雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及4個(gè)與雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相 關(guān)的SNP分子標(biāo)記和運(yùn)4個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 母雞受精持續(xù)時(shí)間性狀(一次人工授精后持續(xù)產(chǎn)受精蛋的天數(shù)）的差異直接影響 人工授精的頻率和種公雞的利用率。從而影響經(jīng)濟(jì)效益，是一個(gè)養(yǎng)雞生產(chǎn)中的重要繁殖性 狀。在種雞生產(chǎn)中，人工授精頻率是5天一次，每50只母雞需要配備1只種公雞。如果對(duì)該性 狀進(jìn)行選育，可W減少人工授精的頻率，使人工授精的勞動(dòng)力支出減少。還能使母雞因人工 授精而受到的應(yīng)激大大降低，提高種蛋合格率，減少因人工授精造成的受精率下降。同時(shí)還 能提高種公雞的利用率，減少種公雞的飼養(yǎng)量，節(jié)約成本。但是該性狀度量起來(lái)比較麻煩， 需要單籠飼養(yǎng)、個(gè)體跟蹤及經(jīng)濟(jì)投入大;很少有從遺傳角度對(duì)該性狀的報(bào)道。
[0003] 利用分子育種的手段來(lái)改善母雞的繁殖性狀是降低人工授精頻率及提高種公雞 利用率的有效途徑之一。母雞能夠持續(xù)產(chǎn)受精蛋的生物學(xué)基礎(chǔ)是在母雞子宮和陰道的結(jié)合 部位化VJ)，存在由UVJ組織上皮內(nèi)陷而形成的一種特殊管狀結(jié)構(gòu)組織一膽精管（SST)，SST 具有膽存并維持精子活性的功能。精子在SST中的膽存直接影響到母雞持續(xù)受精時(shí)間。研究 發(fā)現(xiàn)，為了保證精子在SST內(nèi)能夠存活，母雞在基因表達(dá)水平上做了一系列的調(diào)整。而影響 精子在SST中膽存的重要影響因素是SST對(duì)精子的免疫反應(yīng)調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子及其受體基 因在人工受精后的子宮陰道結(jié)合部組織中高效表達(dá)，尤其是TGFB3基因在輸精前后的表達(dá) 水平呈現(xiàn)顯著變化，TGFBs基因家族具有廣泛的生物學(xué)功能，如調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移 等，同時(shí)有報(bào)道其在調(diào)控雌性生殖道細(xì)胞因子的分泌和免疫應(yīng)答反應(yīng)中具有局部免疫抑制 作用。推測(cè)TGFB3基因的表達(dá)會(huì)抑制該處T-細(xì)胞和B-細(xì)胞對(duì)精子的免疫應(yīng)答(精子對(duì)母雞子 宮而言可被視為一種外源物質(zhì)），從而保證精子能夠膽存在SST中（Das,2006)，TGFB3基因可 作為與母雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的候選基因。
[0004] W下工作受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助，項(xiàng)目名稱(chēng)"雞膽精能力差異相關(guān)新基因 的篩選及其分子機(jī)制初探"，項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):31372301。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供4個(gè)與雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的 SNP分子標(biāo)記和運(yùn)4個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型及其應(yīng)用。本發(fā)明運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法尋 找與雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及單倍型，W此作為雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相 關(guān)的SNP分子標(biāo)記及單倍型在標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，其特征在于:所述雞受精持續(xù)時(shí)間 性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是在雞TGFB3 (transforming growth factor-盼）基因的第一內(nèi)含 子中的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的核巧酸序 列是沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或沈Q ID N0:4;
[0009] 所述雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID NO: 1時(shí)，所述SEQ ID NO: 1的核巧酸序列是：
[0010] TCCTCTGCCTCAGGCCAGAACAGCTTGGCTCCCTAGTGCCGGCCCCAGCRTTCGGTGCAAGGCCACAGGTGAGAGGG AGGAGATCCCATACTTTGCTCCA；
[OCm] 所述SEQ ID N0:1的序列中第50位的堿基R是C或T，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0012] 所述雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID N0:2時(shí)，所述SEQ ID NO: 2的核巧酸序列是：
