式重新建立(Reme thy lat i on)的過(guò)程。
[0003] 全基因組亞硫酸鹽測(cè)序可W全面地分析DNA甲基化情況，但由于它是對(duì)整個(gè)基因 組進(jìn)行深度測(cè)序，需要較大的測(cè)序數(shù)據(jù)量。而簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序(RRBS)技術(shù)提 供了一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法。運(yùn)種方法首先采用特異性限制性核酸內(nèi) 切酶(通常是MspI酶)來(lái)消化基因組DNA，然后通過(guò)片段選擇進(jìn)行啟動(dòng)子及CpG島區(qū)域的特異 性富集，隨后進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理并測(cè)序。RRBS通過(guò)測(cè)較少的數(shù)據(jù)量，就可W有效的覆蓋 基因組大部分CpG位點(diǎn)，包括>70%的啟動(dòng)子，>80%的CpG島和增強(qiáng)子、外顯子、3/UTRs和重 復(fù)元件等。
[0004] 傳統(tǒng)的RRBS技術(shù)包括如下步驟：（1)使用MspI酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切；（2)對(duì)酶切 產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)膜純化；（3)對(duì)純化產(chǎn)物依次進(jìn)行末端補(bǔ)平、加 A和甲基化接頭反應(yīng)；（4)對(duì)加接 頭產(chǎn)物進(jìn)行片段篩選；（5)對(duì)篩選后的產(chǎn)物進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理，使未甲基化的C轉(zhuǎn)變?yōu)?U; (6)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到測(cè)序文庫(kù)。
[0005] 傳統(tǒng)的RRBS方法對(duì)基因組DNA起始量的要求較高，約3~扣g，不適合微量樣本或者 單細(xì)胞樣本。單細(xì)胞本身所含有的基因組比傳統(tǒng)樣本低好多個(gè)數(shù)量級(jí)，任何降解、樣品損失 或者污染都會(huì)對(duì)測(cè)序質(zhì)量帶來(lái)非常嚴(yán)重的影響，導(dǎo)致傳統(tǒng)的RRBS方法無(wú)法應(yīng)用于單細(xì)胞或 微量樣本，比如對(duì)于臨床上比較珍貴又稀少的樣本或者單個(gè)細(xì)胞樣本。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞的甲基化測(cè)序，Sebastien等提出了單細(xì)胞全基因組重亞硫酸 鹽測(cè)序技術(shù)，流程包括：（1)采集單細(xì)胞；（2)將采集的單細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到裂解后的單細(xì) 胞樣本；（3)將所述裂解后的單細(xì)胞樣本進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理，得到單鏈重亞硫酸氨鹽處 理產(chǎn)物；（4) W上述單鏈的重亞硫酸氨鹽處理產(chǎn)物為模板，使用含生物素標(biāo)記的oligol引物 合成第一條鏈；（5)使用鏈親和素磁珠調(diào)取生物素標(biāo)記的第一條鏈；（6) W上述生物素標(biāo)記 的第一條鏈為模板，使用〇lig〇2引物合成第二條鏈；W及(7) W所述第二條鏈作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建二代測(cè)序用DNA文庫(kù)。但是，該方法得到的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果對(duì)CpG島的覆蓋 率偏低。
[0007] 參考文獻(xiàn)
[0008] Sebastien Smallwood,Heather J Lee,et al.2014. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.Nature methods,8, 11(8):817-820

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明改進(jìn)了傳統(tǒng)的RRBS技術(shù)，將PCR前的RRBS文庫(kù)構(gòu) 建步驟整合到單個(gè)反應(yīng)管中完成，獲得了合格的測(cè)序用RRBS文庫(kù)，來(lái)繪制單堿基分辨率的 小鼠或人類(lèi)CpG位點(diǎn)的甲基化圖譜，能夠更好的從單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞之間的異質(zhì)性。 [00 1日]本發(fā)明包括：
[0011] 1. -種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[001 ^ A.將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到單細(xì)胞基因組DNA;
[0013] B.將所述單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行MspI酶切，得到酶切產(chǎn)物；
[0014] C.將所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)和3 '端加 A，得到3 '端加 A產(chǎn)物；
[0015] D.將所述3 '端加 A產(chǎn)物進(jìn)行甲基化接頭連接，得到加甲基化接頭產(chǎn)物；
[0016] E.將所述加甲基化接頭產(chǎn)物進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
[0017] F.將所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到測(cè)序文庫(kù)，
[001引 其中，
