線粒體基因組擴增的通用引物混合物及其設(shè)計和擴增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種用于動物線粒體基因組擴增的通用 引物混合物及其設(shè)計和擴增方法，W及包含所述通用引物混合物的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體是細胞內(nèi)半自主性細胞器，來自于母系遺傳并具有自身的一套基因組，其 基因穩(wěn)定、排列保守幾乎不發(fā)生重組，易于擴增和測序已成為研究動物進化的重要分子標(biāo) 記，被廣泛用于種群遺傳結(jié)構(gòu)、雜交、基因漂流生物及系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究。
[0003] 大多數(shù)動物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)為閉合環(huán)狀雙鏈DNA(某些低等刺胞動物線粒體 基因組的結(jié)構(gòu)為線性），包含了從分子序列到基因結(jié)構(gòu)的全面信息，長度一般在14-20kb之 間。在進行動物線粒體基因組研究時，目前主要的測序策略，包括基于物理分離線粒體DNA 的克隆文庫測序、基于傳統(tǒng)PCR擴增產(chǎn)物直接測序的方法，W及新興的高通量線粒體基因組 測序技術(shù)，后者又包括基于傳統(tǒng)PCR預(yù)擴增線粒體DNA的高通量方法、鳥槍式高通量測序方 法W及從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得線粒體基因組序列的方法(Zardoya and Su紅ez 2007,沙森， 林立亮et al.2013,Cameron 2014)。
[0004] 然而，克隆文庫測序方法成本高而速度慢，基于傳統(tǒng)的PCR方法，則受限于引物通 用性與擴增效率的平衡，常需針對特定類群設(shè)計特異引物，或需根據(jù)已測出片段重新設(shè)計 引物擴增未知區(qū)域，大大拖慢了項目進展速度。鳥槍式高通量測序方法也存在著諸多問題， 如易混入基因組DNA來源的線粒體假基因，W及因讀長片段短而含重復(fù)片段的控制區(qū)難W 拼接完整等。且所需測序通量大，生物信息拼接過程相對復(fù)雜。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得線粒體 基因組序列的方法，成本較高且需結(jié)合傳統(tǒng)PCR方法W獲得完整線粒體基因組。而由于多數(shù) 無脊椎動物身體微小，測定線粒體基因組原則上只能采用一個個體的總DNA，物理、化學(xué)分 離方法(如差速離屯、，密度梯度離屯、、堿變性法)所得的富集線粒體DNA，其總量也不足W完 成高通量測序所需的建庫工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明實施例公開了一種用于動物線粒體基因組擴增的通用 引物混合物及其設(shè)計和擴增方法，W及包含所述通用引物混合物的試劑盒。利用本發(fā)明的 提供引物混合物或試劑盒和提供的動物線粒體基因組擴增方法，結(jié)合新興的高通量測序技 術(shù)，可W高效低成本地獲得動物線粒體基因組信息。
[0006] 本發(fā)明提供一種用于擴增動物線粒體基因組的通用引物混合物，其包含具有W下 序列的通用引物或其化學(xué)修飾衍生物：
[0007] 沈Q ID NO.1:5 '-CCATTTCAYTGATGRTTYCC-3 '；
[0008] SEQ ID NO.2:5 '-GGTAAAAATCCTADAAAWGGNGG-3 '；
[0009] SEQ ID N0.3:5'-TGATTCTTTGGWCAYCCAGAAGT-3'；
[0010] 沈Q ID NO.4:5 '-GGTAATCAGARTATCGWCGNGG-3 '；
[0011] 沈Q ID NO.5:5 '-ACWATTGGWCAYCAATGATAYTG-3 '；
[0012] SEQ ID NO.6:5'-CCACARATTTCTGARCATTG-3'；
[0013] SEQ ID NO.7:5'-GTTGATCAAAG肥CWTGRCC-3'；
[0014] SEQ ID NO.8:5 '-TCWACAAARTGTCARTAYCA-3 '；
[0015] 沈Q ID NO.9:5 '-TTAAATCCTTWGARTAAAAYCC-3 '；
[0016] 沈Q ID NO.10:5 '-TTAGGTTGRGATGGNYTAGG-3 '；
[0017] 沈Q ID NO.11:5 '-CCHGAAGAACATAANCCRTG-3 '；
[0018] 沈Q ID NO.12:5 '-TGAGGATATCAACCNGARCG-3 '；
