基于arms熒光pcr法檢測基因多態(tài)性的通用型熒光發(fā)夾引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于ARMS熒光PCR法檢測基因多 態(tài)性的通用型熒光發(fā)夾引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變?；螯c突變包括 了單核苷酸突變，核苷酸缺失，核苷酸插入等。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指在基因組水平上 由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性?；螯c突變檢測主要方法有PCR-PFLP檢測 技術(shù)、DNA直接測序法、等位基因特異性PCR( AS-PCR)法、Taqman探針法、PCR-焦磷酸測序法 和PCR-芯片法等。PCR-PFLP技術(shù)依賴限制性內(nèi)切酶消化、電泳分析等原因，往往反應(yīng)時間 長，需要反復(fù)開管，容易出現(xiàn)交叉污染和結(jié)果誤判現(xiàn)象，影響其檢測準確率，同時通量較低， 不適用于大量人群和臨檢的快速篩選和臨床診斷。DNA直接測序法雖然是基因檢測金標準， 但是需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作流程以及檢測周期長的特點，大多數(shù)實驗室難以實 現(xiàn)，亦不適合臨床檢驗。PCR-芯片雜交法具有多項優(yōu)點，CFDA已批準多個PCR-芯片雜交法檢 測多態(tài)性試劑盒，然而芯片檢測操作復(fù)雜，對專業(yè)水平要求高，芯片雜交耗時長，靈活度低， 成本高，需要特殊的儀器設(shè)備。PCR-焦磷酸測序法適合各種通量，靈敏度高，但是檢測設(shè)備 昂貴，比較適合于較大樣本、突變比例高于5%的各種類型SNP檢測的確定。等位基因特異性 PCR(AS-PCR)電泳法靈敏度高，但通量低，非常適合小型實驗室檢測，但是因為需要電泳，檢 測時間長，容易出現(xiàn)誤判。Taqman探針法使用熒光探針，靈敏度高，操作簡單，儀器設(shè)備易普 及且適合各種通量，但是熒光探針價格昂貴，且每個SNP位點需設(shè)計兩個等位基因的特異性 探針，研發(fā)階段成本非常高。因此，根據(jù)我國基層醫(yī)院檢測的實際情況，設(shè)計一種靈敏度高， 檢測方法簡便，儀器成本少且適合各種通量的新的檢測基因多態(tài)性的方法尤為迫切。
[0003] ARMS-PCR技術(shù)即擴增受阻突變系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System ARMS-PCR)，又稱為等位基因特異性擴增法(Allele Specific Amplification,AS-PCR)。其基本原理是設(shè)計兩條特異性ARMS引物，引物3'端最后一個堿基分別與野生型或突 變型堿基相同，另外一條是通用型反向引物。在進行PCR反應(yīng)時，由于Taq DNA聚合酶缺少3' -5'外切酶活性，若引物3'端形成錯配，鏈延伸反應(yīng)受阻，在一定擴增循環(huán)內(nèi)，不會檢測出 特異的擴增產(chǎn)物;反之，3 '端配對則能夠檢測出擴增產(chǎn)物。
[0004] 焚光發(fā)夾引物（Fluorescence Hairpin Primer，F(xiàn)HP)，又稱LUX引物（Light-Upon extension引物），是一種5'和3'端具有互補回文結(jié)構(gòu)，并在靠近3'末端的dT堿基上進行熒 光基團單標的引物。這條引物在游離狀態(tài)下可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(莖環(huán)結(jié)構(gòu)），而這種DNA構(gòu)象本 身具有自淬滅熒光基團的特性，不需要在另一端標記淬滅基團。當發(fā)夾引物和模板配對并 在Taq DNA聚合酶作用下PCR產(chǎn)物獲得延伸以后，這個發(fā)夾結(jié)構(gòu)即打開，釋放熒光，導致熒光 信號顯著增加，可以用熒光定量PCR儀進行定量。由于3'端可標記多種熒光基團，因此應(yīng)用 這種發(fā)夾型熒光引物可實現(xiàn)多重熒光PCR。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種基于ARMS熒光PCR法檢測基因多態(tài)性的通用型熒光發(fā)夾 引物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)檢測MTHFR基因多態(tài)性的價格昂貴、周期長、低 效率、數(shù)據(jù)分析繁瑣等不足，提供了一種基于熒光定量PCR技術(shù)平臺，結(jié)合ARMS-PCR和熒光 發(fā)夾引物的基因點突變檢測方法。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于ARMS熒光PCR法檢測基因多態(tài)性的通用 型熒光發(fā)夾引物(FHP引物，圖la)，所述引物包括(Seq ID N〇:l-2):
[0008] 野生型熒光發(fā)夾引物FHPU' -GATCGAGTACCTACCTTGTTCGATC-3'
[0009] 突變型熒光發(fā)夾引物FHP-Mj' -GACTGAGTAGTTCTGCGTCATCAGTC-3'