[0019] 所述步驟A~E在單個(gè)反應(yīng)管中完成。
[0020] 2.根據(jù)項(xiàng)1所述的方法，在步驟E后包括步驟E1:在所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入tRNA進(jìn)行 純化。
[0021] 3.根據(jù)項(xiàng)1或2任一項(xiàng)所述的方法，所述單細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物。
[0022] 4.根據(jù)項(xiàng)3所述的方法，所述哺乳動(dòng)物為人和/或小鼠。
[0023] 5.根據(jù)項(xiàng)1~4任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟A采用的裂解體系包括:裂解緩沖液和 蛋白酶。
[0024] 6.根據(jù)項(xiàng)1~4任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟B采用的酶為MspI限制性?xún)?nèi)切酶。
[0025] 7.根據(jù)項(xiàng)1~4任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟D采用的甲基化接頭連接體系包括： T4DNA連接酶、甲基化接頭、連接酶緩沖液。
[0026] 8.-種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序用文庫(kù)的構(gòu)建試劑盒，包括選自下述 試劑中的至少一種或全部：
[0027] 用于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑，用于對(duì)單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行MspI酶切處理的試 劑，用于所述3'端加 A的試劑，用于將所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接頭的試劑，用于對(duì) 所述加甲基化接頭的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理的試劑，用于對(duì)重亞硫酸氨鹽處理產(chǎn) 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。
[00%] 9.-種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序方法，包括如下步驟：
[0029 ] A.將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到基因組DNA;
[0030] B.將所述基因組DNA進(jìn)行MspI酶切，得到酶切產(chǎn)物；
[0031 ] C.將所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)和3 '端加 A，得到3 '端加 A產(chǎn)物；
[0032] D.將所述3 '端加 A產(chǎn)物進(jìn)行甲基化接頭連接，得到加甲基化接頭產(chǎn)物；
[0033] E.將所述加甲基化接頭產(chǎn)物進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
[0034] F.將所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到測(cè)序用文庫(kù)；
[0035] G.對(duì)所述測(cè)序用文庫(kù)進(jìn)行二代測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果，對(duì)所述單細(xì)胞的甲基化情況 進(jìn)行分析。
[0036] 10. -種單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽的測(cè)序試劑盒，包括選自下述試劑中的 至少一種或全部：
[0037] 用于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑，用于對(duì)單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行MspI酶切處理的試 劑，用于所述3'端加 A的試劑，用于將所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接頭的試劑，用于對(duì) 所述加甲基化接頭的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理的試劑，用于對(duì)重亞硫酸氨鹽處理產(chǎn) 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。
[0038] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:適用于起始量低樣本的建庫(kù)，特別是單細(xì) 胞樣本，能夠W單堿基分辨率繪制小鼠或人類(lèi)細(xì)胞內(nèi)約100萬(wàn)CpG位點(diǎn)的甲基化圖譜。相較 于單細(xì)胞重亞硫酸氨鹽測(cè)序(scBS)技術(shù)，scRRBS能夠更好地覆蓋CpG島。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1是用安捷倫2100生物分析儀對(duì)單個(gè)卵母細(xì)胞的scRRBS文庫(kù)進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控的結(jié) 果；
[0040] 圖2是用安捷倫2100生物分析儀對(duì)陰性對(duì)照樣本的scRRBS文庫(kù)進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)控的結(jié) 果。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測(cè)序用單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽文庫(kù) 的方法，包括如下步驟：
[0042] A.將單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行裂解，得到單細(xì)胞基因組DNA;
