一種檢測tpmt基因多態(tài)性的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測ΤΡΜΤ基因多態(tài)性的引物與方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 琉嚷嶺類藥物屬于抑制嚷嶺合成途徑的細胞周期特異性藥物，能競爭性抑制次黃 嚷嶺轉(zhuǎn)變，阻礙DNA合成，抑制淋己細胞增殖，是臨床上常用于白血病、實體腫瘤的抗癌治療 和器官移植后的免疫抑制治療的藥物。在急性淋己細胞白血病(Α化)的治療和改善預(yù)后中， 琉嚷嶺類藥物發(fā)揮了重要的作用，已有研究顯示A化治療方案中含琉嚷嶺的維持治療是減 少復(fù)發(fā)和提高無病生存率的重要環(huán)節(jié)。同時，現(xiàn)有研究也表明，治療A化的抗嚷嶺代謝藥 物一6-琉基嚷嶺(6-MP)和6-琉代鳥嚷嶺(6-TG)等均是無內(nèi)在生物活性的藥物，必須通過體 內(nèi)一系列代謝后才能發(fā)揮其抗白血病效應(yīng)。琉嚷嶺甲基轉(zhuǎn)移酶(ΤΡΜΤ基因編碼)是琉嚷嶺代 謝過程的關(guān)鍵酶之一，能利用S-腺巧-心甲硫氨酸（SAM)作為甲基的供體和底物結(jié)合，特異 地催化雜環(huán)類和芳香類化合物苯環(huán)6-位硫原子甲基化而使其轉(zhuǎn)變成具有生物活性的中間 產(chǎn)物。琉嚷嶺甲基轉(zhuǎn)移酶活性缺乏者，琉嚷嶺轉(zhuǎn)化率降低，使用標(biāo)準(zhǔn)劑量的琉嚷嶺治療可能 會導(dǎo)致嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。
[0003] 關(guān)于ΤΡΜΤ的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，琉嚷嶺甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低或缺乏與其等位基因多態(tài) 性密切相關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)18種可能會引起琉嚷嶺甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低的ΤΡΜΤ單核巧酸多態(tài) 性（SNPs)位點，對不同人種進行的研究發(fā)現(xiàn)，ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C運3 個ΤΡΜΤ基因多態(tài)性位點最為常見，其余的則比較罕見。ΤΡΜΤ活性缺乏的患者服用標(biāo)準(zhǔn)計量 琉嚷嶺后藥物在體內(nèi)代謝障礙，將會導(dǎo)致較為嚴(yán)重的琉嚷嶺相關(guān)毒副作用，因此使用琉嚷 嶺治療相關(guān)疾病的過程中，建議篩查使用琉嚷嶺患者的ΤΡΜΤ基因類型，W指導(dǎo)臨床琉嚷嶺 藥物劑量的調(diào)整。
[0004] 中國專利CN101333560公開了一種嚷嶺類藥物敏感基因忍片檢測試劑盒，可用于 檢測ΤΡΜΤ基因的ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C多態(tài)性位點，但基因忍片的設(shè)計 成本高，檢測費用昂貴，而且其敏感度不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差。現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種 檢測特異性和靈敏度高、準(zhǔn)確性和精密性好、可實現(xiàn)同時檢巧UTPMT基因多個多態(tài)性位點的 檢測引物及其方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測ΤΡΜΤ基因多態(tài)性的引物與方 法，具有不發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測特異性和靈敏度高，準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點，實現(xiàn)了 ΤΡΜΤ 基因3個多態(tài)性位點ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3Β和ΤΡΜΤ基因*3C的同時檢測。本發(fā)明同時檢測 的位點包括ΤΡΜΤ基因巧(NM_000367.3: C. 238G〉C，rsl800462)、TPMT基因*3B(NM_000367.3: C. 460G〉A(chǔ)，rsl800460) W及ΤΡΜΤ 基因*3C(NM_000367.3: C. 719A〉G，rsl 142345)。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測ΤΡΜΤ基因多態(tài)性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR 引物;所述PCR擴增引物包括:針對ΤΡΜΤ基因巧的上游引物5 ' -GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3 ' (沈Q ID N0.1)和下游引物5'-TTCCACACCAACTACACTGT-3'（沈Q ID 側(cè).2)，針對了口]?1'基因* 38的上游引物5'-〇64〔6(：了6(：^41'(：1'1'(：門44-3'（56〇10肋.3)和下游引物5'-CACCTGGATTGATGGCAACTAA -3'（SEQ ID N0.4)W及針對TPMT基因*3C的上游引物5'-AATCCCTGATGTCATTCTTCATAGTATTT-3 '（ SEQ ID NO . 5 )和下游弓| 物 5 '-CATCCATTACATTTTCAGGCTTTAGCATAAT-3'（沈QIDN0.6);所述S化PshotPCR引物包括：針 對TPMT基因*2的SNaPshotPCR引物5'-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3'（SEQIDN0.7)，針對 TPMT基因*3B的SNaPshotPCR引物5'-TTTTTTTTTTGACATGATTTGGGATAGAGGA-3'（SEQID N0.8)，W及針對TPMT基因*3C的SNaPshot PCR 引物5'-TTTTTTTTTTTTTTGAATTGACTGTCTTTTTGAAAAGTTAT-3 '（SEQ ID NO.9)。
[0007]采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的檢測TPMT基因多態(tài)性的引物，可W同時實現(xiàn) TPMT基因3個多態(tài)性位點TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的特異性檢測，不發(fā)生交 叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好。