[0010] 所述通用型熒光發(fā)夾引物的序列長度為26-27bp，且序列與人基因組不同源或不 能完全同源。該引物是一種5'和3'端具有回文結(jié)構(gòu)的引物，具有4-7個堿基的互補序列，可 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且在靠近3'末端dT堿基上進行熒光基團單標。引物在游離狀態(tài)下形成的發(fā) 夾結(jié)構(gòu)的構(gòu)象本身具有自淬滅熒光的特性。由于發(fā)夾熒光引物在PCR過程中易于打開，因此 當引物和模板配對的時候，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開后釋放熒光，導致熒光信號顯著增加，且作為 PCR引物可在Taq酶作用下獲得延伸，產(chǎn)生帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物，可以用熒光定量PCR儀 進行定量。當發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Δ G最佳范圍為-1.6~-5.8kcal/mol，結(jié)構(gòu)易于打開，可與模板互 補配對，獲得最佳熒光淬滅效果。發(fā)夾引物的熔解溫度應(yīng)該在60°C-68°C之間。目前常用的 熒光基團包括FAM、TET、J0E、HEX、AlexaFluor 546、Alexa 594等。優(yōu)選使用熒光基團包括 FAM和HEX。堿基序列通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適 宜方法純化。
[0011]本發(fā)明中，所述ARMS特異性擴增引物是指由一定數(shù)量的dNTPs構(gòu)成的寡核苷酸序 列，通常由DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。在聚 合酶鏈式反應(yīng)中，引物可與待擴增目的核酸鏈上與之互補的區(qū)域結(jié)合，其功能是作為核苷 酸聚合作用的起始點，在引物的3'_0H上，核苷酸以二酯鍵形式進行合成，因此引物的3'-OH 必須是游離的。DNA聚合酶可由其3'端開始進行延伸，合成新的核酸鏈。一般說來，用于識別 基因點突變位置的ARMS特異性擴增引物包括兩條。在引物3'端最后一個堿基分別為識別野 生型或突變型的堿基。
[0012]本發(fā)明還提供含有所述通用型熒光發(fā)夾引物的用于ARMS熒光PCR法檢測基因多態(tài) 性的試劑盒。
[0013] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、K+、TriS-HC1、PCR反應(yīng)緩 沖液等中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明還提供所述通用型熒光發(fā)夾引物、或所述試劑盒在ARMS熒光PCR法檢測基 因多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供基于ARMS熒光PCR法檢須彳基因 MTHFR多態(tài)性的特異性引物，包括正向 引物MTHFR-C677T-W、正向引物MTHFR-C677T-M以及一條反向共用引物，所述正向引物由標 簽序列、特異性引物序列和3'端特異性堿基組成（圖lb)。標簽序列的堿基組成分別與兩條 通用型熒光發(fā)夾引物序列完全和部分相同（至少大于18bp)。特異性引物序列與所擴增基因 點突變位置(MTHFR C677T)上游序列相同，用于特異性識別和結(jié)合基因組DNA。兩條ARMS特 異性引物的3'端特異性堿基分別與野生型堿基和突變型堿基相同，主要用于ARMS-PCR反應(yīng) 中阻礙Taq DNA聚合酶延伸。一條反向共用引物，用于ARMS-PCR擴增，其序列3 '端不能與通 用型熒光發(fā)夾引物和ARMS特異性引物形成互補配對。
[0016] 所述引物包括（Seq ID No:3-5):
[0017] 正向引 物 MTHFR-C677T-W:5'_ GATCGAGTACCTACCTTGTTCGATCGAGAAGGTGTCTGCGGGTGC-3'
[0018] 正向引 物 MTHFR-C677T-M:5'_ GACTGAGTAGTTCTGCGTCATCAGTCGAGAAGGTGTCTGCGGGCGT-3，
[0019 ]反向共用引物R: 5 ' -CAAAGCGGAAGAATGTGTCAG-3，
[0020] 本發(fā)明還提供含有所述特異性引物的用于ARMS熒光PCR法檢測基因 MTHFR多態(tài)性 的試劑盒。
[0021] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括所述通用型熒光發(fā)夾引物(FHP-W和FHP-M)、dNTPs、Taq DNA聚合酶、1% 2+、1(+、1^8-!1(：1、？0?反應(yīng)緩沖液中的至少一種。
[0022]具體而言，試劑盒包括熒光PCR-ARMS反應(yīng)液(Master Mix)和特異性擴增引物混合 液(Primer Mix)。熒光PCR-ARMS反應(yīng)液(Master Mix)包含了PCR反應(yīng)必須的Taq DNA聚合 酶、緩沖液、鎂離子、dNTPs等物質(zhì)外，還包含一對通用型發(fā)夾熒光引物。ARMS引物混合液 (Primer Mix)則包含檢測對應(yīng)基因點突變的正向的野生型和突變型的特異性擴增引物 (MTHFR-C677T-W和MTHFR-C677T-M)、對應(yīng)基因點突變的反向共用引物R。
[0023] 所述試劑盒應(yīng)用的反應(yīng)體系如下：2 XMaster Mix 5μ1，Primer Mix 2μ1，模板DNA l_10ng，ddH2〇 補足至 10μ1。