[0013] GGATCCCTCCACCAGCAGAGAAGCCCTGACCCTTCTGCTTAAGTCCCTTRGCAGAGTTGTTCCTCTGACTGTCGCAG TACAGTACAGTTGGTGTTAATCC;
[0014] 所述SEQ ID NO:2的序列中第50位的堿基R是A或G，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0015] 所述雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID N0:3時(shí)，所述SEQ ID NO: 3的核巧酸序列是：
[0016] TTATTGGAAAAGAAATGTTTGCTTTCAGTGTTCCTTTCATCAGCAATTCRGTGGGGACAGTTCCTGGCACCTTTAGC ACAGGTGCTCATCTGGAGTTTGG；
[0017]所述SEQ ID N0:3的序列中第50位的堿基R是T或C，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0018] 所述雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID N0:4時(shí)，所述SEQ ID NO: 4的核巧酸序列是：
[0019] ACCTTTAGCACAGGTGCTCATCTGGAGTTTGGTTGGAACTCTTGGCGTCRGCGGGCAAGATAAGGTCTGGTTCAGGT TTGGAAGCGGTTTCTGGCCATGC；
[0020] 所述SEQ ID N0:4的序列中第50位的堿基R是T或C，導(dǎo)致多態(tài)性。
[0021] 上述的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記構(gòu)成一個(gè)單倍型。
[0022] 上述的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記單獨(dú)或組合使用在雞受精持續(xù)時(shí) 間性狀檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0023] 基于如前所述的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的制備方法，其特征在 于:所述方法包括W下步驟：
[0024] 1)實(shí)驗(yàn)樣品采集；
[0025] 所述實(shí)驗(yàn)樣品是試驗(yàn)雞血樣；
[0026] 2)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀的測(cè)定：
[0027] 測(cè)量一次人工受精后試驗(yàn)雞持續(xù)產(chǎn)受精蛋的天數(shù)，重復(fù)測(cè)量Ξ次，取Ξ次所測(cè)結(jié) 果的平均值，作為該試驗(yàn)雞受精持續(xù)的時(shí)間；
[0028] 3)雞基因組DNA的提取與檢測(cè)：
[0029] 采用苯酪-氯仿法從試驗(yàn)雞血樣中提取雞基因組DNA，再用凝膠電泳判斷DNA的完 整性;對(duì)提取后的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；
[0030] 4)基因型判定及基因型與雞受精持續(xù)時(shí)間的關(guān)聯(lián)分析：
[0031] 將試驗(yàn)雞血樣中提取的基因組DNA，采用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性的方 法，對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行基因型分析，利用SPSS 19統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，將試驗(yàn)雞 受精持續(xù)時(shí)間性狀與TGFB3基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：
[0033] 本發(fā)明運(yùn)用關(guān)聯(lián)分析的方法對(duì)TGFB3基因的進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，并首次 在雞TGFB3基因的第一內(nèi)含子找到雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，該SNP分子標(biāo) 記具體設(shè)及4個(gè)與母雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記和由運(yùn)4個(gè)SNP構(gòu)成的單倍型 定位及應(yīng)用。該SNP分子標(biāo)記由關(guān)聯(lián)分析得到，其核巧酸序列如SEQ ID N0:l-4所示。本發(fā)明 所提供的分子標(biāo)記及單倍型可用于雞受精持續(xù)時(shí)間的分子育種中。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1是本發(fā)明的技術(shù)流程圖；
[0035] 圖2利用化ploview軟件對(duì)SNP進(jìn)行連鎖不平衡分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明提供了一種雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，該雞受精持續(xù)時(shí)間 性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是在雞TGFB3 (transforming growth factor-盼）基因的第一內(nèi)含 子中的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記。