[000引優(yōu)選地，所述PCR擴增引物中，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物濃 度比為1:1:1;所述SNaPshot PCR引物中，TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C的引物 濃度比為1:1:1。
[0009]相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測TPMT基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟： 51、 提取DNA樣品； 52、 W步驟S1所述的DNA樣本為模板，利用權(quán)利要求域帥所述的PCR擴增引物進行多 重PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行純化，； 53、 W步驟S2所述的純化后的PCR擴增產(chǎn)物為模板，利用權(quán)利要求1或2中所述的 SNaPshot PCR引物進行SNaPshot PCR擴增，并對SNaPshot PCR擴增產(chǎn)物進行純化； 54、 采用毛細管電泳技術(shù)對步驟S3所述的純化后的挪aPshot PCR擴增產(chǎn)物進行檢測， 并對檢測結(jié)果進行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0010 ] 優(yōu)選地，所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[00川優(yōu)選地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應(yīng)條件包括:98°C預(yù)變性3min，98°C變性 10s，58°C退火30s，72°C延伸Imin，進行29個循環(huán)，最后72°C延伸5min，結(jié)束后25°C保溫。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟S3中的挪aPshot PCR擴增反應(yīng)條件包括:96°C變性10s，55°C退 火5s，60°C延伸30s，進行25個循環(huán)，結(jié)束后4°C保溫。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟S4中，采用GE肥MAP陽RID V4.1軟件對檢測結(jié)果進行分析。
[0014] 此外，本發(fā)明還提供檢測TPMT基因多態(tài)性的引物在制備檢測TPMT基因多態(tài)性試劑 中的用途。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提供了一種檢測TPMT基因多態(tài)性 的引物，該引物的特異性好，可同時實現(xiàn)TPMT基因3個多態(tài)性位點TPMT基因巧、TPMT基因*3B 和TPMT基因*3C的特異性檢測，不會發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好，提高了檢測效率。此外，本發(fā) 明還提供了一種檢測TPMT基因多態(tài)性的SNaPshot法，通過使用特異性的PCR擴增引物和 SNaPshot PCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性和精密性好等優(yōu)點，檢測結(jié)果可用于 嚷嶺類化療藥物個體化用藥的臨床指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0016] 圖1本發(fā)明提供的TPMT基因*2、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C引物的部分?jǐn)U增片 段。
[00Π ] 圖2本發(fā)明提供的TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C引物擴增產(chǎn)物的部分 測序圖。
[001引圖3樣品的TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0019] W下內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實施只局限于運些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護化圍。
[0020] 實施例一引物 發(fā)明人針對TPMT基因的3個多態(tài)性位點TPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C，設(shè)計 了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好、不會發(fā)生交叉反應(yīng)且 PCR反應(yīng)條件非常接近的引物。本發(fā)明提供的引物如表1所示，包括PCR擴增引物和挪aPshot PCR引物，PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物是相對應(yīng)的。如針對TPMT基因*2，上游引物為 5 ' -GAAACCCTATGAACCTGAATTC-3 '（SEQ ID NO. 1)，下游引物為5 ' -TTCCACACCAACTACACTGT-3'（沈QIDN0.2)，SNaPshotPCR引物為5'-GTATGATTTTATGCAGGTTT-3'（沈QIDN0.5)。本 發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對，無已知SNP位點。
[0021] 實施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的ΤΡΜΤ基因巧、ΤΡΜΤ基因*3B和ΤΡΜΤ基因*3C引物于UCSC中進行B1 as t，結(jié) 果如下：ΤΡΜΤ基因巧擴增片段位于c虹6:18143923-18144086，長度為164bp; ΤΡΜΤ基因*3B擴 增片段位于chr6: 18139204-18139334，長度為13 lbp;TPMT*3C擴增片段位于chr6: 18130816-18131066dTPMT基因巧、TPMT基因*3B和TPMT基因*3C特異引物的擴增片段及基因 組位置如圖1所示，所有引物的擴增片段均覆蓋了相應(yīng)的檢測位點：TPMT基因巧、TPMT基因* 3B和TPMT基因*3C，無其它同源基因。
[0022] 使用表1中PCR擴增引物分別對檢測樣品DNA進行