[0043] B.將所述單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行MspI酶切，得到酶切產(chǎn)物；
[0044] C.將所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)和3 '端加 A，得到3 '端加 A產(chǎn)物；
[0045] D.將所述3 '端加 A產(chǎn)物進(jìn)行甲基化接頭連接，得到加甲基化接頭產(chǎn)物；
[0046] E.將所述加甲基化接頭產(chǎn)物進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；
[0047] F.將所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到測(cè)序用文庫(kù)，
[0048] 其中，所述步驟A~E在單個(gè)反應(yīng)管中完成。
[0049] 本發(fā)明創(chuàng)造性地將構(gòu)建單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽文庫(kù)的程序在一個(gè)反應(yīng) 管中完成，極大地降低了分步純化和片段篩選導(dǎo)致的降解和污染等對(duì)樣品造成的損失。
[0050] 對(duì)于所述步驟E中采用的重亞硫酸氨鹽處理的體系及反應(yīng)條件沒(méi)有特殊限制，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可W適宜選擇能夠在重亞硫酸氨鹽處理過(guò)程中使用的那些成份體系及反應(yīng) 條件。
[0051] 作為優(yōu)選，本發(fā)明在步驟E后進(jìn)行步驟E1:將所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入tRNA進(jìn)行純化。 在純化步驟中加入tRNA，極大地提高了純化效率，使得純化步驟得W在一步完成，降低了現(xiàn) 有技術(shù)中采用分步純化對(duì)單細(xì)胞樣本造成的損失。
[0052] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述單細(xì)胞來(lái)源于哺乳動(dòng)物、植物和/微生物中的至少一種。更 優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人和/或小鼠。
[0053] 作為優(yōu)選，所述步驟A采用的裂解體系包括:裂解緩沖液和蛋白酶。
[0054] 作為優(yōu)選，所述步驟B采用的酶為MspI限制性?xún)?nèi)切酶。
[005引作為優(yōu)選，所述步驟D采用的甲基化接頭連接體系包括：T4DNA連接酶、甲基化接 頭、連接酶緩沖液。
[0056] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建測(cè)序用單細(xì)胞簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽文 庫(kù)的試劑盒，包括選自下述試劑中的至少一種或全部：
[0057] 用于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑，用于對(duì)單細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行MspI酶切處理的試 劑，用于所述3'端加 A的試劑，用于將所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接頭的試劑，用于對(duì) 所述加甲基化接頭的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸氨鹽處理的試劑，用于對(duì)重亞硫酸氨鹽處理產(chǎn) 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑。
[0058] 用于對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行裂解的試劑，例如蛋白酶及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液等；
[0059] 用于對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行Msp I限制性?xún)?nèi)切酶處理的試劑，例如Msp I酶及相應(yīng)的 酶切反應(yīng)緩沖液等；
[0060] 用于所述3'端加 A的試劑，例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相應(yīng)的反應(yīng)緩沖 液等，可W與所述的用于對(duì)所述酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)的試劑相同；
[0061] 用于將所述3'端加 A的DNA片段加甲基化接頭的試劑，例如甲基化接頭、T4DNA連接 酶及相應(yīng)的連接反應(yīng)緩沖液；
[0062] 用于對(duì)所述加甲基化接頭的DNA片段進(jìn)行重亞硫酸氨鹽(Bisulfite)處理的試劑， 例如EZ Methylation(Zymo公司產(chǎn)品）等；
[0063] 用于對(duì)重亞硫酸氨鹽處理產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑，例如ΚΑΡΑ HiFi HotStart 化acil+Ready Mix、Index引物等；
[0064] 通過(guò)對(duì)所得測(cè)序用DNA文庫(kù)進(jìn)行二代測(cè)序，并基于測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，可W獲得所 述基因組DNA的甲基化的信息。
[0065] 本發(fā)明還提供了一種單細(xì)胞的簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸氨鹽測(cè)序方法，其在包括上述 本發(fā)明的建庫(kù)方法的各步驟的基礎(chǔ)上，還包括步驟G:對(duì)所述測(cè)序用文庫(kù)進(jìn)行