[0019] SEQ ID N0.13:5'-TAGAACAYRATGAAAYTTTGGWTC-3'；
[0020] SEQ ID NO.14:5 '-TTCTACTGGTCGWGCTCCAATYCA-3 '；
[0021] 沈Q ID NO.15:5 '-CCGGTYTGAACTCARATCATGTAA-3 '；
[0022] 沈Q ID NO.16:5，-ATTTATTGTACCTTKTGTATCAG-3，；
[0023] SEQ ID N0.17:5'-GTACAMCYACTRTGTTACGACTT-3'和
[0024] SEQ ID NO.18:5 '-GTGCCAGCADYYGCGGTTANAC-3 '，
[0025] 其中所述動物為除刺胞動物W外的具有環(huán)狀線粒體基因組的無脊椎動物，W及 蛙、蛇或鼠。
[0026] 在一個具體的實施方案中，所述通用引物3'端的兩個堿基進行硫代修飾。
[0027] 在另一個具體的實施方案中，所述動物線粒體基因組可W來自W下動物:家衣魚、 廣斧瞳卿、勇斧瞳卿、麗擬絲鵬、樓桃蜂卿、馬達加斯加蜂卿、金邊地整、杜比亞蜂卿、中華真 地整、麻皮睹、細紋小家蟻、琵琶甲、挪屯、葉甲、竹蟲、黃粉蟲、洋蟲、康瘦蚊、挪子織蛾、球鼠 婦、雷達蝸、毛蝴、泥蝴、青始、蘭始、通俗腔蝴、菲牛賠、雨蛙、大泛樹蛙、中國林蛙、烏梢蛇或 小鼠。
[0028] 本發(fā)明還提供了所述通用引物的設(shè)計方法，其特征在于，登錄NCBI網(wǎng)站中的 GenBank 數(shù)據(jù)庫捜索已測定的編號為 U37541.1、NC_002084.1、NC_002355.1、ΚΡ163643.1、 NC_003081.2、NC_001712.1、NC_002609.1、NC_002651.1、NC_004371.1、NC_006895.1、NC_ 005437.1、 NC_006515.2、AJ270997.1、AB018440、X54252.1、NC_011581.1、KF897830、NC_ 002184.1、 NC_013188.1、KF750628、NC_023925.1、NC_023836.1和 NC_006665的部分無脊椎 動物線粒體基因組序列，進行多序列對位比對分析，找到保守序列，將捜尋到的保守序列載 入引物設(shè)計軟件，設(shè)計出所述用于動物線粒體基因組擴增的通用引物。
[0029] 本發(fā)明還提供一種利用所述的通用引物混合物進行動物線粒體基因組擴增的方 法，其特征在于，擴增體系包括樣品體系和反應(yīng)體系，
[0030] 其中每化1樣品體系包含： 動物總 DNA 10-100 ng,
[003。引物貼介物 （0.0005-0.01) μηιο?XI8， 2 X退火緩沖液 2-3 μL，
[003^ 雙蒸水 0.1-1μ1;
[0033] 每15μ1反應(yīng)體系包含： Phi29 酶 lU-lOU， 焦憐酸酶 O.OlU-0 05U，
[0034] dNTP 0.005-0.01 μ 風(fēng)〇1， 10Χ機i29緩沖液 1-5川 雙蒸水 8-13姐
[00巧]擴增條件為： 變性 90-96儀，1-5分鐘， 退火 緩慢冷卻至室溫，
[0036] 延伸 25-%打，12-18小時， 終止 65 °C, 5-15分鐘。
[0037] 在一個具體的實施方案中，其中每化1樣品體系包含： 動物總 DNA 10-100 ng, 引物混合物 0.005 μ molΧ 18，
[00；3 引 2X退火緩沖液 2.5 μ1, 雙蒸水 0 5μΙ;
[0039] 每15μ1反應(yīng)體系包含： Ρ1也9酶 5U， 焦憐酸酶 0.02 U，
[0040] dNTP 0.008 μιτιο?, 10XPhi29 緩沖被 2μ1, 雙蒸水 11.2 μ1;:
[0041] 擴增條件為： 變性 90-96Χ：，1-5分鐘， 退火 緩慢冷卻至室溫，
[0042] 延伸 25-35Γ，12-18 小時， 終[| 65 Cl 10分鐘。
[0043] 在另一個具體的實施方案中，所述退火緩沖液是pH為7.6,化is-HCl終濃度為80mM MgCl2終濃度為20mM的混合溶液。
[0044] 本發(fā)明還提供了一種用于擴增動物線粒體基因組的試劑盒，其包含所述的通用引 物混合物，其中所述動物為除刺胞動物W外的具有環(huán)狀線粒體基因組的無脊椎動物，W及 蛙、蛇或鼠。
[0045] 其中所述試劑盒還可W包括退火緩沖液、雙蒸水、Phi29酶、焦憐酸酶、dNTP、化i29 緩沖液，及操作說明書。
[0046] 本發(fā)明提供的動物線粒體DNA通用引物混合物，結(jié)合PM29酶滾環(huán)擴增方法，可W 高效特異性地富集多種動物線粒體基因組，將線粒體DNA占總基因組DNA的質(zhì)量比例從約 1%提升至80%左右，結(jié)合后續(xù)高通量測序方法可獲得線粒體基因組完整序列?？捎行懦?核基因組來源的假基因?qū)ζ唇拥?