[0037] 本發(fā)明所提供的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的核巧酸序列是SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或沈Q ID N0:4;
[003引當(dāng)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID NO: 1時(shí)，SEQ ID NO: 1的核 巧酸序列是：
[0039] TCCTCTGCCTCAGGCCAGAACAGCTTGGCTCCCTAGTGCCGGCCCCAGCRTTCGGTGCAAGGCCACAGGTGAGAGGG AGGAGATCCCATACTTTGCTCCA；
[0040] SEQ ID NO: 1的序列中第50位的堿基R是C或Τ，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0041 ]當(dāng)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID NO:2時(shí)，SEQ ID NO:2的核 巧酸序列是：
[0042] GGATCCCTCCACCAGCAGAGAAGCCCTGACCCTTCTGCTTAAGTCCCTTRGCAGAGTTGTTCCTCTGACTGTCGCAG TACAGTACAGTTGGTGTTAATCC;
[0043] SEQ ID NO:2的序列中第50位的堿基R是A或G，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0044] 當(dāng)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID NO:3時(shí)，SEQ ID NO:3的核 巧酸序列是：
[0045] TTATTGGAAAAGAAATGTTTGCTTTCAGTGTTCCTTTCATCAGCAATTCRGTGGGGACAGTTCCTGGCACCTTTAGC ACAGGTGCTCATCTGGAGTTTGG；
[0046] SEQ ID N0:3的序列中第50位的堿基R是Τ或C，導(dǎo)致多態(tài)性；
[0047]當(dāng)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是SEQ ID N0:4時(shí)，SEQ ID N0:4的核 巧酸序列是：
[004引 ACCTTTAGCACAGGTGCTCATCTGGAGTTTGGTTGGAACTCTTGGCGTCRGCGGGCAAGATAAGGTCTGGTTCAGGT TTGGAAGCGGTTTCTGGCCATGC；
[0049] SEQ ID N0:4的序列中第50位的堿基R是T或C，導(dǎo)致多態(tài)性。
[0050] 雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記構(gòu)成一個(gè)單倍型。
[0051] 雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記單獨(dú)或組合使用在雞受精持續(xù)時(shí)間性狀 檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0052] 基于如前所述的雞受精持續(xù)時(shí)間性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記的制備方法，該方法包 括W下步驟：
[0053] 1)實(shí)驗(yàn)樣品采集：
[0054] 所述實(shí)驗(yàn)樣品包括試驗(yàn)雞血樣；
[005引2)雞受精持續(xù)時(shí)間性狀的測(cè)定：
[0056]測(cè)量一次人工受精后試驗(yàn)雞持續(xù)產(chǎn)受精蛋的天數(shù)，重復(fù)測(cè)量Ξ次，取Ξ次所測(cè)結(jié) 果的平均值，作為該試驗(yàn)雞受精持續(xù)的時(shí)間；
[0化7] 3)雞基因組DNA的提取與檢測(cè)：
[005引采用苯酪-氯仿法從試驗(yàn)雞血樣中提取雞基因組DNA，再用凝膠電泳判斷DNA的完 整性;對(duì)提取后的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；
[0059] 4)基因型判定及基因型與雞受精持續(xù)時(shí)間的關(guān)聯(lián)分析：
[0060] 將試驗(yàn)雞血樣中提取的基因組DNA，采用PCR和限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性的方 法，對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行基因型分析，利用SPSS 19統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，將試驗(yàn)雞 受精持續(xù)時(shí)間性狀與TGFB3基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
[0061] 下面將結(jié)合附圖圖及圖2對(duì)本發(fā)明所提供的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明：
[00創(chuàng)一、實(shí)驗(yàn)樣品
[0063] 實(shí)驗(yàn)雞群來(lái)自湖北荊州略口有限公司種雞場(chǎng)的652只京紅巧父母代母雞（180d日 齡），單籠飼養(yǎng)，執(zhí)行16:8化：：D)14h光照制度。自由采食、飲水，整個(gè)飼喂方式、飼養(yǎng)條件等 始終保持一致，為常規(guī)方法。
[0064] 二、雞受精持續(xù)時(shí)間的測(cè)定
[0065] 對(duì)母雞進(jìn)行混合精液輸精，記錄一次人工授精后，收集產(chǎn)蛋并記錄每枚蛋的產(chǎn)蛋 日期，每8天入解一次，入解8天后照蛋檢測(cè)受精情況，統(tǒng)計(jì)每只母雞人工授精20天內(nèi)的受精 情況，統(tǒng)計(jì)每只母雞一次人工